Swan-Ganz kateter sağ kalp kateterizasyonu sonra balon ipuçlarını endotel hücre hasat

Özet

Bu iletişim kuralı kaldırma ve süre onlar pulmoner arter sağ kalp kateterizasyonu sırasında sıkışmış kalır Swan-Ganz kateter balon ipuçlarını bağlı pulmoner arter endotel hücreleri (PAECs) arıtma açıklar için yapışık sönük balon kaldırma hastanın vücut takip.

Özet

Patolojiler çeşitli dinlenme 25 mmHg aşan bir ortalama pulmoner arter basıncı olarak tanımlanan pulmoner hipertansiyon (PH), yol açar. Daha fazla tanılamak ve PH yönetmek için neyin Swan-Ganz kateter pulmoner arter dala gelişmiş ve bir balon kateter ucu arasına bir şey koy şişirilir tekrarlanan sağ kalbe katerizasyon (RHC) hasta tabi. Bu makalede sayede pulmoner arter endotel hücreleri (PAECs) olabilir Swan-Ganz kateter balon ipuçları RHC sonra hasat ve sözde PAECs arındırmak için bir anti-CD146 benzeşme sütun tekniği ile saf bir protokol göstermektedir. Bu hücreler hemodinamik ölçümleri RHC sırasında elde edilen tamamlayacak pulmoner damarlara endotel biyolojik durumun yerinde bir anlık görüntü görüntü sağlamak için kullanılan. Hasat ve saf PAECs sonraki analitik deneyleri gibi akışı cytometery veya her iki hücre kültürü için kullanılan.

Giriş

Mevcut ABD ve Avrupa kurallar sağ kalp kateterizasyonu pulmoner hipertansiyon¹tanısı için gerektirir. Doktorlar ve bilim adamları bu hastalığı anlamak isteyen RHC sırasında toplanan hemodinamik veriler tamamlayacak pulmoner damarlara biyolojik örnekleri arzu. Ne yazık ki, pulmoner vasküler biyopsi ile ilişkili risk çok yüksek, ve bu nedenle biyolojik pulmoner damarlara nadiren hiç RHC geçiren yaşam hastalardan elde ettiyseniz örneklerdir. Çok fikir üzerinden elde edilmiştir, ancak pulmoner damar dokusu kadavra üzerinden elde edilen veya explanted akciğerler, bu örnekler bir yaşam hastada unfolding olduğunu PH hastalık süreci biyoloji yansıtmaktadır edemiyoruz. 2013 yılında, biz ilk pulmoner arter endotel hücreleri (PAECs) pulmoner arter dalları Swan-Ganz kateter balon ucu ile fiziksel temas sırasında RHC yalanlarım ve kateter ipuçları küçük rakamlarla kurtarıldı bildirdi yordam sonra².

Bu makale bizim teknik kaldırma ve pulmoner arter endotel hücrelerinin (PAECs) arıtma için sağ kalp kateterizasyonu takip Swan-Ganz kateter balon ipuçları gösterir. Şimdiye kadar bu hasat tekniği gerçekleştirmek için metodoloji yetersiz ayrıntılı teknik gerçekleştirme laboratuvarlar arasında tek tip sonuçlar sağlamak için edebiyat olarak tarif edilmiştir. Bu makale kateter ipuçları nihai ürün arıtılmış CD146 + endotel hücre için başucu koleksiyonundan tekniği, görüntülenmeyecektir gösteri sunan bu eksikliği aşmak için hazırlanmıştır. Bu teknik pH çeşitli etiologies pathobiology araştırma ilerleyen yardım ve muhtemelen hemodinamik veriler RHC sırasında toplanan tamamlayacak yeni tanı testleri geliştirme neden.

Bu teknik pulmoner vasküler ilaç ve araştırma alanında için önem taşımaktadır explanted veya kadavra akciğerler üzerinde bir anlık görüntüsünü pulmoner endotel in situ ve aksine önceki çalışmalar biyoloji erişim sağlar, değil temsil etmiyor konunun akciğer için bir son nokta. Son zamanlarda, biz bu hücrelerde bir anti-apoptotik biyomarker daha doğrusu fenotipleme yararı olabilir göstermiştir pulmoner hipertansiyon³çeşitleri ile ilgili. Elde edilen hücre verimidir nispeten küçük ~ 5, 000-25.000 PAECs örnek başına ve bu hücreler (zor ama imkansız değil) kültür için. Zeki klinisyenler ve araştırmacılar pulmoner vasküler araştırma, tanılama ve prognostics ilerlemek için bu arkadaşı teknikleri arasında sinerji bulmak inanıyoruz.

Protokol

Bu makalede açıklanan tüm çalışmaları Allegheny sağlık ağının kurumsal İnceleme Kurulu tarafından kabul edildi. Tüm hasta onam yatıştırıcı ajanlar, yönetimi daha önce sağlanan ve çalışma numarası atanmış tarafından de-tespit edilmiştir.

1. başucu koleksiyonu

Not: Bu iletişim kuralı her şeyi buza, önceden soğutulmuş çözümleri kullanarak yapılmalıdır. Onların yerinde biyolojik fenotip korumak için hücrelerdeki soğuk Staz ikna etmek önemlidir. Bu iletişim kuralı kan ve insanlardan elde hücreleri taşıma içerir ve bu nedenle evrensel önlemler dikkat edilmelidir.

1. Kateter kılıf dan çekilme sonra hemen kateter 40 mL soğuk steril serum fizyolojik içeren bir 50 mL santrifüj tüp sokmak. Kateter kan kaldırmak ve satır satır içinde muhafaza kan kaldırmak gerekirse floş için birkaç kez girdap.
2. Distal 5 cm kateter ucu kesilmiş ve soğutulmuş tuz içeren 50 mL santrifüj tüpüne düşmesini sağlar. Hemen ve endotel hücre (EC) büyüme orta 15 mL içeren 15 mL santrifüj tüpü transfer kateter ucu forseps ile çıkarın.
3. Tüp mühür, buza koyun ve işleme veya sevkiyat için hazırlamak için laboratuvar aktarın. Balon ortamda dalmış kalır önemlidir, böylece en az headspace 15 mL tüp EC büyüme ortamı ile tamamen doldurarak emin olun.
4. İşlem ilerleme-e doğru adım 2.1 veya mühür ve gemi gecede işleme bu protokol için yetenekli bir Laboratuvarı için ıslak buz üzerinde örnek tarafından hemen örnek. Hücreleri hücre kültürü için kullanılacak sonuçta Eğer, öyle kateter ucu toplanma aynı sitede hemen işlenebilir önerilir.

2. hücre hasat

Not: Bu iletişim kuralı her şeyi buza, önceden soğutulmuş çözümleri kullanarak yapılmalıdır. Soğuk koma halinde hücrelerdir ve kadar sabit veya kültürlü hazır onları uyanış önlemek önemlidir. Tüm bu iletişim kuralı bir laminar akış başlık, nihai niyet hasat PAECs kültürünün ise steril aletler kullanarak yapılmalıdır. Eğer kültür değil planlanmış (örneğin, Akış Sitometresi Analizi), steril önlemler gözlemlemek için gerekli değildir.

1. Hücre dekolmanı çözümü 5 mL 15 mL santrifüj tüpü ekleyin; Buza koyun.
2. 1 mL EC medya bu başucu toplama tüp 1 mL şırınga kalan üzerinden çizin.
3. Hızlı adımları 2.3 2.5 ile tamamlayın. Kavrama kateter ucu hemostats ile kesim sonu.
4. Dikkatle 1 mL şırınga iğne kılavuz tel ("kara delik") karşısında "beyaz" deliğe yerleştirin. İğne ile yaralanmayı önlemek için çok dikkat edin.
5. Kateter ucu hücre dekolmanı solüsyon içeren 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
6. Patlamış değil dikkatli olmak balon şişirmek; yaklaşık 200 µL medya ile balon şişirme iyi çalışıyor.
7. Kateter ile şişirilmiş balon buz 5 min için hücre dekolmanı çözümde oturmak izin. Balon, kendi 5 dk kuluçka sırasında söner, kabul edilebilir bu.
8. 15 mL santrifüj tüpü içeriğini 100 mm çanak içine dökün. Balon hücre dekolmanı çözümü "su birikintisi" yer.
9. Şişirilmiş balon bir hücre sıyırıcı kazı. Hücre kazıyıcı çevresinde dairesel bir hareket veya bir fırçalama hareket balonunda çizilebilir. Üzerinde balon, "Polonyalılar" kateter buluştuğu odaklan. Hücre kazıyıcı balon tüm yüzeyine en az iki kez rehber olun. Hücre kazıyıcı hücre dekolmanı çözümü "su birikintisi" düzenli olarak yıkayın.
10. Balonu deflate ve fırçalama hareketlerle kazıyorum. Hücre kazıyıcı hücre dekolmanı çözümü "su birikintisi" durulayın.
11. Kateter ucu, iğne ve hücre kazıyıcı uygun atık konteyner atın.
12. Hücre hasat içine 50 mL santrifüj tüpü içeren hücre dekolmanı solüsyonu dökün. Toplama tüp sallamak ve kalan medya toplama tüp de toplanan örnek dökün.
13. 650 x g 10 dk 4 ° C'de örnek santrifüj kapasitesi. Oftentimes bir Pelet değil görülecektir unutmamak gerekir. Nerede bir Pelet gördüm, görünüyorsa, görülecek çok küçük olması durumunda Pelet aspirating önlemek için işaretlemek yararlı olabilir.
    Not: Normalde, örnek kanla kontamine olmuştur zaman bir Pelet yalnızca görülür. Kan kirlenme son hasat ürün için önemsiz çünkü kan CD146 boncuk bağlamak başarısız olur ve içinde sütun yıkar. Kapsamlı test 1.5 mL microcentrifuge tüpler Malzemeler tablo başvurulan belirli marka Protokolü en iyileştirme sırasında kullanılan diğer tüpler göreli hücre kaybı en aza indirir göstermiştir.
14. Dikkatli bir şekilde medya Aspire edin ve rahatsız edici veya pelet aspirating kaçının.

3. hücre arıtma

Not: Bu iletişim kuralı her şeyi buza, önceden soğutulmuş çözümleri kullanarak yapılmalıdır. Soğuk koma halinde hücrelerdir ve kadar sabit veya kültürlü hazır onları uyanış önlemek önemlidir.

1. Pelet 1 mL soğutulmuş kırmızı kan hücre lizis çözümü resuspend ve 1.5 mL microfuge tüp transferi; yavaşça rock 4 ° C'de 10 dakika
2. 500 g ve 4 ° c x 5 dk santrifüj RBC lizis çözüm Aspire edin.
3. Pelet PBS, 20 μL FcR engelleyici ve anti-insan CD146 lastikteki 20 μL 60 μL resuspend. 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
4. Soğutulmuş PBS 1 mL ekleyin. 500 g ve 4 ° c x 5 dk santrifüj Süpernatant Aspire edin ve Pelet soğutulmuş PBS 1 mL resuspend.
5. Manyetik bir LS sütun bir manyetik raf yerleştirin ( Tablo malzemeleri için bu öğelerin belirli ticari kimlik görmek) Oda sıcaklığında. PBS 1 mL ekleyerek sütun Başbakan ve birimin tümü akışı izin vermek. Akışı aracılığıyla atın.
6. Örnek manyetik sütuna getirin. Akışı aracılığıyla atın.
7. Sütun 3 mL soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Akış yoluyla her yıkama üzerinden atmak.
8. Soğutulmuş PBS 3 mL 15 mL santrifüj tüpü ekleyin. Mıknatıs manyetik sütun kaldırmak, PBS 3 mL 15 mL santrifüj tüp sütunun dökün ve hızlı bir şekilde sütun akış yoluyla yakalamak için santrifüj tüpü yerleştirin. Hemen sütun ile sağlanan pistonu ile dalma. Şimdi arıtılmış, hazır fiksasyon/boyama veya kültür örneğidir.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı hücrelerden bir CD146 seçim sütuna bağlamak ve kültürlü birincil insan akciğer ayırt edilemez ileri/yan dağılım profilleri Swan-Ganz kateter ipuçları sağ kalp kateterizasyonu sonra arıtma sonuçlanır damar endotel hücreleri (Şekil 1). Kateter balon sadece uygulayıcıya Kılıf (bir boş hücre malzeme), pulmoner arter damar duvarı ile fiziksel temas ve kan, veri burada bu hücreler kandan (Şekil 2) elde edilen değil göstermek için sağlanmıştır verilen , ve bu nedenle bu gerçekten pulmoner arter damar duvarından elde edilen varsayılır. Okuyucu hücreleri arındırmak için kullanılan anti-CD146 manyetik boncuklar kalmasını dikkat etmelisiniz sonra prosedür ve böylece hücre yüzeyine yapışık hücre hasat için CD146 endotel hücreleri bir işareti olarak analiz etme girişiminde suboptimal. CD31 veya diğer endotel işaretleri muhtemelen etiketleme için kullanılabilir olacaktır ve alternatif olarak düşünülebilir.

Bu protokolün temel unsuru tespit edilmiştir sonuçları etkileyebilir. İlk olarak, kateter ucu kan kaldırmak için başucunda durulama önemlidir. Şekil 3 yan dağılım (SSC) gösterir / ileri dağılım (FSC) profilleri akışı aracılığıyla anti-CD146 sütundan bir örnek için bu düzgün durulanır ve bu değildi. Hasat (Şekil 2) kan kaynaklı hücreleri dışlamak için sütunu görünür ancak durulama adım endotel hücreleri dolaşan üzerinden en az olası bulaşma sağlayacaktır (normalde mevcut olan < 50 hücre/mL kan⁴). Bu eluate tamamen açık, hatta çok kanlı kateter ucu örnekleri söz konusu olduğunda sütundur CD146 üzerinden gözlemledim. Bu sütun tıkanma veya sigara istinat kan önemli miktarda ele almak mümkün olduğunu göstermektedir-CD146 + içermediği hücreleri.

İkinci olarak, en az bir kez hücre dekolmanı çözüm/hücre kazıyıcı adımı sırasında ipucu balonu şişirmek önemlidir. Verilen bu sözde PAECs üzerinde ipucu yapisan karşın serum fizyolojik durulama adım, muhtemel görünüyor kalır hastanın kaldırılması için hazırlık sönük gibi kısmen vinil balon kıvrımlar tarafından tuzağa. Muhtemelen, enflasyon adım onları uzağa yavaşça alıntı için izin PAECs, serbest bırakır. Biri bu hipotezi test ama hücre düşük verimleri ne zaman balon (şişirilmiş verileri gösterilmez) değil gözlenmiştir hemen açık değildir.

Son olarak, bu yöntem türetilmiş PAECs verimi önemli ölçüde değişebilir unutmamak gerekir. İletişim kuralı kaynak malzeme büyük kaybına neden beklenir adımları verilmediği muhtemelen, hasta-, hastalık durumu ve hekim özel faktörler Bu değişkenliği için katkıda bulunur. Tablo 1 CD146 + PAEC hasat kateter ipuçları çeşitli farklı hastalık durumlarında pulmoner hipertansiyon hastalarının elde edilen kullanan çeşitli ve hekim operatörleri çeşitli verimleri temsilcisi gösterir.

Resim 1 : SSC/FSC profilleri tipik kateter balon ipucu hasat pulmoner hipertansiyon hasta (A) ve birincil insan PAEC ticari olarak alınan hücrelerden benzer bir dizi Kültür (B). Her iki örnekler anti-CD146 sütun ile saf, sabit ve iletişim kuralı FACS analiz önce açıklandığı gibi permeablized. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : SSC/FSC profilleri bir tipik kateter balon ipucu hasat pulmoner hipertansiyondan hasta (A) ve seri 1:10 seyreltme Ficoll degrade saf insan buffy ceket (B, C, D). (A) ise anti-CD146 sütun ile saf (B-D) değildi. Tüm hücre örnekleri sabit ve iletişim kuralı FACS analiz önce açıklandığı gibi permeablized. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : SSC/FSC profilleri bir kateter balon ipucu hasat--dan hangi kan pulmoner hipertansiyonlu hastada kateter ucu işleme önce görünür oldu. Adım 3.1 Protokolü'nün önce örnek bölünmüş oldu ve lizis tampon için bir aliquot eklendi ve diğer bırakmamıştı. (A)ve (CSSC/FSC profilleri sütun (A) ve akış yoluyla sütun tarafından tutulan her iki hücre lysed örnek göster). (B) ve (SSC/FSC profilleri sütun (B) ve (D) sütundaki üzerinden akışı tarafından tutulan her iki hücre unlysed örnek göster:D). Biz sonucuna lizis bazı kaldırır ama hepsi değil lökosit ama o lökosit sütun tarafından korunmaz ve dolayısıyla lizis ne olursa olsun son hasat dışarıda bırakılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Örnek	Tarihi	Hücre verim	Tanı
433	4/17/2018	7364	PH-interstisyel akciğer hastalığı
279	4/17/2018	7130	PH-Skleroderma
432	4/13/2018	3976	PH-multifaktöriyel
431	4/13/2018	3634	HFrEF
390	4/13/2018	5666	PAH
423	3/23/2018	9024	HFrEF
272	3/23/2018	7098	HFrEF
408	2/27/2018	4784	HFrEF
403	2/14/2018	10376	PH-ASD + mitral hastalığı
396	1/26/2018	4890	HFpEF-IPCPH
397	1/26/2018	7672	Normal hemodinami
318	1/4/2018	7002	HFrEF-LVAD mevcut

Tablo 1: CD146 + PAEC hasat çeşitli verimleri. Temsilcisi CD146 + PAEC hasat kateter ipuçları çeşitli farklı hastalık durumlarında pulmoner hipertansiyon hastalarının elde edilen kullanan çeşitli ve hekim operatörleri çeşitli verir.

Tartışmalar

Bu makalede açıklanan tekniği en iyi pulmoner vasküler endotel çalışmak için önceki deneysel paradigmalar çerçevesinde beğeni topluyor. PAECs insanlardan elde etmek için önceki girişimleri explanted/kadavra akciğerler⁵ ve kısa ömürlü bir girişim bir kateter pulmoner arter biyopsisi⁶/ yetenekli geliştirmek için sınırlı olmuştur. Bir Son İnceleme⁷' de belirtildiği gibi mevcut teknik PAECs yaşayan bir insan edinmek ve bunu birden fazla zaman noktalarda hastalık ve/veya tedavi ilerleme yapmak için onun yetenek tarafından akciğer doku hasat ayırt edilir. Ancak, bir arkadaşı teknik son zamanlarda indüklenen sayede pluripotent kök hücreler (IPSCs) transdifferentiated PAECs^4,5içine olabilir bildirilmiştir ki unutulmamalıdır. Bu teknik hastaya özgü PAECs bol kültürleri üretir ve hastaya özgü genetik arka plan efektleri PAEC biyoloji üzerinde bir çalışma sağlar. Bu avantajlara rağmen bu IPSC kaynaklı PAECs yerel microenvironment ve hastaya özgü genetik arka plan arasındaki etkileşimi hakkında herhangi bir bilgi sunamıyoruz. Kendi grubu "kateter ucu" ve IPSC teknikleri alan⁸ilerleyen sinerjik olması muhtemeldir görünüm sunmuştur.

Bu mevcut ve tarihsel bağlamda, bu teknik sınırlamaları olması gerekmektedir. İlk olarak, bu yöntem türetilmiş PAECs verimi önemli ölçüde değişebilir unutmamak gerekir. İletişim kuralı kaynak malzeme büyük kaybına neden beklenir adımları verilmediği muhtemelen, hasta-, hastalık durumu ve hekim özel faktörler Bu değişkenliği için katkıda bulunur. Tablo 1 CD146 + PAEC hasat kateter ipuçları çeşitli farklı hastalık durumlarında pulmoner hipertansiyon hastalarının elde edilen kullanan çeşitli ve hekim operatörleri çeşitli verimleri temsilcisi gösterir. İkinci olarak, hücre verimleri genel düşük olan ve canlılığı kültür için daha düşük henüz bizim ellerde olduğu ispatlanmıştır. Biz daha önce bu yöntem¹kullanılarak PAECs kültürleri büyüdü, biz örnek çoğunun die-off takip progenitör hücre alt grubunu bu sonuçları temsil kurtarma varsayalım ve sadece bizim ellerde zaman zaman başarılı olur. Örneğin, yalnızca birkaç düzine yapışık PAECs kültüründe bir hasat kaplama sonra sabah bulmak anormal değildir. Sık sık bu mikro-kültürler genişleme için sağ çıkamayız. Daha fazla çalışma PAECs canlılığı sürdürmek bir şekilde bu protokolü ve durumları kültür hastaya özgü PAEC hasat yayılması istenen amacı elde etmek için en iyi duruma getirmek için gereklidir. Son olarak, biz adapte olması CD146 pozitif seçim hücrelerle endotel hücreleri⁴, perisitlerden, düz kas hücreleri ve nadir CD146 + T hücreleri^9,10dolaşan gibi diğer CD146 +, kirlenme dışlayamazsınız. Yine de, bu hücreler çok az sayıda bu şekilde toplanan örneklerinde olduğu kabul ve CD146 bu iletişim kuralı için önemli ölçüde daha diğer hücre işaretleri (aynı zamanda kan kaynaklı çeşitli üzerinde CD31 gibi endotel hücrelerinin daha belirlidir hücreleri) trombosit¹¹de dahil olmak üzere. Özgüllük iyileştirme amaçlı herhangi bir gelecekteki iyileştirmeler verim üzerindeki olası olumsuz etkileri karşı dengeli olmalıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Fisher	NC9385690
15 mL Centrifuge Tubes	Midsci	C15R
16% Formaldehyde	Fisher	PI28908
50 mL centrifuge tubes	Midsci	C50R
Accutase	Thermo	A1110501	cell detachment solution
Cell Scraper	Fisher	08-100-241
Endothelial Cell Growth media	Cell Applications	211-500
Forceps	any
Hemostat	any
LoBind microfuge tube	Fisher	13-698-794
Miltenyi CD146 beads	Miltenyi	130-093-596
Miltenyi FCR blocker	Miltenyi	130-059-901
Miltenyi LS columns	Miltenyi	130-042-401
Miltenyi magnet	Miltenyi	MidiMACS
Miltenyi RBC lysis buffer	Miltenyi	130-094-183
PBS	Fisher	BP2438-4
Scissors	any
Syringes	BD	309597