오른쪽 심장 도관 법 후 백조 Ganz 카 테 터의 풍선 팁에서 내 피 세포의 수확

요약

이 프로토콜에 설명 합니다 제거 하 고 그들은 바로 심장 도관 법 동안에 폐 동맥 쐐기는 하는 동안 남아 백조 Ganz 카 테 터의 풍선 도움말에는 폐 동맥 내 피 세포 (PAECs)의 정화 부착 하는 deflated 풍선 환자의 몸에서 제거 다음.

초록

병 리의 다양 한 휴식 25 mmHg를 초과 하는 평균 폐 동맥 압력으로 정의 되는 폐 고혈압 (PH), 이끌어 낸다. 추가 진단 하 고 산도 관리, 환자는 반복된 오른쪽 심장 catheterizations를 (RHC) 어떤 점에서 백조 Ganz 카 테 테 르 폐 동맥의 분기에 고급 및 풍선 카 테 터 팁 쐐기 비정상적 받 다. 이 문서에서는 그것에 의하여 폐 동맥 내 피 세포 (PAECs) 후 RHC, 백조 Ganz 카 테 터의 풍선 팁에서 수확 될 수 있으며 기술로 안티 CD146 선호도 열 putative PAECs 정화 정화 프로토콜을 보여 줍니다. 이 세포는 RHC 동안 얻은 hemodynamic 측정을 보완 하기 위해 폐 맥 관 구조 endothelium의 생물 학적 상태의 원래의 장소에 스냅을 제공 하기 위해 사용할 수 있습니다. 수확 하 고 어느 세포 배양 또는 흐름 cytometery 등 후속 분석 분석 실험에 대 한 정화 PAECs을 사용할 수 있습니다.

서문

현재 미국 및 유럽 지침¹폐 고혈압 진단에 대 한 오른쪽 심장 도관 법을 요구 한다. 의사와 과학자 들이이 질병을 이해 하고자 하는 욕망 RHC 동안 수집 된 hemodynamic 데이터를 보완 하기 위해 폐 맥 관 구조에서 생물 학적 샘플. 불행 하 게도, 폐 혈관 생 검과 관련 된 위험이 매우 높은 이며 따라서 폐 맥 관 구조의 생물 학적 샘플은 거의 적 RHC 환자 생활에서에서 얻은 경우. 많은 인 사이트를 얻고 동안 시체에서 얻은 폐 혈관 조직 또는 explanted 폐, 이러한 샘플은 살아있는 환자에 펼쳐지고 PH 질병 과정의 생물학 반영 수 없습니다. 2013 년, 우리가 처음 보고 그 폐 동맥 내 피 세포 (PAECs) RHC, 동안 백조 Ganz 카 테 테 르의 풍선 팁과 신체 접촉에 의해 폐 동맥의 지점에서 걸치기는 그리고 카 테 터 팁에서 작은 숫자에서 복구할 수 있습니다. 후 절차².

이 문서에서는 보여 줍니다 우리의 제거 및 폐 동맥 내 피 세포 (PAECs)의 정화에 대 한 오른쪽 심장 도관 법을 따라 백조 Ganz 카 테 터의 풍선 도움말에서. 지금까지,이 수확 기법을 수행 하기 위한 방법론 기법을 수행 하는 실험실 사이 결과 보장 하기 위해 문학에 부족 한 자세하게에서 설명 하고있다. 이 문서는 순화 CD146 + 내 피 세포의 최종 제품을 카 테 터 팁의 머리 맡 컬렉션에서 제공 하는 기술, 시각화 된 데모가이 결핍을 극복 하기 위한 것. 이 기술은 고 PH의 다양 한 etiologies의 pathobiology로 연구 발전에 도움이 한다 hemodynamic 데이터 RHC 동안 수집을 보완 하기 위해 새로운 진단 분석 실험의 개발에서 발생할.

폐 혈관 의학 및 연구 분야에이 기술의 중요성은 그것 explanted 또는 시체 폐에 폐 endothelium 및 이전 연구와 달리 현장에서의 생물학의 스냅숏으로 액세스를 제공 합니다, 대표 하지 않는다 폐에 대 한 끝점입니다. 최근에, 우리는 이러한 셀에는 안티-apoptotic biomarker 형질 보다 정확 하 게 유용 있을 수 있습니다 나타났습니다 관련 다양 한 폐 고혈압³. 얻은 셀의 수익률은 상대적으로 작고, ~ 5, 000 25000 PAECs 샘플, 당 고이 세포는 어려운 (불가능 하지만) 문화. 우리는 영리한 임상의 학자 및 연구원은 폐 혈관 연구, 진단, prognostics 전진 하기 위하여 이러한 동반자 기술 간의 시너지 효과 발견할 것 이다 믿는다.

프로토콜

이 문서에서 설명 하는 모든 연구는 앨 리 건강 네트워크의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 모든 환자 진정 제 에이전트의 관리 하기 전에 동의 제공 하 고 취소 연구 번호가 할당 되 고에 의해 확인 되었다.

1. 침대 컬렉션

참고: 이 프로토콜의 모든 할 수에 얼음, 미리 냉장된 솔루션을 사용 하 여. 그것은 그들의 원래의 생물 학적 표현 형을 유지 하기 위해 셀에 차가운 스테이 시스를 유도 하는 것이 중요입니다. 이 프로토콜 혈액과 인간에서 얻은 셀의 처리를 포함 하 고 따라서 보편적인 주의 관찰 해야 합니다.

1. 칼 집에서 카 테 터의 철수, 후 즉시 냉장된 멸 균 식 염 수의 40 mL를 포함 50 mL 원심 분리기 튜브에서 카 테 터를 담가. 혈액을 제거 하 고 라인 내에 유지 하는 혈액을 제거 하는 데 필요한 경우 라인을 플러시를 여러 번 카 테 터를 소용돌이 친다.
2. 캐서린 팁의 원심 5 cm에서 잘라내어 냉장된 염 분을 포함 하는 50 mL 원심 분리기 튜브에 빠지다 수 있습니다. 즉시 집게와 캐서린 팁을 제거 하 고 내 피 세포 (EC) 성장 매체의 15 mL를 포함 하는 15 mL 원심 분리기 튜브에 전송.
3. 튜브를 봉인 하 고 얼음에 배치 처리 또는 배송에 대 한 준비를 실험실에 전송. 그것은 풍선 매체에 열 중 하 게 유지 중요 한, 그래서 EC 성장 매체와 그것을 완전 하 게 작성 하 여 15 mL 튜브에 최소한의 headspace는 다는 것을 확인.
4. 샘플 단계 2.1 또는 인감 및 선박 연구소이 프로토콜에 숙련 된 처리를 위해 밤새 젖은 얼음에 샘플 진행에 의해 즉시 처리 합니다. 세포는 궁극적으로 세포 배양에 사용할 경우, 그것은 캐서린 팁 수집 된 같은 사이트에서 즉시 처리 될 것이 좋습니다.

2. 셀 수확

참고: 이 프로토콜의 모든 할 수에 얼음, 미리 냉장된 솔루션을 사용 하 여. 셀 냉 혈 행에 있고 고정 또는 경작에 준비가 될 때까지 그들을 각 성 하지 않도록 하는 것이 중요 하다. 이 전체 프로토콜 층 흐름 후드, 궁극적인 의도 수확된 PAECs의 문화 불 임 악기를 사용 하 여 수행 되어야 한다. 문화를 계획 하는 경우 (예를 들어, cytometry 분석 흐름), 불 임 예방 조치를 관찰할 필요는 없습니다.

1. 15 mL 원심 분리기 튜브; 세포 분리 솔루션의 5 mL을 추가 얼음에 놓습니다.
2. 그 1 mL 주사기로 침대 컬렉션 튜브에 남아에서 EC 미디어의 1 mL를 그립니다.
3. 신속 하 게 단계 2.3 2.5 통해 완료 합니다. Hemostats 카 테 터 끝의 커트 끝을 잡습니다.
4. 조심 스럽게 가이드 와이어 (이 하 "블랙 홀") 반대 "흰색" 구멍에 1 mL 주사기의 바늘을 삽입 합니다. 바늘 부상을 피하기 위해 주의 걸릴.
5. 포함 하는 셀 분리 솔루션 15 mL 원심 분리기 관으로 캐서린 팁을 전송 합니다.
6. 폭발 하지 않도록 주의 되 고 풍선을 부 풀 려 미디어의 약 200 µ L 함께 풍선을 팽창 작용 한다.
7. 팽창 된 풍선으로 5 분 동안 얼음에 세포 분리 솔루션에 앉아 카 테 터를 허용 합니다. 풍선 5 분 외피 동안에 그것의 자신의 deflates, 만약이 허용 됩니다.
8. 100 mm 접시에 15 mL 원심 분리기 튜브의 내용을 붓는 다. 풍선 세포 분리 솔루션 "물 웅덩이"에 놓습니다.
9. 셀 스 크레이 퍼로 팽창한 풍선을 다쳤어요. 셀 스 크레이 퍼는 원형 모션 또는 솔 질 움직임에 풍선 주위 그릴 수 있습니다. 그것은 카 테 터를 만나는 풍선의 "기둥"에 초점. 셀 스 크레이 퍼 풍선의 표면 전체를 두 번 이상 연결을 확인 합니다. 주기적으로 세포 분리 솔루션 "물 웅덩이"에 셀 스 크레이 퍼를 헹 굴.
10. 폐의 풍선 그리고 솔 질 움직임으로 그것을 긁어. 세포 분리 솔루션 "물 웅덩이"에 셀 스 크레이 퍼를 씻어.
11. 캐서린 팁, 바늘 및 셀 스 크레이 퍼 적절 한 폐기물 컨테이너를 삭제 합니다.
12. 세포 분리 솔루션 50 mL 원심 분리기 관으로 셀 수확을 포함 하 거 라. 컬렉션 튜브를 흔들어 하 고 컬렉션 튜브에서 나머지 미디어 뿐만 아니라 수집 된 샘플으로 부 어.
13. 10 분 동안 4 ° C에서 650 x g 에서 샘플 원심 그것은 중요는 자주 펠 릿 볼 수 없습니다. 그것은 위치 표시 하는 있는 펠 릿을 볼 것 이다, 그것은 너무 작은 볼 수 경우에 펠 릿을 발음 하지 않으려면 표시 되는 경우 유용할 수 있습니다.
    참고: 일반적으로, 펠 릿은 샘플 혈액으로 오염 된 경우에 표시 됩니다. 혈액 오염 혈액 CD146 구슬 바인딩할 실패 하 고 열을 통해 세척 때문에 궁극적인 수확 제품에 중요 하지 않습니다. 광범위 한 테스트는 1.5 mL microcentrifuge 튜브 재료의 테이블에서 에서 참조의 특정 브랜드 프로토콜 최적화 하는 동안 활용 하는 다른 튜브를 기준으로 셀 손실을 최소화 하는 것을 입증 했다.
14. 신중 하 게 미디어, 발음 하 고 방해 또는 펠 릿을 발음 하지 마십시오.

3. 세포 정화

참고: 이 프로토콜의 모든 할 수에 얼음, 미리 냉장된 솔루션을 사용 하 여. 셀 냉 혈 행에 있고 고정 또는 경작에 준비가 될 때까지 그들을 각 성 하지 않도록 하는 것이 중요 하다.

1. 냉장된 적혈구 세포 솔루션의 1 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 1.5 mL microfuge 관;에 전송 4 ° c.에서 10 분 동안 부드럽게 바위
2. G 와 4 ° C x 500에서 5 분 동안 원심 분리기 RBC 세포 솔루션 발음
3. PBS, FcR 차단기의 20 μ와 반대로 인간 CD146 microbeads의 20 μ의 60 μ에 펠 릿을 resuspend. 4 ° c.에 15 분 동안 품 어
4. 냉장된 PBS의 1 mL를 추가 합니다. G 와 4 ° C x 500에서 5 분 동안 원심 분리기 발음은 상쾌한 고 냉장된 PBS의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
5. 마그네틱 LS 열 자석 선반에 두십시오 (이 항목의 특정 상업 id 테이블의 자료 를 참조) 실내 온도에. PBS의 1 mL을 추가 하 여 열을 총리 하 고 전체 볼륨을 통해 흐름을 허용 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다.
6. 자석 열에 샘플을 놓습니다. 흐름을 통해 삭제 합니다.
7. 씻어 냉장된 PBS의 3 mL 열 세 번. 각 세척에서 흐름 통해 삭제 합니다.
8. 15 mL 원심 분리기 튜브를 냉장된 PBS의 3 mL를 추가 합니다. 자석에서 자기 열을 제거 하 고 열에 15 mL 원심 분리기 튜브에서 PBS의 3 mL를 붓고 신속 하 게 원심 분리기 튜브를 통해 흐름 잡기에 열을 배치. 바로 열으로 공급 하는 플런저와 함께 찔 러. 이 예제는 이제 정화, 준비에 대 한 고정/얼룩, 또는 문화.

결과

이 프로토콜 결과 셀, CD146 선택 열을 바인딩할 하 고 교양된 기본 인간 폐 구별 되지 않은 프로필을 앞 으로/사이드 분산형 오른쪽 심장 도관 법, 후 백조 Ganz 카 테 터 팁에서의 정화 동맥 내 피 세포 (그림 1). 풍선 카 테 터는 물리적 접촉만 중개자 칼 집 (한 셀 소재), 폐 동맥 혈관 벽에에서와 여기에 제공 되 혈액, 데이터는이 세포는 혈액 (그림 2)에서 파생 되지 않는 설명 하 따라서 그것은 그들이 실제로 폐 동맥 혈관 벽에서 파생 된 가정 하 고. 독자는 세포를 정화 하는 데 사용 되는 안티-CD146 자석 구슬 유지 주의 한다 절차, 그리고 따라서 그것 후 세포 표면에 부착은 내 피 세포의 표식으로 CD146에 대 한 셀 수확을 분석 하려고 차선. CD31 또는 다른 내 피 마커 라벨 아마도 가능할 것 이다 고 대 안으로 간주 될 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 요소 확인 되었습니다 그 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 첫째, 그것은 혈액을 제거 하기 위해 머리 맡에 카 테 터 팁을 씻어 하는 것이 중요입니다. 그림 3 은 측면 살포 (SSC) / 안티-CD146 열에서 흐름 통해의 앞으로 분산형 (FSC) 프로필 하나를 샘플에 대 한은 제대로 씻어 서 그리고 하나는 아니었다. 열 수확 (그림 2)에서 혈액 파생 셀 제외 나타나지만 헹 구는 단계 순환 내 피 세포에서 최소한의 가능한 오염 보장 한다 (일반적으로 현재에 < 50 셀/mL 혈액⁴). 우리는 열이 완전히 취소, 심지어 매우 살 벌 한 카 테 터 팁 샘플의 경우 CD146에서 그 eluate 관찰. 이것은 열이 막힘 또는 유지 비 없이 상당한 양의 혈액을 처리할 수-CD146 + bloodborne 셀.

둘째, 그것은 셀 분리 솔루션/셀 스 크레이 퍼 단계 동안 적어도 한 번 풍선 팁을 급증 하는 것이 중요입니다. 주어진 그 풍선 끝에 상 상속 PAECs 부착에 염 분 린스 단계, 그것은 가능성이 보인다 그들은 갇혀 수 있습니다 수 부분적으로 비닐 풍선에 겹에 의해 환자 로부터 제거를 위한 준비에 deflated은으로. 아마도, 인플레이션 단계 떨어져 긁어 부드럽게 수 있도록 PAECs를 해제 합니다. 하나는이 가설을 테스트할 수 있지만 셀의 낮은 수율 관찰 되었습니다 때 풍선 데이터를 하지 않습니다 비정상적 (표시 되지 않음)에 즉시 명확 하지 않습니다.

마지막으로, 그것은 중요이 방법에서 파생 된 PAECs의 수확량 상당히 달라질 수 있습니다. 아마도, 환자-질병 상태와 의사 관련 요인에 기여이 가변성 프로토콜 소스 재료의 주요 손실이 발생할 것으로 예상 될 것 이라고 하는 단계를 포함 하지 않습니다. 표 1 CD146 + PAEC 수확 다양 한 폐 고혈압의 다른 질병 상태를 가진 환자에서에서 얻은 카 테 터 팁을 활용 하 여 다양 한 및 다양 한 의사 연산자에서 생성 하는 대표를 보여준다.

그림 1 : 폐 동맥 고혈압 환자 (A)와 상업적으로 취득 기본 인간의 PAEC에서 셀의 유사한 수에서 일반 카 테 테 르 풍선 팁 수확의 SSC/FSC 프로필 문화 (B). 두 샘플 안티-CD146 열과 정화, 고정 되었고 permeablized FACS 분석 하기 전에 프로토콜에 설명 된 대로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 일반 카 테 테 르 풍선의 SSC/FSC 프로필 팁 폐 고혈압에서 수확 환자 (A) 및 직렬 1시 10분 희석 Ficoll 그라데이션 정화 인간의 버 피 코트 (B, C, D)의. (A) 반면 안티-CD146 열 순화 되었다 (B-D) 되지 않았습니다. 모든 셀 샘플 고정 되었고 permeablized FACS 분석 하기 전에 프로토콜에 설명 된 대로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 :는 혈액에서 폐 고혈압 환자에서 카 테 테 르 풍선 팁 수확의 SSC/FSC 프로필 처리 전에 카 테 터 끝에 보이는 했다. 프로토콜의 3.1 단계 이전의 샘플은 분리 하 고 세포의 용 해 버퍼 한 약 수에 추가 되었고 다른 보류. (A)와 (C) 두 셀 (A) 열과 열에서 흐름 통해 의해 유지 lysed 샘플의 SSC/FSC 프로필 표시. (B)와 (D) 열 (B)와 (D) 열에서 흐름 통해 유지 모두 셀에 unlysed 샘플의 SSC/FSC의 프로필 보기. 우리 결론 세포 일부를 제거 하지만 그 백혈구는 백혈구의 모든 열에 의해 유지 되지 않습니다 및 따라서 세포에 최종 수확에서 제외 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

샘플	날짜	셀 항복	진단
433	4/17/2018	7364	PH-간 질 성 폐 질환
279	4/17/2018	7130	PH-Scleroderma
432	4/13/2018	3976	PH Multifactorial
431	4/13/2018	3634	HFrEF
390	4/13/2018	5666	PAH
423	3/23/2018	9024	HFrEF
272	3/23/2018	7098	HFrEF
408	2/27/2018	4784	HFrEF
403	2/14/2018	10376	PH-ASD + mitral 질병
396	1/26/2018	4890	HFpEF-IPCPH
397	1/26/2018	7672	일반 hemodynamics
318	1/4/2018	7002	HFrEF-LVAD 존재

표 1: CD146 + PAEC 수확의 다양 한에서 수익률. 대표 CD146 + PAEC 수확 다양 한 폐 고혈압의 다른 질병 상태를 가진 환자에서에서 얻은 카 테 터 팁을 활용 하 여 다양 한 및 다양 한 의사 연산자에서 생성 됩니다.

토론

이 문서에서 설명 하는 기술은 가장 폐 혈관 내 피 공부에 대 한 이전 실험 패러다임의 맥락에서 감사 합니다. 인간에서 PAECs를 이전 시도 explanted 싱가포르로 폐⁵ 및 폐 동맥 생 검⁶수 카 테 터를 개발 하는 짧은 시도 되었습니다. ⁷최근 리뷰 설명 했 듯이, 현재의 기술 능력을 인간 생활에서 PAECs 그리고 질병 치료의 진행에 여러 개의 시간 지점에서 이렇게 하 여 폐 조직 수확에서 구별 된다. 그러나, 그것은 그 동반자 기술 최근 보고 되었습니다 면 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) PAECs^4,5에 transdifferentiated 수 주목 해야한다. 이 기술은 환자 특정 PAECs의 풍부한 문화를 생성 하 고 PAEC 생물학에 환자 특정 유전 배경 효과의 연구를 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구 하 고 이러한 IPSC 파생 된 PAECs 지역 microenvironment 및 환자 관련 유전 배경 사이의 상호 작용에 대 한 정보를 제공할 수 없습니다. 우리 자신의 그룹 보기 "캐서린 팁" 기술과 IPSC는 필드⁸에 상승 될 것을 제시 했다.

이 존재 하 고 역사적 컨텍스트 내에서이 기술의 한계를 지적 한다. 첫째, 그것은 중요이 방법에서 파생 된 PAECs의 수확량 상당히 달라질 수 있습니다. 아마도, 환자-질병 상태와 의사 관련 요인에 기여이 가변성 프로토콜 소스 재료의 주요 손실이 발생할 것으로 예상 될 것 이라고 하는 단계를 포함 하지 않습니다. 표 1 CD146 + PAEC 수확 다양 한 폐 고혈압의 다른 질병 상태를 가진 환자에서에서 얻은 카 테 터 팁을 활용 하 여 다양 한 및 다양 한 의사 연산자에서 생성 하는 대표를 보여준다. 둘째, 셀 수익률이 전반적인 낮은, 그리고 문화에 대 한 그들의 생존 낮은 아직 우리의 손에 있는 것을 입증 했다. 우리는 이전이 방법¹을 사용 하 여 PAECs의 문화를 성장 하 고, 하는 동안 우리 다음 죽는 샘플의 대부분의 조상 세포의 부분 집합의 그 결과 대표 구조 가정 이며만 간헐적으로 우리의 손에 성공. 예를 들어 아침 수확을 도금 후 문화에만 몇 다스 부착 PAECs을 찾을 수 드문 아니다. 종종 이러한 마이크로-문화 확장에 생존 하지 않습니다. 추가 작업은 PAECs의 생존 능력을 유지 하는 방식으로이 프로토콜 및 환자 관련 PAEC 수확의 전파의 원하는 목표를 달성 하는 문화에 그들의 조건 최적화 필요 합니다. 마지막으로, 우리가 적응 해야 CD146 긍정적인 선택 다른 CD146 + 세포, 내 피 세포⁴, pericytes, 부드러운 근육 세포 및 희소 한 CD146 + T 세포^9,10순환 등 오염을 제외할 수 없습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 세포에 이러한 방식으로 수집 된 샘플 수에 거의 것으로 추정 되 고 CD146는 상당히이 프로토콜에 대 한 보다 구체적인 다른 셀 표식 CD31 (이 또한 혈액을 매개로 다양 한에와 같은 내 피 세포의 셀 혈소판¹¹를 포함 하 여)입니다. 특이성을 개선 하기 위한 모든 미래 향상 수확량에 그들의 잠재적으로 부정적인 영향에 대 한 균형을 해야 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Fisher	NC9385690
15 mL Centrifuge Tubes	Midsci	C15R
16% Formaldehyde	Fisher	PI28908
50 mL centrifuge tubes	Midsci	C50R
Accutase	Thermo	A1110501	cell detachment solution
Cell Scraper	Fisher	08-100-241
Endothelial Cell Growth media	Cell Applications	211-500
Forceps	any
Hemostat	any
LoBind microfuge tube	Fisher	13-698-794
Miltenyi CD146 beads	Miltenyi	130-093-596
Miltenyi FCR blocker	Miltenyi	130-059-901
Miltenyi LS columns	Miltenyi	130-042-401
Miltenyi magnet	Miltenyi	MidiMACS
Miltenyi RBC lysis buffer	Miltenyi	130-094-183
PBS	Fisher	BP2438-4
Scissors	any
Syringes	BD	309597