JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים הגנום הנדסה זרימת עבודה עבור הדור של הדגמים החדשים במבחנה להידבקות ב- HIV-1 זה מסכם את הדברים proviral אינטגרציה באתרים גנומית שנבחרו. פילוח של עיתונאים HIV-derived בהנחייתם של מניפולציה הגנום CRISPR Cas9-בתיווך, הספציפיות-לאתר. פרוטוקולים מפורט דור שיבוט תא בודד, הקרנה של אימות המטרה הנכונה הינם מסופקים.

Abstract

וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) משלב ה-DNA שלו proviral שאינה אקראית לתוך הגנום התא המארח-חוזרים ונשנים אתרים ונקודות גנומית. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדור של הרומן מודלים במבחנה הידבקות ב- HIV עם אתרי אינטגרציה הגנומי שבחרת באמצעות טכנולוגיית ההנדסה הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9. בשיטה זו, כתב רצף של הבחירה שניתן לשלב לוקוס גנומית יישוב, שבחרת, המשקף הרלוונטית קלינית שילוב אתרים.

בפרוטוקול, מתוארים העיצוב של הכתב HIV-derived ובחירה של רצף באתר, gRNA היעד. וקטור מיקוד בזרועות הומולוגיה נבנה, transfected לתוך תאי Jurkat T. הרצף כתב לאוכלוסייה אתר גנומית שנבחר על ידי רקומבינציה הומולוגית בהנחייתם של הפסקה כפולה-strand בתיווך Cas9 באתר היעד. תא בודד שיבוטים שנוצר, הוקרן הכוונת האירועים על ידי cytometry זרימה ו- PCR. שיבוטים שנבחרו ואז מורחבות, פילוח נכון מאומתת על ידי ה-PCR, רצף סופג הדרומי. ניתוח אירועים פוטנציאליים את המטרה של הגנום CRISPR Cas9-בתיווך הנדסה.

באמצעות פרוטוקול, מערכות התרבות התא הרומן הזה ניתן להפיק את הידבקות ב- HIV דגם באתרים אינטגרציה הרלוונטית קלינית. למרות הדור של תא בודד שיבוטים ואימות של שילוב רצף כתב הנכונה היא גוזלת זמן, הקווים המשובטים וכתוצאה מכך הם כלים רבי-עוצמה לנתח באופן פונקציונלי אינטגרציה proviral אתר הבחירה.

Introduction

שילוב של proviral ה-DNA הגנום המארח בעת זיהום הוא שלב קריטי במחזור החיים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV). בעקבות שילוב, HIV נמשכת על-ידי יצירת השהיה של קבוצות משנה תאי CD4 + T חיים ארוכים כגון זיכרון CD4 + T תאים. HIV שילוב שנראה שאינן אקראיות1,2. מספר נקודות חמות גנומית עם ה-DNA proviral משולב שהדו-שיח זוהתה במספר מחקרים באמצעות הרצף של שילוב אתרים אנשים נגועים בחריפות, באופן כרוני2,3,4 ,5,-6,-7,-8. מעניין, על שילוב אתרים מסויימים, מיקומה באותו זוהה שבר גדול של תאים נגועים, שמוביל הרעיון כי אינטגרציה באתרים חוזרים ונשנים עלול להשפיע באופן חיובי משובט הרחבה1.

כדי לקדם את ההבנה שלנו של המשמעות של שילוב חוזר ונשנה אתרים, שילוב proviral אתר הבחירה חייב להיחקר. עם זאת, מספר היבטים טכניים ה"בלתי אינטגרציה HIV לימוד באתר הבחירה ואת ההשלכות. בשימוש רחב תא תרבות מודלים של השהיה HIV, כמו שורות תאים JLat אינן משקפות את שילוב חוזר ונשנה הרלוונטית קלינית אתרי9. מחקרים על תאים נגזר החולה הראשי, מצד אחד, מאפשרים תיאור של שילוב האתר נוף על ידי רצף אך אינם מאפשרים ניתוחים פונקציונליים. ידיעתנו אין דגם ניסיוני נאותה זמין לנתח אתרים נבחרים הרלוונטית קלינית אינטגרציה פונקציונלית.

כאן אנו מציגים נתונים היסטוריים זרימת עבודה כדי ליצור מודלים חדשניים הידבקות ב- HIV באמצעות טכנולוגיית ההנדסה הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9. זרימת העבודה המתוארת במסמך זה יכול לשמש כדי ליצור קווים תא תא T-derived כתב דגם הידבקות ב- HIV, נושא כתב proviral genomically משולב באתר שבחרת שילוב. הם משרתים וכך גם כלים חדשים לחקור איך האתר אינטגרציה proviral יכולים להשפיע ביולוגיה HIV ואת איך provirus מגיבה אסטרטגיות טיפול שונה (למשל, inducibility על ידי סוכנים היפוך השהיה). השיטה שלנו משתמשת את היתרונות של הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי הנדסה, בשילוב אשר כתב רצף מאת רקומבינציה הומולוגית בהנחייתם של Cas9 הנוצרות על-ידי נוקלאז כפול-strand הפסקה באתר היעד. אתרי היעד עבור שילוב נבחרו על פי קרבה לאתרים שילוב חוזר ונשנה שתואר ממחקרים על אנשים נגועים ב- HIV ואת נוכחותם של מוטיבים מתאימים פאם הגנום בתיווך Cas9 הנדסה.

התוצאות המופת שלנו, אנחנו התמקדו מיקומה ג'ין BACH2, אשר הקודים המתקן תעתיק BTB ו CNC הומולוגיה 2. אצל אנשים באופן כרוני נגוע ב- HIV על טיפול תרופתי, BACH2 הוא אחד לוקוסים מציג העשרה משולב HIV-1 רצפים של3,6,7,8,10. בחרנו עיתונאי HIV-derived מינימלי של HIV-1-derived זמן מסוף חוזר (משמאל לימין), רצף קידוד tdTomato, הורמון גדילה (BGH) הסימן פוליאדנילציה (PA), אשר בוחר לשני אתרים ספציפיים באינטרון BACH2 5. פרוטוקול הציג ממוטב Jurkat תאים, אנושי CD4 + תא T-derived ההשעיה תא קו, אבל תא שני קווים עשוי לשמש, פרוטוקול הותאם בהתאם. אנו מציגים זרימת עבודה מפורט באתר היעד, בניית היעד וקטור בזרועות הומולוגיה, CRISPR Cas9-בתיווך פילוח של הכתב לתוך האתר גנומית שבחרת, הדור ואת הבחירה של קווי המשובטים, ומקיף מבחר אימות של שורות תאים הכתב החדש שנוצר, ממוקד.

Protocol

1. אסטרטגיה מכוונת הגנום הנדסה והיעדים עיצוב וקטור (טלוויזיה)

הערה: הצעד הראשון של הגנום הנדסה כרוך בחירה ויצירת הכלים הדרושים עבור CRISPR Cas9-בתיווך מיקוד. מבחר של לוקוס באתר אינטגרציה הגנומי, בחירה של סוג התא הכוונת, ועיצוב כתב HIV-derived לשילוב צריך להקדים שלב זה. פרוטוקול זה מתאר פילוח של הכתב מינימלי HIV-LTR_tdTomato_BGH-הרשות הפלסטינית לתוך תאי היעד Jurkat. תרשים זרימה של זרימת העבודה עבור המבוססות על CRISPR-Cas9 מיקוד, דור, סינון ואימות של קווים המשובטים מתואר באיור1. אסטרטגיית מיקוד שתואר משתמשת את Cas9 הפישחה ינפל תומימת ס (SpCas9) ליצירת מעברי dsDNA ביים gRNA באתר אינטגרציה שנבחרו. הכתב ממוקד מכן לתוך מיקומה גנומית שבחרת לעבור רקומבינציה הומולוגית על-ידי מתן שאינם לליניארית מיקוד וקטור (טלוויזיה) המכיל את רצף כתב ולצדו כביכול 5' ו 3' הומולוגיה זרועות (HA)11.

  1. הבחירה של לוקוס יישוב, gRNA, מיקוד וקטור עיצוב
    1. לבחור לוקוס thegenomic כדי להיות ממוקד בהתבסס על השאלה המדעית בודדים. שימוש שפורסמו ברשימות של אתרים שילוב חוזר ונשנה של HIV שנמצאו חולים שונים מחקרים2,3,4,5,6,7,8 בתור קו מנחה. אין סיליקו לחלץ את רצף גנומית של מיקומה גנומית הרצוי להיות יישוב (רצף הגן המלא) או לפחות 5 kb של רצף גנומית באמצעות דפדפן הגנום UCSC (http:// genome.edu.ucsc.edu).
    2. לבחור מורה RNAs (gRNAs) של 20 nt עבור פילוח של מיקומה גנומית שבחרת באמצעות את webtool E-פריך (http://www.e-crisp.org).
      1. בחר "הומו ספיינס GRCh38" האורגניזם. Bp קלט 2000 של רצף גנומית כיסוי מיקומה גנומית הרצוי שחולצו בשלב 1.1.1.
      2. התחל חיפוש gRNA באמצעות הגדרות יישום בינוני (כל פאם, כל 5' הבסיסי, את המטרות לסבול אי-התאמות ולאחר אינטרונים/CPG האיים אינם נכללים). רשימה עם עיצובים אפשריים gRNA יופיע, הדירוג הגבוהה לנמוכה כדי להוריד את הציונים של ירידה לפרטים ויעילות.
      3. בחר gRNA רצוי מראה ניקוד גבוה עבור ירידה לפרטים ויעילות, הוא הכי קרוב ככל האפשר אל מיקומה גנומית הרצוי כדי להיות ממוקד.
        הערה: פשרה בין קרבה מיקומה גנומית הרצוי עיצוב ספציפי ויעיל gRNA חייב להימצא.
    3. הפיצוץ הרצף gRNA שבחרת נגד הגנום הפניה באמצעות דפדפן הפיצוץ NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) כדי לבדוק על ייחודו של אתר איגוד gRNA.
      1. בחר "אנושי" כמו הגנום. קלט את רצף gRNA כמו הרצף שאילתה. בחר "רצפים דומים מאוד" (megablast) כתוכנית. ודא כי הרצף gRNA הוא ייחודי. אם לא, בחרה gRNA שונים של שלב 1.1.2.3 ו הפיצוץ שוב.
    4. ברגע gRNA רצף נבחר, בחר סיליקו 1,000 bp ויוצאת רצף gRNA רצף גנומית שחולצו בשלב 1.1.1 5' ו 3' HA בהתאם.
      הערה: GRNAs צריך להיות הומולוגי כדי אינטגרציה הגנומי שבחרת באתר מיקומה, ממוקם מוטיב סמוך protospacer (פאם; למשל, הגולה עבור SpCas9) (איור 2 א). הטלוויזיה מכיל את הרצף כתב כי הוא 5' 3' ולצדו משמשת. יש כיסוי 1000 bp ויוצאת רצף gRNA11. הרצף המלא gRNA לא להיכלל HA. חפיפה בין עד 5 nt זו קביל (איור 2 א).
  2. דור של gRNA ומיקוד וקטורים
    הערה: לקבלת ערכות וקטור, ראה איור 2b.
    1. כדי להפיק וקטור להבעה של SpCas9, gRNA, השתמש את pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 כעמוד השדרה שממנו הן SpCas9 והן את המדריך יחיד RNA (sgRNA) יכול בו זמנית להתבטא. לשבט את רצף gRNA לתוך עמוד השדרה, השתמש את אתרי הגבלת BbsI12.
    2. כדי להפיק את הטלוויזיה, בחרו ' פלסמיד גבוהה-העתק של עמוד השדרה (למשל pMK, או cDNA3.1).
      1. ראשית, להרכיב הכתב (ב פרוטוקול זה: LTR_tdTomato_BGH-PA) לתוך עמוד השדרה לבנות על ידי הרכבה גיבסון clong13 באמצעות אסיפה מסחרי שיבוט קיט, ו להציג 5' ו 3' איגוף באתרים מגבלת (למשל, 5' פאצי, 3' מרק פורטנוי) עבור הגבלת עוקבות עיכול שיבוט של משמשת.
      2. להגביר את לחץ הדם 1000 של השברים HA שבחרת בשלב 1.1.4 מ- DNA גנומי (gDNA) סוג התא כדי להיות ממוקד (ב פרוטוקול זה: תאים Jurkat) באמצעות של ה-DNA פולימראז עם הגהה פעילות (ראה טבלאות 1 ו- 2 המרכיבים PCR ו רכיבה על אופניים תנאים). לאחר מכן, מציגים את הכתב איגוף אתרי ההגבלה על הקצוות 5' ו 3' של כל HA (פאצי על 5' HA בשני הקצוות, מרק פורטנוי ב- 3' HA משני הכיוונים).
      3. ברצף שיבוט יש לתוך לבנות את עמוד השדרה כבר המכילה הכתב (נוצר בשלב 1.2.2.1) על-ידי אנזים הגבלה שכפול14,15. לשבט. תחילה, בעוד 5 דקות HA משתמש באתרים מגבלת פאצי, ואז לשכפל ב 3' HA בשימוש באתרים מגבלת מרק פורטנוי.
        הערה: אם הטלוויזיה עמוד השדרה מכיל כתב פלורסנט נוספים של, עמוד השדרה לא רצוי שילוב יכול להיות מוערך על ידי cytometry זרימה (ראה שלבים 3.2.2 ו 3.2.3). אם הטלוויזיה עמוד השדרה מכיל שום כתבת פלורסנט, אינטגרציה המרכזי (backbone) חייב להיות מוערך באמצעות PCR (ראה שלב 3.2.8).

figure-protocol-5258
איור 1: זרימת עבודה עבור CRISPR Cas9-בתיווך מיקוד הדור, מבחר של הכתב המשובטים קווים עם שילוב מוגדר אתר. (א) יצירת וקטור היעד, מגלי Jurkat T תאים עם היעד וקטור, Cas9/gRNA ביטוי פלסמיד. Enrich (B) התאים transfected 72 h פוסט תרביות תאים על-ידי FACS. התאים גדלים 10 עד 14 ימים לאשר את המופע של פילוח אירועים לפי ה-PCR ו flow cytometry. תן (C). (ד) ליצור שיבוטים תא בודד על-ידי הגבלת שיבוטים דילול ולתת לגדול במשך שלושה שבועות. (E) מסך השיבוטים עבור מטרות נכונה לפי ה-PCR, לזרום cytometry בתבנית 96-ובכן. הרחב שיבוטים שנבחרו. אימות (F) הנכון פילוח שיבוטים שנבחרו על ידי תספיג דנ א, PCR, רצף, וניתוח אירועים המטרה של Cas9 endonuclease פעילות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-protocol-6307
איור 2: פילוח אסטרטגיה ותכנון וקטור. gRNA (), בחירה של הזרועות הומולוגיה. 20 nt gRNA הומולוגי לאתר היעד שבחרת גנומית, ממוקם בסמוך הומולוגיה PAM. הזרועות הינם משלים למעלה bp 1,000 - במורד הזרם של gRNA ואין לכלול את רצף gRNA. (b) השרטוטים של מיקוד וקטוריים וגם וקטור gRNA/Cas9. הווקטור מיקוד מורכבת רצף כתב שבחרת הוא 5' ו 3' ולצדו הזרועות הומולוגיה. וקטור gRNA/Cas9 מבוסס על עמוד השדרה pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9. (ג) תיאור סכמטי של פילוח על-ידי רקומבינציה הומולוגית. וקטור היעד ו- guideRNA/Cas9 וקטור transfected לתאים Jurkat. Cas9 שמתווכת הפסקה גדיל כפול באתר היעד גנומית (שצוין על-ידי *) ומקל רקומבינציה הומולוגית ושילוב של הכתב רצף לתוך מיקומה היעד גנומית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. CRISPR-Cas9-פילוח המבוסס על תאים Jurkat

  1. תרביות תאים של תאי Jurkat
    1. 24 שעןת לפני תרביות תאים, צלחת 1.25 x 106 Jurkat T תאים ב- 2.5 מ של RPMI 1640 שיושלם עם 10% (v/v) עגל עוברית סרום (FCS) ו- 4 מ מגלוטמין [המכונה "אנטיביוטיקה w.o. RPMI (אלב)"] לכל טוב של צלחת התרבות תאים 6-. טוב. עבור ניסוי מיקוד יחיד, להכין לוח 6-ובכן מלאה אחד (דהיינו, 6 בארות כל אחד עם 2.5 מ של התא השעיה).
    2. למחרת, שיתוף transfect התאים עם מעגלי טלוויזיה, pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA שימוש ספציפי ריאגנט של תרביות תאים עבור תאים Jurkat.
      1. להוסיף µg 2 של הטלוויזיה מעגלית, 2 µg של pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA לכל טוב 250 µL בינוני RPMI מסחרי עם ריכוז מופחת סרום אופטימיזציה עבור תרביות תאים (RPMI עם 50% ירידה בסרום) התגובה שפופרת, לערבב היטב.
      2. להוסיף µL 12 של תרביות תאים מגיב באיטיות למדיום/DNA בלי לגעת בקיר של הצינור, מערבולת. תן את התערובת תקופת דגירה של 15 דקות ולהוסיף dropwise באר אחת של תאים. דגירה התאים-CO 37 ° C ו-5%2.
        הערה: ניתן לשנות את הכנת תקנים התגובה. אין שינוי בינוני נדרש לאחר תרביות תאים.
  2. העשרה של transfected תאים על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS)
    1. 72 h שלאחר תרביות תאים, בריכה תאי transfected, לספור אותם, ולהתכונן העשרה על ידי FACS. איסוף התאים צינור חרוטי 50 מ ל, צנטריפוגה 300 x g ובטמפרטורת החדר (RT) במשך 4 דקות, לשטוף את התאים פעם ב- PBS, צנטריפוגה שוב, להשעות את צניפה בסכום המתאים FACS מאגר (PBS בתוספת FCS 1% + 1 מ"מ EDTA)-עונה 1 פרק 10 7 תאים למ"ל, ולהעביר סוף סוף לתוך צינור FACS.
    2. נושא את התאים FACS ומיין אלה אקספרס הכתבת פלורסנט של הטלוויזיה (למשל, tdTomato ב פרוטוקול זה). איסוף התאים RPMI 1640 בתוספת 10% FCS, 4 מ מגלוטמין, ו 50 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין (המכונה "RPMI w / AB").
    3. לאחר FACS מיון, לשטוף את התאים פעם אחת על-ידי הוספת 20 מ של RPMI w / AB תאים ממוינים, centrifuge ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב- RT. Resuspend בגדר תא בסכום המתאים של RPMI w / AB, צלחת התאים אחד טוב של צלחת התרבות תאים עם נפח המתאים על פי תא מספר פוסט-FACS.
      הערה: תרבות למיין את התאים באמצעי אחסון קטן (למשל, 24-טוב), כאשר רמות ניכר של מוות של תאים נצפו בשבוע הראשון שלאחר מיקוד (עד 80-90%).
    4. הרחב את האוכלוסייה לתא יישוב מעורב עד צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל בקבוקון תרבות תא 75 cm ². זה ייקח סביב 10-14 ימים פוסט-FACS מיון.
  3. אישור על מטרות אירועים לפי cytometry זרימה באוכלוסייה לתא יישוב מעורב
    1. אחרי 10-14 ימים של התרחבות (כאשר תאים מיצית צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל בקבוקון 75 ס מ2 תא תרבות), צלחת שתי בארות עם עונה 1 פרק 106 תאים של מעורבות לפלח אוכלוסייה תא ב 1 מ"ל של RPMI w / AB בתרבות 12-ובכן תא צלחת.
    2. זירוז את LTR HIV של הכתב (דור של טלוויזיה מתואר בשלב 1.2.2.1.) באחת הבארות על-ידי הוספת 50 ננוגרם למ"ל phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) ו 1 מיקרומטר Ionomycin (המכונה PMA-Iono). השתמש תאים בתוך הבאר השנייה של הפקד-induced. תרבות של המושרה והן את התאים הלא-induced עבור 24 שעות.
    3. לקחת 0.5 mL התליית תא הלא-induced המושרה תאים (כל אחד), לרחוץ אותם פעם אחת ב- PBS, וכן להשעות כל µL 200 FACS המאגר.
    4. לנתח 100,000 תאים על-ידי cytometry זרימה. שער של יחיד-התאים קיימא בהתבסס על גודל פיזור קדימה, sideward, ולנתח על ביטוי גנים כתב פלורסנט.
      הערה: בשלב זה 10-14 ימים (מיון פוסט-FACS), ביטוי ארעית של פלורסנט כתב על ידי תרביות תאים צריך לא להיות יותר לזיהוי. הביטוי פלורסנט בנקודת זמן זו מצביעה על אינטגרציה הגנומי של הכתב רצף.
  4. איתור מיקוד אירועים לפי ה-PCR על הדנ א של האוכלוסייה לתא יישוב מעורב
    הערה: לאתר מיקוד אירועים באמצעות PCR, עיצוב שני זוגות פריימר ספציפי עבור אינטגרציה (int.) צומת 5' ו- int. צומת 3'. עבור 5' int. לצומת ה-PCR צריך לאגד פריימר לפנים נגד הזרם של 5' HA, ומהצמיגים הפוכה ב LTR של הכתב (תחל P1 ו- P2 ב איור 3a). הזוג פריימר עבור int. צומת 3' ה-PCR ישתרע מהרשות הפלשתינית של הכתב ל bp 100-200 במורד הזרם של 3' HA (primers P3 ו- P4 ב איור 3a). תחל P1 ו- P4 ישמש גם עבור הגברה של אלל שאינו ממוקד באוכלוסייה יישוב מעורב. לקבלת מפרטים טכניים, ראה איור 3 א.
    1. להכין gDNA מ- 2 מ של התא השעיה של האוכלוסייה לתא יישוב מעורב משלב 2.2.4. להשתמש ערכת חילוץ gDNA לפי הפרוטוקול של היצרן. אז הכינו את gDNA של תאים שאינם במיקוד כפקד.
    2. לבצע int. צומת מותני (primers P1/P2, P3/P4 עבור 5' ו- 3' int. בצומת, בהתאמה) ושימוש אלל שאינן ממוקדות PCR (primers P1/P4) אמינות גבוהה DNA פולימראז (ראה טבלאות 3 ו- 4 עבור מרכיבים PCR ותנאי הרכיבה) . ניתוח µL 5 מוצרי ה-PCR על ג'ל agarose/טה 1.5%.
      הערה: אם האוכלוסייה יישוב מעורב מכיל תאים שעברו הנדסה הגנום, PCR למוצר להתייחס זה לא לזיהוי ב gDNA של תאים שאינם ממוקדות (בקרה שלילית). עבור שאינן ממוקדות אלל PCR, אחד צריך להתבונן מוצר בגודל זהה עבור שניהם יישוב שאינן ממוקדות התאים ו (חיובי פקד עבור תחל P1 ו- P4 גנומית). אם הם נצפו להקות, לשקול את שינוי תנאי הרכיבה PCR על ידי הגדלת מספר מחזורים או לשנות את מאגר ה-PCR (למשל באמצעות תוספת של דימתיל סולפוקסיד או כמויות גדולות יותר של Mg2 +), או על-ידי שינוי של פולימראז.

3. הדור של קווים המשובטים הקרנה עבור פילוח נכון

הערה: לאחר אישור של האירועים מיקוד באוכלוסייה לתא יישוב מעורב על ידי cytometry זרימה ו- PCR (סעיפים 2.2-2.4), ליצור שיבוטים תא בודד (משך: 28 עד 35 ימים) ומסך לשילוב הנכון של הרצף הכתב.

  1. הדור של תא בודד שיבוטים באמצעות דילול יופיצ
    1. להכין בינוני ממוזגים Jurkat מראש: תוריד RPMI w / AB בינוני של תאי Jurkat T בריא, שאינו מטופל גדל עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 300 גרם, ולסנן את תגובת שיקוע באמצעות יחידת מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
      הערה: לשמור על המדיום ממוזגים ב 4 ° C לאחסון לטווח קצר או ב-20 ° C לאחסון ארוך יותר משבוע. להכין 20-30 מ של מדיום ממוזגים לפני ציפוי דילול.
    2. לספור את התאים יישוב מהשלב 2.2.4 אחרי 10-14 ימים של התרחבות, לדלל אותם ב- RPMI w / AB כדי ריכוז עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל.... קח 100 µL של עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל פתרון, לדלל עם 9.9 מ של המדיום כדי להשיג ריכוז של תאים למ"ל 1,000. קח 1 מ"ל של 1,000 תאים למ"ל פתרון, לדלל עם 9 מ של המדיום כדי להשיג ריכוז של תאים למ"ל 100.
    3. צלחת 96-ובכן פלטות המכילות 1 התא לכל טוב ותאים 2 לכל טוב. עבור תא 1 לכל טוב, לקחת 1 מ"ל של 100 תאים למ"ל פתרון ומערבבים בעדינות עם 5 מ של מדיום ממוזגים, 4 מיליליטר בינוני טריים מאגר ריאגנט סטרילי.
    4. עבור תאים 2 לכל טוב, לקחת 2 מ ל 100 תאים למ"ל פתרון ומערבבים בעדינות עם 5 מ של מדיום ממוזגים, 3 מ"ל של מדיום טריים. צלחת 96-ובכן עגול-לוחות עם 100 µL של דילול תאים המתאימים לכל שימוש טוב של pipet רב-ערוצי.
      הערה: 5 כדי 10 צלחות 96-ובכן לפי פילוח לבנות מספיקים להשיג שיבוטים להקרנה.
    5. מחסנית הלוחות 96-ובכן, לכסות על כל ערימה עם צלחת 6-ובכן המכיל 3 מ"ל של PBS היטב כל ולאחר תקופת דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה התרבות תאים humidified עם 5% CO2 של 3 שבועות.
      הערה: אינם משתנים המדיום התרבות התא במהלך תקופה זו. אל תפתח החממה יותר מאשר פעם אחת או פעמיים בשבוע. התוצאות הטובות ביותר הם נצפו חממות עם מאגר מים פתוחים.
    6. לאחר 3 שבועות של אינקובציה, חזותית לאשר הנוכחות של מבוגר מושבות באמצעות מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה) ולסמן הבארות עם מושבות מבוגר אז הן גלויות כנקודות על החלק התחתון של הבארות.
    7. להכין צלחת אחת 96-ובכן עגול-התחתון עם µL 100 של RPMI w / AB לכל טוב. Resuspend בעדינות תאים של מסומן היטב על ידי pipetting. העברת 100 µL תא השעיה לבאר אחת של צלחת 96-ובכן החדש כבר המכיל 100 µL של RPMI w / AB, ואז לערבב בעדינות על ידי pipetting. העברת µL 100 של ההשעייה תא לתוך ריק השני הצלחת 96-ובכן עגול-התחתונה כדי לשכפל את הצלחת.
    8. להמשיך עם כל בארות מסומן עם מושבות בוגר. למלא כל הבארות ריק עם 200 µL של RPMI w / AB בינוני. דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2-
      הערה: באחת הצלחות האלה על הרחבה של תא בודד שיבוטים ("צלחת מניות") והשני ישמש "צלחת כפולים" להקרנה.
  2. הקרנה של שיבוטים תא בודד על-ידי cytometry זרימה ו- PCR
    הערה: בעוד שיבוטים תא בודד מתרחבים, להשתמש בלוח כפולים מהשלב 3.1.8 מסך תא בודד שיבוטים נוכחות של רצף כתב על ידי ה-PCR (צעדים 3.2.4–3.2.12) וביטוי של פלורסנט כתב על ידי cytometry זרימה (צעדים 3.2.2–3.2.3) (איור 3 c).
    1. תן את הצלחת כפולים תקופת דגירה של 24 עד 48 שעות ולשכפל את הצלחת שוב. כדי לעשות זאת, להוסיף 100 µL של RPMI w / AB כל טוב לערבב בעדינות על ידי pipetting, להעביר 100 µL צלחת 96-ובכן סיבוב המדרגה החדשה באמצעות של pipet רב-ערוצי. השתמש לוח אחד עבור הקרנה cytometry זרימה והשני להקרנה מבוססי ה-PCR.
    2. להקרנה cytometry זרימה, לגרות את התאים עם PMA-Iono. להכין את mastermix של 0.1 µL של Ionomocin (1 מ מ מניות), µL 0.1 של PMA (50 מניות µg/µL), µL 4.8 של RPMI w / AB לכל מספר של בארות, ואז להוסיף 5 µL של mastermix לכל טוב.
      הערה: אינדוקציה יש צורך לזהות בהצלחה שיבוטים, איפה LTR יכול להיות שקט transcriptionally לכן הכתב פלורסנט אינו מתבטא.
    3. תן תאים תקופת דגירה של 24 שעות ולהכין תאים עבור cytometry זרימה כפי שמתואר בשלב 2.3.3. שער לכל יחיד-התאים קיימא בהתבסס על גודל פיזור sideward ונראות ולנתח ביטוי גנים כתב פלורסנט מאת cytometry זרימה (לדוגמה תוצאות, ראה איור 3 c). אם הטלוויזיה עמוד השדרה מכיל כתב פלורסנט השני עם יזם (למשל, GFP), מסך כל השיבוטים לביטוי המרכזי (backbone) כתב גם (ראה צעד 1.2.2 ו את ההערה הבאה לקבלת הסבר).
      הערה: עמוד השדרה כתב הביטוי מציין שילוב בלתי רצויות של רצפים של עמוד השדרה.
    4. ברגע השיבוטים בצלחת כפולים השני גדלו במידה מספקת (בדרך כלל 24 עד 48 שעות לאחר שכפול של צלחת 96-ובכן), להכין lysates תא המכיל gDNA להקרנה PCR. צנטריפוגה הצלחת 10 דקות ב x 300 גרם -RT. בזהירות. תוריד את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא
      הערה: כל השלבים להכנת lysates ותגובות PCR ניתן לבצע באמצעות פיפטות רב-ערוצי.
    5. לשטוף תאים עם µL 100 ל- PBS מאת pipetting ועדין צריך שתוציאו את הצלחת. בשביל 5 דקות ב x 300 גרם -RT. . תוריד את PBS ולהוסיף 200 µL מאגר פירוק [200 מ"מ NaCl, 100 מ מ טריס-HCl pH 8-8.5, 5 מ מ EDTA, 0.1% מרחביות; לאחר מכן להוסיף 250 – 1,000 µg/mL של proteinase K (lyophilized אבקת, להיכנס טרי)] לכל טוב. לערבב בעדינות על ידי pipetting, ולהעביר את המתלים צלחת חדשה ה-PCR.
    6. לאטום את הצלחת עם סרט פרפין, תקופת דגירה של h 1-55 מעלות צלזיוס thermocycler. צנטריפוגה במהירות מקסימלית 10 דקות (3,000 x g) לסובב את שאריות תאים, ולהעביר את תגובת שיקוע צלחת חדשה ה-PCR.
      הערה: תא lysates בתוך צלחות ניתן לאחסן בשלב זה ב 4 ° C עד שימוש נוסף.
    7. להכין צלחת PCR 96-ובכן עם µL 110 של dH2O ולהוסיף 10 µL של תא lysate (1:12 דילול). תא lysates ייתכן צמיגה וקשה pipet. להשתמש לפחות טיפים pipet 20-µL.
    8. בטל proteinase K מאת הדגירה למשך 10 דקות ב 99 ° C ב- thermocycler. לאחר מכן השתמש את lysates תא מוחלש, מדולל להקרנה PCR.
    9. עיצוב תחל לסינון PCR (P5 ו- P6) מבוסס על הרצף כתב שבחרת כדי להגביר 500-800 bp של הרצף הכתב. עבור בקרת חיובי PCR, להשתמש תחל P7 ו P8 המדגישים 630 bp של פראי-סוג, שאינן ממוקדות גנומית לוקוס (ג'יןNUP188 ) (איור 3 c וטבלה 5). עיצוב זוג פריימר השלישי זה מגביר את לחץ הדם 500-600 של עמוד השדרה טלוויזיה כפקד לשילוב לא ספציפי של רצפי המרכזי (backbone) טלוויזיה (עמוד השדרה ה-PCR).
    10. ההקרנה, שליטה של השדרה ה-PCR, להשתמש mastermix המסחרי של ה-PCR (ראה טבלאות 6 ו 7 עבור מרכיבים PCR ותנאי הרכיבה). השתמש 2 µL של מדולל, מוחלש lysate מוכן בשלב 3.2.8 כתבנית ולרוץ PCR 38 עד 40 מחזורי PCR הגברה בתבנית 96-ובכן.
    11. ניתוח µL 5 מוצרי ה-PCR על ג'ל agarose/טה 1.5%.
      הערה: עבור פקד PCR, להקה מסוימת של 630 bp להתייחס עבור כל דגימה, המאשר כי האיכות של תא lysates היא נאותה PCR. להקה מסוימת בהקרנת PCR (500-800 bp בהתאם לעיצוב פריימר) מציינת שילוב של הרצף כתב. להקה ספציפי עבור עמוד השדרה ה-PCR (500-600 bp, בהתאם לעיצוב פריימר) מציין שילוב בלתי רצויות של רצפי המרכזי (backbone) טלוויזיה (לדוגמה תוצאות, ראה איור 3 c).
    12. לשלב את התוצאות של cytometry זרימה (שלב 3.2.3), מבוסס-PCR ההקרנה (שלב ' ן 3.2.12). בחר שיבוטים אשר להציג גדלים נכונה של מוצרי ה-PCR הקרנת PCR חיובית והשליטה PCR, ביטוי של פלורסנט כתב לאחר אינדוקציה עם PMA-Iono ב cytometry זרימה. הכללת שיבוטים להראות לכל מוצר ה-PCR בתוך עמוד השדרה ה-PCR או ביטוי של טלוויזיה המרכזי (backbone) מקודד חלבון פלואורסצנטי, המציינת את האינטגרציה לא ספציפי של הטלוויזיה המרכזי (backbone) רצף.
    13. בהדרגה להרחיב שיבוטים שנבחרו מהצלחת מניות 96-ובכן לתבניות טוב יותר גדול (48/24/12/6-טוב) עד להשגת תבנית הבקבוק T75 התרבות התא על-ידי הוספת בינוני טריים כל 2-3 ימים. לשמור על צפיפות התאים בין עונה 1 פרק 105 עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
    14. הקפד להכין תא מניות של שיבוטים במהלך הרחבה: לספור את התאים צנטריפוגה ב g x 300 דקות 5-RT, למחוק את תגובת שיקוע, להשעות את התאים בעדינות FCS + דימתיל סולפוקסיד 10%-5 x 106 תאים/מ ל.... Aliquot המבחנות קריוגני, שימוש קירור הקפאה מיכל להקפיא את התאים עד 80 ° C ב- 1 ° C/דקה. לאחסון לטווח ארוך, מעבירים את הנוזל N2.
      הערה: , רצוי לשמור על בקבוקון תרבות תא T75 (קרי, בסביבות 1 x 107 תאים) במהלך הרחבת בהכנה של gDNA עבור אימות של פילוח על-ידי הדרומי סופג (ראו סעיף 3.4).
  3. אימות של שילוב אתרים על-ידי ה-PCR/רצף שיבוטים שנבחרו
    הערה: 5' ו 3' int. צמתים של שיבוטים שנבחרו הן PCR מוגבר, נאספו כדי סנגר רצף כדי לוודא תקן מיקוד ברמת רצף ה-DNA.
    1. להכין את gDNA של שיבוטים שנבחרו, Jurkat פראי-סוג התאים באמצעות ערכת חילוץ gDNA מסחרי.
    2. השתמש זוגות פריימר איגוד 5' הסוף של הכתב ואת הזרם של 5' HA עבור 5' int. צומת (primers P1 ו- P2) ו 3' סוף הכתב במורד הזרם של 3' HA עבור 3' int. צומת (primers P3 ו- P4) כפי שמתואר בשלב 2.4. השתמש תחל P1 ו- P4 כדי להגביר את האתר אינטגרציה יישוב על אלל כתב לענייני integrant (איור 4a).
    3. להכין תגובות PCR עם 100-200 ng gDNA כתבנית ולבצע PCR באמצעות פולימראז של הגהה הפעילות (ראה טבלאות 1 ו- 2 עבור מרכיבים PCR ותנאי הרכיבה).
      הערה: אם הם נצפו להקות, לשקול את שינוי תנאי הרכיבה של ה-PCR על-ידי הגדלת מספר מחזורים או שינוי המאגר PCR (לדוגמה, על-ידי הוספת דימתיל סולפוקסיד או כמויות גדולות יותר של Mg2 +), או על-ידי שינוי של פולימראז.
    4. ניתוח µL 5 מוצרי ה-PCR על ג'ל agarose/טה 1.5%. אם הלהקה הנכון גדלים הם נצפו, לטהר את המוצר PCR הנותר באמצעות ערכת מסחרי, נושא זה סנגר רצף. ודא רצפים של int. צומת 5', int. צומת 3' ו אתר יישוב של אלל כתב לענייני integrant על-ידי הצבתם עם רצפי הצפוי.
      הערה: אלל הומולוגי מאיפה הכתב לא שילב יראה סביר בתיווך Cas9 שינויים באתר היעד, כגון נוקלאוטיד שהתוספות או המחיקות (איור 4a).
    5. עבור שיבוטים המציגים int. הנכון צומת רצפים לאחר יישור, לבצע PCR של הגברה לכתב כל יישוב, נושא זה סנגר רצף כדי לאמת את הרצף הנכון של integrant.
  4. תספיג דנ א ניתוח עבור אימות של פילוח שיבוטים שנבחרו
    הערה: ניתוח תספיג דנ א של שיבוטים שנבחרו נדרש כדי לוודא פילוח נכון או לא לכלול רקומבינציה בתיווך Cas9 אירועים שאירעו ב אתר יישוב אינטגרציה.
    1. לפתח אסטרטגיה לעיכול gDNA המתאים, לחקור את העיצוב לפני הפעלת הניסוי.
      1. בחר באנזים הגבלה על הגבלת gDNA שיוצר המתאים שברי אורך 2 עד 10 קילו ב אתר יישוב. אנזימי הגבלה מסוימת, כגון Asp718, באםHI, אליפותאני, BglII, לסביבהRV, השלישי הינד, המש, אני, Pstאני, PvuII, Scaאני, סטו, ו Sst אני שימשו בהצלחה עבור עיכול משקל מולקולרי גבוה gDNA.
      2. עיצוב שני רגשים הדרומי שונים: בדיקה ספציפית כתב עם בדיקה גנומית. המכשיר הספציפי כתב hybridizes לרצף בתוך הכתב (כלומר בדיקה ספציפית tdTomato של, ). החללית גנומית hybridizes לאזור גנומית קרוב (אך לא חופפים) HA אחת.
      3. לבחור את המכשיר גנומית כך השבר שנוצר על ידי עיכול gDNA כי יזוהו על-ידי בדיקה גנומית איגוד שונה אורך (יותר מ- 2 kb) מיישוב, שאינן ממוקדות אללים (איור 4b). אורך המכשיר של 400 עד 1,000 מומלצת bp.
      4. צבעי יסוד כדי להגביר את שני רגשים נדרש עיצוב ה-PCR. להגביר את המכשיר הספציפי כתב מתבנית טלוויזיה באמצעות של אמינות גבוהה DNA פולימראז (ראה טבלאות 3 ו- 4 עבור מרכיבים PCR ותנאי הרכיבה).
      5. להגביר את החללית גנומית של פראי-סוג Jurkat gDNA מוכן עם ערכת חילוץ gDNA מסחרי השימוש של ה-DNA פולימראז עם הגהה הפעילות (ראה טבלאות 1 ו- 2 עבור מרכיבים PCR ותנאי הרכיבה). לטהר את המוצרים ה-PCR ג'ל agarose/טה ולחלץ את שברי באמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרי על פי הוראות היצרן.
    2. תמצית gDNA משקל מולקולרי גבוה מתאי7 עונה 1 פרק 10 של תאים Jurkat פראי-סוג שיבוטים שנבחרו מהשלב 3.2.14.
      1. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב RT, לשטוף אותו פעם אחת עם PBS, וכן להשעות בגדר ב 4 מ של פירוק מאגר [200 מ"מ NaCL, 100 מ מ טריס-HCl pH 8, 5 מ מ EDTA, 0.1% מרחביות; לאחר מכן להוסיף 250 – 1,000 µg/mL proteinase K (אבקת lyophilized שוקלים טרי)]. דגירה o/n ב 55 ° C, רועדת-350 סל"ד ב thermomixer השולחן.
      2. מוסיפים 4 מ ל אלכוהול איזופרופיל ומערבבים על ידי היפוך פי 10 עד 20. GDNA צריך להיות גלוי כמו התמיסה לבן. ברקע את gDNA precipitated אל קצה פיפטה מזכוכית בסדר, לשטוף מאת המתעוררים 750 µL של 70% EtOH, ולתת יבש ב RT (5-10 דקות).
      3. לשפוך את התמיסה לתוך צינור התגובה 1.5 mL המכיל µL 500 x 1 טה מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 1 מ מ EDTA) ולהשאיר להתמוסס o/n ב 4 ° C, רועדת-350 סל"ד. כל pipetting של gDNA של שלב זה צריך להיעשות עם טיפים נשא רחב כדי למנוע הטיה.
        הערה: הכנת gDNA משקל מולקולרי גבוה הוא חיוני לניתוח תספיג דנ א, ערכות הכנה gDNA הנמכרים אינם מתאימים.
    3. תקציר (שתי פעמים) 15 µg של gDNA של שיבוטים שנבחרו, פראי-סוג תאים Jurkat עם אנזים הגבלה שנבחר (ראה שלב 3.4.1.1) בתגובה 60 µL עם 6 µL של אנזים (20 יחידות/µL): ראשית, להוסיף את ה-DNA, מאגר עיכול, ו- ddH2O, דגירה o/n ב 37 ° C , ואז להוסיף את האנזים, דגירה o/n על טמפרטורה ספציפית אנזים עיכול. ug 15 של gDNA מתעכל נדרש לכל בדיקה הדרומי.
    4. השתמש µL 7 של התקציר הגבלת 60 µL בג'ל אנליטי על ג'ל agarose/טה 1%. כתם מעיד על עיכול מלא איכותי לניתוח תספיג דנ א.
    5. לזרז את התקציר הגבלת הנותרים על-ידי הוספת 1:10 3 מ' סודיום אצטט, אמצעי אחסון 2 100% EtOH, ואז תקופת דגירה של h 1-80 ° C ו צנטריפוגה למשך 30 דקות x 15,600 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    6. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את גלולה עם 70% EtOH. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 15,600 x g ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע, תן בגדר מתייבשים בקצרה-RT, להמיס µL 20 של ddH2O.
    7. הפעל 1% agarose/טה סופג ג'ל, טעינת 20 uL של gDNA מתעכל בנתיב. הפעל את הג'ל על 2 h 60 V, 400 mA.
      הערה: אחוז agarose ג'ל ו לרוץ זמן/מתח עשוי להיות מותאם על פי גודל המקטע הצפוי לגילוי תספיג שחושבו בצעד 3.4.1.1. השלבים הבאים של ניתוח תספיג מתוארים בפירוט פרוטוקול משלים (שלבים 1 עד 18). שלבים אלה מהווים: שטיפה של הג'ל blotting, סופג אל ניילון ממברנה, בדיקה רדיואקטיבי הדור, הכלאה בדיקה ופיתוח של הסרט autoradiograph. להשוות את תבנית סימון שהושג לאחר פיתוח autoradiograph בשלב 18 (פרוטוקול משלים) עם דפוס הצפויות בהתאם לאסטרטגיה הדרומי (לדוגמה תוצאות, ראה איור 4b).
  5. ניתוח אירועים מחוץ-יעד
    הערה: מאז בהנדסת הגנום CRISPR Cas9-בתיווך יכול ליצור את המטרה אפקטים, PCR-להגביר את עשרת המדורגים הגבוהים silicoבחזה את המטרה אתרים שנבחרו שיבוטים, מעמיד אותם בפני סנגר רצף.
    1. השתמש CCTop16 (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de) כדי ליצור רשימה של עשרת המדורגים הגבוהים סיליקו ניבא את המטרה רצפים.
      1. קלט את רצף gRNA כולל פאם משמש עבור מיקוד כמו הרצף שאילתה. בחר "הגולה" כמו פאם "הגנום האנושי" ההפניה לחיזוי חופש-יעד.
      2. להגדיר אי-התאמות סך מקסימלי "4", היעד באתר אורך אורך gRNA בלי פאם. קובץ הפלט תספק רשימה מדורגת של אתרים את המטרה גנומית gRNA בהתאמה.
    2. אין סיליקו לחלץ את bp רצף גנומית 500 ויוצאת של כל אחד עשר הגבוה ביותר בדירוג את המטרה הלהיטים באמצעות דפדפן הגנום UCSC (http://genome.edu.ucsc.edu) ואת המיקום של חופש-המטרה להכות מרשימת תוצאות CCTop.
    3. עבור כל אחד את האתרים היעד כדי להיות מנותח, עיצוב פריימר PCR זוג זה מגביר את קטע של 600-700 bp, כולל אתר חופש-היעד החזוי.
    4. תמצית gDNA מן שיבוטים שנבחרו Jurkat פראי-סוג התאים באמצעות ערכת חילוץ gDNA מסחרי. עבור כל אתר חופש-יעד, לבצע PCR משתמש של ה-DNA פולימראז עם הגהה הפעילות (ראה טבלאות 1 ו- 2 עבור מרכיבים PCR ותנאי הרכיבה) וביום פראי-סוג של gDNA נגזר שיבוט בהתאמה.
    5. ניתוח µL 5 מוצרי ה-PCR על ג'ל agarose/טה 1.5%. אם הלהקה הנכון גדלים הם נצפו, לטהר את המוצר PCR הנותר באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרי, נושא זה סנגר רצף. להשוות רצפים של האתרים את המטרה בתאים Jurkat, יישוב שיבוטים.

תוצאות

בניסוי זה נציג בחרנו להתמקד עיתונאי HIV-1-derived מינימלי המורכב LTR, tdTomato-קידוד רצף, תיקים עשויים. האות רצף מנחלת שני באינטרון 5 של ג'ין BACH217. לוקוסים עבור המיקוד נבחרו על פי קרבה לאתרי שילוב חוזר ונשנה שפורסמו שנמצאו במחקרים שונים על ראשי T תאים נגועים ב- HIV2<...

Discussion

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליצירת מודלים לכתבת HIV-1-נגזר Jurkat עם האתרים שבחרת שילוב proviral החלת בהנדסת הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9.

מספר נקודות של הפרוטוקול דורשים תשומת לב רבה במהלך שלב התכנון. ראשית, מיקומה כדי להיות ממוקד יש לבחור בקפידה, כמו לוקוסים מסוימים ייתכן שיהיה קל יותר ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ברטה Weseloh והבל בטינה לקבלת סיוע טכני. אנו מודים גם ארן Düsedau ו- Hennesen יאנה (לזרום cytometry בפלטפורמת הטכנולוגיה, היינריך Pette אינסטיטוט) לקבלת תמיכה טכנית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9Addgene42230vector for expression of SpCas9 and gRNA
pMKGeneArtmammalian expression vector for cloning
cDNA3.1InvitrogenV79020mammalian expression vector for cloning
BbsINew England BiolabsR0539Srestriction enzyme
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning KitNew England BiolabsE5520SAssembly cloning kit used for target vector generation
TaqPlus Precision PCR SystemAgilent Technologies600210DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)
96-well tissue culture plate (round-bottom)TPP92097tissue culture plates for dilution plating
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530 LDNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD9170dimethyl sulfoxide as PCR additive
Magnesium Chloride (MgCl2) SolutionNew England BiolabsB9021SMgCl2 solution as PCR additive
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN0447SdNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions
5PRIME HotMasterMix5PRIME2200400ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kitQiagen51106DNA isolation and purification kit
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106PCR Purification Kit
RPMI 1640 without glutamineLonzaBE12-167Fcell culture medium
Fetal Bovine Serum South Africa ChargePAN BiotechP123002cell culture medium supplement
L-glutamineBiochromK 0282cell culture medium supplement
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/mL/ 10.000 µg/mLBiochromA 2212cell culture medium supplement
Gibco Opti-MEM Reduced Serum MediaThermo Fisher Scientific31985062cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection
TransIT-JurkatMirus BioMIR2125transfection reagent
phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP8139-1MGcell culture reagent
IonomycinSigma-AldrichI0634-1MGcell culture reagent
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µmMillexSLGP033RBfilter unit for sterile filtration
Heracell 150i incubatorThermo Fisher Scientific51026280tissue culture incubator
Amershan Hybond-N+GE HealthcareRPN1520Bpositively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting
Stratalinker 1800Stratagene400072UV crosslinker
High PrimeRoche11585592001kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro ColumnsGE Healthcare28-9034-08chromatography spin-columns for purification of labeled DNA

References

  1. Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
  2. Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).
  4. Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
  5. Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  6. Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
  7. Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
  8. Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  9. Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
  10. Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
  11. Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
  12. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013)
  13. Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009)
  14. Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014)
  15. Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013)
  16. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
  17. Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
  18. Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).
  19. Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
  20. Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
  21. Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
  22. Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141HIVHIVCRISPR Cas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved