מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

Summary

כאן נתאר שיטת הרלוונטית קלינית, יעילות גבוהה, ללא מזין לתכנת fibroblasts העיקרי אנושי לתוך תאי גזע pluripotent המושרה משתמש ששונה mRNAs קידוד גורמים התיכנות, בוגרת microRNA-367/302 מחקה. נכללים גם הם שיטות להערכת יעילות התיכנות, להרחיב iPSC המשובטים מושבות, לאשר את הביטוי של סמן pluripotency טרה-1-60.

Abstract

תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) הוכיחו להיות כלי רב ערך לחקר התפתחות האדם ומחלות. המשך קידום iPSCs כמו משובי טיפולית דורשת כספת, עומס עבודה, פרוטוקול התיכנות מועיל. כאן, אנו מציגים עבור יעילות גבוהה מאוד התיכנות של האדם fibroblasts עורי לתוך iPSCs באמצעות גישה ללא שילוב פרוטוקול הרלוונטית קלינית, צעד אחר צעד. הליבה של הפרוטוקול מורכב לבטא גורמים pluripotency (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-אלוהים fusion) במבחנה RNAs שליח משועתקים מסונתז עם שינוי נוקלאוטידים (שונה mRNAs). MRNAs ששונה התיכנות transfected לתוך ראשי fibroblasts כל 48 שעות יחד עם בוגרת מחקה microRNA-367/302 ספציפיים לתאי גזע עובריים במשך שבועיים. המושבות iPSC וכתוצאה מכך יכול אז להיות מבודדת והתרחבה ישירות מזין ללא תנאי. כדי למקסם את יעילות והעקביות של פרוטוקול התיכנות שלנו פיברובלסט במדגמים שונים, לנו יש אופטימיזציה פרמטרים שונים כולל את משטר תרביות תאים RNA, התזמון של transfections, תרבות תנאי צפיפות זריעה. חשוב, השיטה שלנו יוצרת באיכות גבוהה iPSCs ממקורות פיברובלסט רוב, כולל דגימות חולה, בן, ו/או senescent קשה לתכנת.

Introduction

התכנות תאים סומטיים לתוך תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) מחייב ביטוי מורחבת של ערכה בסיסית של גורמי שעתוק חשובים לשמירה על pluripotency^1,2. בעת הפקת iPSCs עבור יישומים קליניים, זה חיוני כי הנטל mutational בתאי הקלט הוא ממוזער במהלך עיבוד, היעילות של דור iPSC מתוחזקים ברמה גבוהה יחסית מדגמים החולה. עם זאת, הרוב המכריע של התכנות שיטות, כולל שילוב נטול פרוטוקולים, סובל נמוך מאוד יעילות התיכנות, התועלת קליניים אשר מגבלת של אלו מתקרבת³. יעילות התיכנות נמוך יכול גם לקדם סלקטיבי תכנות מחדש של תאים נשיאת מוטציות קיימים, הגדלת נטל mutational ב iPSCs שנוצר. בנוסף, כל מבוסס DNA התיכנות בשיטות, כגון lentivirus ו episomal-גישות, סובלים החשש בטיחות כי הדנ א עשוי באופן אקראי לשלב הגנום, ליצור ההזדמנות עבור מזיקים מוטגנזה מכוונת insertional ו (לא רצויים פוטנציאל oncogenic) ביטוי של גנים pluripotency רקמות במורד הזרם נגזרים⁴.

בגישה מבטיח להשיג אינדוקציה יעיל של pluripotency בתאים סומטיים ולהפחית את העומס mutational ב iPSCs וכתוצאה מכך היא להשתמש סינתטי RNAs שליח רצ'ט המכיל שינויים nucleobases (שונה mRNAs) עבור התכנות⁵. היעילות של גישות התיכנות מבוססי ה-mRNA שונה ניתן לשפר על ידי הוספת בתאי גזע עובריים (ESC)-מיקרו Rna ספציפיים (miRNAs)-367 ו/או ה-302³, אשר הוכחו לתכנת מחדש תאים סומטיים עם הגברת יעילות^{6 ,7}. עם זאת, גם עם התוספת של miRNAs-367/ה-302, ששונה mRNA-הגישה המבוססת על התיכנות לעיתים קרובות נכשל במהלך היישום תאים החולה מבודד טרי³. כדי חוסר עקביות של גישה זו מבוססת על ה-mRNA שונה ' כתובת, דיווחנו לאחרונה אסטרטגיית ממוטבת, ללא שילוב גורם pluripotency של האדם fibroblasts ראשי עם אחוזי הצלחה גבוהים, משתמשת בשני mRNAs ששונה קידוד התכנות בוגרת miRNA-367/302 וגורמי מחקה⁸. בשיטה שלנו, mRNA שונה התיכנות קוקטייל כולל גירסה שונה של OCT4 התמזגו עם אלוהים transactivation תחום (נקרא מ'₃O)⁹ , חמש התיכנות גורמים אחרים (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A ו NANOG). שילוב של mRNA שונה קידוד הגורמים pluripotency עם miRNA מחקה הופיע יש אפקט סינרגיסטי על התכנות יעילות פרוטוקול זה. מיטובים נוספים של משטר ה-RNA תרביות תאים, תא זריעה, תנאים culturing היו גם להגדיל יעילות התיכנות של הגישה לקבר ברמה גבוהה במיוחד⁸.

בניגוד פרוטוקולים רבים אחרים, הגישה התיכנות שלנו דורש בדרך כלל רק כמה אלפי קלט fibroblasts. בנוסף, נפוצות-שילוב אסטרטגיות רבות בעזרת פלסמידים episomal, סנדאי וירוס או RNA המשכפלת לערב passaging נרחב כדי לדלל את הווקטור התיכנות ב iPSCs שנוצר. לעומת זאת, mRNA שונה ואני מחקה miRNA בוגר יש תוחלת חיים קצרה והם מופרשים במהירות מן התאים. יחדיו, כמות הזמן התרבות התא המצטברים בין איסוף דגימות המטופל ואת הדור של iPSCs שמיש היא מזערית בגישה זו, ביעילות הגבלת ההצטברות מוטציה iPSCs וכתוצאה מכך והשבחת משתלמת.

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב כדי להשיג יעילות גבוהה התכנות של הבוגרים fibroblasts אנושי לתוך iPSCs משתמש שלנו קומבינטורית ששונה בגישה מבוססת על ה-mRNA/miRNA⁸. פרוטוקול התיכנות זה מבוסס-RNA מספק שיטה פשוטה, חסכוני וחזק ליצירת אינטגרציה ללא iPSCs ליישומים קליניים המחקר ופוטנציאל. יתר על כן, זה החלים התיכנות של מגוון רחב של קווי פיברובלסט כולל קשה-עד-לתכנת, הקשורים למחלה, fibroblasts בגילאי, senescent. תיאור סכמטי של הפרוטוקול עבור התכנות fibroblasts האדם מוצג באיור1. הפרוטוקול מתאר במפורש שיטת התכנות משלוש בארות של האדם fibroblasts העיקרי למבוגרים בצלחת תבנית 6-ובכן. שתי בארות תשואה בדרך כלל מספר מספיק של מושבות iPSC באיכות גבוהה. במקרים רבים, רק אחד טוב הוא הכרחי, השלישי טוב יכול לשמש לניתוח של התכנות יעילות. אם נדרש, ניתן לשנות את מספר בארות.

Protocol

לעבוד תחת התנאים ללא RNase ולהשתמש טכניקות aseptic במידת האפשר. לבצע מניפולציות תרבות הקשורים לכל תא ב- cabinet באמצעות טכניקות aseptic ביטחון ביולוגי. בצע סטנדרטים מוסדיים אבטחה לעבודה עם תאים אנושיים.

1. ראגנטים וציוד עבור הכנה של התכנות חניכה

1. להכין mRNA שונה קוקטייל קידוד התיכנות הגורמים.
   1. בצע את פרוטוקול שפורסמו בעבר¹⁰ כדי לבצע במבחנה שעתוק, מיצוי, וכן dephosphorylation ההליכים עבור כל mRNA שונה קידוד גורם התיכנות בודדים. לאחר השלב הסופי טיהור, elute של mRNA שונה במים נטולי נוקלאז, שמשלימה את הפתרון mRNA שונה מטוהרים עם מעכב RNase U/µL 1, quantitate את mRNAs ששונתה באמצעות ספקטרופוטומטרים ו לאחסן ב- 80 ° C עד 6 חודשים. להכין aliquots מרובים של כל mRNA שונה כדי לצמצם את מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה.
      הערה: פרוטוקולים דומה עבור mRNA שונה הייצור היה דיווח במקום אחר^5,8,11. תבניות עבור במבחנה תמלול יכול להיווצר על ידי הגברה PCR מתבניות פלסמיד המתאימים באמצעות תחל המופיעים בטבלה של חומרים על פי פרוטוקול שפורסמו בעבר¹⁰. פלסמיד תבניות עבור כל גורם התיכנות (מ'₃O⁹, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A), mWasabi (פקד על תרביות תאים) הינם זמינים מן Addgene, מאגר פלסמיד ללא כוונת רווח.
   2. מערבבים יחד את כל mRNAs שונה ביחס טוחנת של 3:1:1:1:1:1 (M₃O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) כוללים 10% mWasabi שונה mRNA כמו פקד עבור יעילות תרביות תאים. התאם את הריכוז של mRNA שונה להשלים התכנות מערבבים היטב עד ריכוז סופי של 100 ng/µL על ידי הוספת מים נטולי נוקלאז בתוספת מעכב RNase U/µL 1. להכין 7 33 aliquots µL של שלמה ששינה mRNA קוקטייל. לאחסן את aliquots התיכנות מעורב ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: עבור כל תרביות תאים, 1,000 ng של. קוקטייל mRNA שונה יתווסף לכל טוב (קרי, סך של 3,000 ng עבור 3 בארות). כל µL 33 aliquot מותאם transfect 3 בארות של צלחת תבנית 6-ובכן, כולל 3 µL של אמצעי אחסון עודף עבור שגיאות pipetting. הכנת שבע 33 µL aliquots מספיקה להשלים מלא פיברובלסט התכנות של 3 בארות בצלחת תבנית 6-. טוב.
2. להכין את הקוקטייל של התכנות מחקה miRNA.
   1. התמוססות lyophilized miRNA מחקה (Syn-יש-מיר-302a - 3p, Syn-יש-מיר-302b - 3p, Syn-יש-מיר - 302c - 3p, p Syn-יש-מיר-302d-3, Syn-יש-מיר-367-3 p) כדי ריכוז סופי 5 pmol/µL (5 מיקרומטר) במים נטולי נוקלאז בתוספת 1 U µL של RNase מעכב. להכין aliquots מרובים של כל לחקות miRNA ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
   2. מערבבים כל מחקה miRNA ביחס 1:1:1:1:1 טוחנת את ריכוז הסופי של 5 pmol/µL (5 מיקרומטר). להכין 7 14 aliquots µL של miRNA מחקה מיקס. לאחסן את aliquots מעורב ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: עבור כל תרביות תאים, pmol 20 של המיקס מחקה miRNA יתווסף לכל טוב (קרי, סך של 60 pmol וולס 3). כל µL 14 aliquot מותאם transfect 3 בארות של צלחת תבנית 6-ובכן, כולל 2 µL של אמצעי אחסון עודף עבור שגיאות pipetting. הכנת שבע 14 µL aliquots מספיקה להשלים מלא פיברובלסט התכנות של 3 בארות בצלחת תבנית 6-. טוב.
3. הכנת המאגר תרביות תאים.
   1. לחמם בקבוק 500 מ"ל ו 100 מ ל בקבוק בינוני טריים מופחתת-סרום לטמפרטורת החדר (RT) כבר בערך שעתיים. אין להשתמש באמבט מים.
   2. העברת מד pH אבטחה בארון. רחץ המונה אלקטרודת זכוכית עם מים ללא נוקלאז. לכייל מד pH בהתאם להוראות ייצור. לשטוף את האלקטרודה שוב במים נטולי נוקלאז.
   3. להעביר שני הבקבוקים של מדיום מופחת-סרום לתוך ארון אבטחה. להשתמש את בקבוק 500 מ"ל RT כדי להתאים את ה-pH.
   4. למדוד רמת ה-pH בסיסי של המדיום סרום מופחתת על ידי החדרת אלקטרודת זכוכית של מד pH לתוך המאגר. לחכות עד 1 דקות לפני קריאת ה-pH על המונה.
   5. להוסיף 3-4 מ ל 1 M NaOH 500 מ"ל של מדיום מופחת-סרום, לסגור את הבקבוק, ומערבבים היטב. להמתין עד 5 דקות לפני פתיחת הבקבוק למדידה pH. הכנס האלקטרודה של מד pH לתוך המאגר והמתן עד הקריאה במד pH מייצבת.
   6. המשך להוסיף כרכים קטנים של 1 M NaOH עד ה-pH של מדיום מופחת-סרום מגיע 8.15-8.17. לכייל מד pH מספר פעמים במהלך התהליך. אם בשלב כלשהו הופך ה-pH גבוה יותר מאשר 8.18, הפחת את-ידי הוספת מדיום מופחת-סרום טריים מהבקבוק ומחוממת מראש 100 מ ל (שלב 1.3.1).
      הערה: ה-pH של המאגר מופחתת-סרום המבוסס על בינוני תקנים הוא קריטי. התכנות תהיה מוצלחת אם ה-pH של המאגר תרביות תאים הוא כ 8.2 ± 0.05 אבל עשוי להיכשל אם ה-pH הוא גבוה יותר מאשר 8.25. לכן, מומלץ כדי להפסיק את הוספת NaOH, ברגע pH של המאגר מגיע 8.15-8.17. פעולה זו תבטיח כי רמת ה-pH הסופי של המאגר תרביות תאים הוא כ 8.2-8.22 לאחר עיקור.
   7. מסנן לעקר את המאגר תרביות תאים באמצעות מערכת סינון ואקום 0.22 מיקרומטר. Aliquot מאגר סטיריליים אל תוך 5-15 מ ל צינורות עם המרחב האווירי מינימלי.
   8. חנות aliquots של המאגר תרביות תאים עד 3 חודשים ב 4 º C. למדוד את רמת החומציות של aliquots מעת לעת. למחוק את aliquots אם ה-pH גבוה יותר מאשר 8.25. להגביל את השימוש aliquot כדי 2 transfections רק מאז החשיפה של המאגר תרביות תאים אוויר אטמוספרי מגביר את ה-pH של המאגר.
4. להכין המדיום הרחבה פיברובלסט (FEM): בינוני חיוני המינימלית בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 1 x 1 x עט/דלקת/fungizone 55 מיקרומטר מרקפטואתנול, תוספת גלוטמין x 1, חומצות אמינו שאינן הכרחיות. חנות ה – FEM ב 4 º C.
5. להכין המדיום התיכנות: DMEM/F12 (אין HEPES) בתוספת 20% נוקאאוט סרום חלופי (KOSR), 0.5 x חומצות אמינו שאינן הכרחיות תוספת גלוטמין x 0.5 מיקרומטר 55 מרקפטואתנול, 50 חומצה אסקורבית µg/mL, 1 x עט/דלקת/fungizone, bFGF 100 ננוגרם למ"ל , ו- 200 ng/mL B18R. להכין את המדיום ביוזמתו של התכנות ללא bFGF, B18R, ואחסן אותו ב 4 º C. אין להשתמש זה מעבר חודש שלם לאחר ההכנה. להוסיף bFGF ו- B18R מיד לפני כל שימוש aliquot בגודל לשימוש של אותו יום.
6. להכין המדיום ציפוי על-ידי הוספת 5% חום-לא פעיל (איץ ' אי) FBS לתוך התיכנות האמצעי המכיל 20% KOSR ללא bFGF B18R מהשלב 1.5. הכינו את טרי בינוני ביום של השימוש המיועד. הוסף את bFGF ואת B18R מיד לפני השימוש ביום 0 של התכנות.
7. כיילו את חממות תרביות רקמה לפני ביצוע התכנות לפי הוראות היצרן באמצעות מנתח₂ CO כף יד דיגיטלי. השתמש של חממה נמוך-O₂ עבור הצעדים התיכנות כדי להבטיח דור iPSC מוצלחת.

2. culturing Fibroblasts עבור התכנות

1. להכין fibroblasts לפני אתחול של התכנות (יום-2).
   1. המעיל צלחת חדשה של תרביות רקמה 10 ס מ 5 מ של 0.1% ג'לטין. הקש או מערבולת את הצלחת על מנת להבטיח כי השטח כולו מצופה. תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C. האחות הג'לטין ולהוסיף 10 מ"ל של ערכת FEM. הצידה. אל תאפשר המשטח מצופה של צלחת להתייבש לפני הוספת FEM.
   2. בזהירות תשאף האמצעי בילה fibroblasts. יש לשטוף את התאים פעם אחת עם 5 מ של DPBS כדי להסיר את הנסיוב שיורית. להוסיף 3 מ"ל של טריפסין-EDTA. רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח כיסוי מלא על התאים.
   3. לשאוב נוזל עודף, עוזב ~ 500 µL של טריפסין. לא תשאף יתר על המידה, שכן זה יכול לייבש ולהרוג את fibroblasts. דגירה של fibroblasts עם טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 º C.
   4. הסר את הלוחית של החממה והקש בחוזקה אך בעדינות את הצד של הצלחת להוציא את התאים. בדוק את התאים במיקרוסקופ. אם התאים נמצאים תלוש וחסר צף, המשך. אם התאים עדיין מחוברים, תקופת דגירה של עוד 3 דקות.
   5. במהירות שטיפה/לאסוף התאים מנותקים באמצעות 5 מיליליטר פמ לנטרל את טריפסין-EDTA. הזז את המתלים פיברובלסט לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. ודא כי התאים נמצאים מעורבב היטב.
   6. מערבבים בעדינות התליה תא לפרוץ גושים גדולים של תאים, ואז לספור אותם על hemocytometer. העברת 2.5 10x⁵ תאים לתוך המנה ס מ-10 מצופים ג'לטין מוכן בשלב 2.1.1. דגירה התאים לילה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ תרביות רקמה רגילה humidified חממה.
      הערה: צפיפות תא הוא קריטי להשגת יעילות התיכנות גבוהה, כמו זה חשוב כי fibroblasts הם במהירות חלוקת ובריאה. ציפוי 2.5 10x⁵ תאים התשואות confluency 40-60% 2 ימים מאוחר יותר עבור רוב דגימות פיברובלסט. לשנות את הכמות בהתאם עבור תאים נגועים או senescent להשיג את confluency הרצוי 40-60% 48 שעות מאוחר יותר.
   7. החלף את המדיום 10 מ"ל של פמ טריים למחרת (יום-1).
2. צלחת את fibroblasts ליזום התכנות (יום 0).
   1. ודא fibroblasts כדי לתכנת ב- 40-60% confluency (איור 2, יום 0). אם התאים נמצאים מעל או מתחת confluent, המעבר fibroblasts כפי שמתואר בשלב 2.1 ולהתאים את צפיפות ציפוי בהתאם. תרבות לעוד יומיים.
   2. העברה מ 4 ל DPBS לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף 100 µL של האדם רקומביננטי (rh) laminin-521. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ביסודיות.
   3. להוסיף 1 מ"ל לכל טוב של rhLaminin מדולל-521 לתוך בארות 3 של צלחת 6-. טוב. דגירה לצלחת מצופה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
   4. לחמם 6 מ של פמ ו- 4 מ של ציפוי בינוני עד 37 מעלות צלזיוס. תוספת המדיום ציפוי עם bFGF כדי ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ"ל, B18R כדי ריכוז סופי של 200 ng/mL.
   5. בזהירות תשאף האמצעי בילה fibroblasts (שלב 2.2.1). לשטוף את התאים עם 5 מ של DPBS ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין-EDTA. רוק בעדינות את הצלחת כדי לכסות את התאים עם טריפסין-EDTA.
   6. האחות עודפי הנוזלים, עוזב ~ 500 µL של טריפסין, כפי שנעשה צעד 2.1.3. דגירה של fibroblasts עם טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 º C. הסר את הלוחית של החממה והקש בחוזקה אך בעדינות את הצד של צלחת מכך התאים. בדוק את התאים במיקרוסקופ. אם התאים נמצאים תלוש וחסר צף, המשך. אם התאים עדיין מחוברים, תקופת דגירה של עוד 3 דקות.
   7. שטיפה/לאסוף התאים מנותקים באמצעות 5 מיליליטר פמ לנטרל את טריפסין-EDTA. הזז את המתלים פיברובלסט לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. ודא כי התאים הם מעורבים היטב ולא לסמוך עליהם hemocytometer. פיפטה 12,000 תאים לתוך 4 מ של ציפוי prewarmed בינונית משלב 2.2.4.
      הערה: לא centrifuge את התאים בשלב כלשהו. ניתן להתאים את מספר התאים מצופה למעלה או למטה כנדרש לקווים או מהיר-הגדלים לאט, בהתאמה.
   8. הסר את לוחית מצופה של החממה, האחות rhLaminin מדולל-521 מן הבארות מצופה. אל תאפשר את פני השטח של הבארות להתייבש. Resuspend בעדינות תאים המדיום ציפוי. פיפטה 1 מ"ל של השעיה תא לתוך כל מצופה היטב (קרי, 3,000 תאים לכל טוב).
   9. למקם את התאים מצופה חממה תרביות רקמה tri-גז עם O₂ מוגדר כ- 5% (נמוך-או₂). לאחר הצלחת מוגדר, בעדינות אך ביסודיות לפזר תאים, לסירוגין בין תנועה למעלה/למטה ואז שמאלה/ימינה. חזור על הרמזים 2 פעמים נוספות. דגירה התאים בן לילה. לא מערבולת את הצלחת לערבב.
   10. פיפטה 4 מ של התכנות בינוניים עד צינור חרוטי 15 מ"ל ולמקם אותו בחממה נמוך-O₂ עם כובע loosened כדי equilibrate בין לילה. אל תוסיף bFGF ו- B18R עד למחרת היום.

3. ייזום של Reprogramming (יום 1)

הערה: לאחר התיכנות מאותחלת, תחזוקה יומית נדרשת במשך בערך חודש. הקפד לתכנן בהתאם. Incubations תא עוקבות כל חייב להתבצע בתנאים נמוך-O₂ 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ humidified tri-גז חממה תרביות רקמה.

1. החלף את המדיום ציפוי לפחות 1 שעה לפני תרביות תאים.
   1. הסר את המדיום התיכנות equilibrated החממה נמוך-או₂ . להוסיף bFGF ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ"ל ו B18R כדי ריכוז סופי של 200 ng/mL. מערבבים היטב.
   2. בהליך עם 1 טוב בכל פעם, השתמש פיפטה 1 מ"ל להסיר את המדיום בילה ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום התיכנות בתוספת bFGF ו- B18R. חזור על הפעולה עבור כל טוב. אל תשתמש השאיפה ואקום, אשר יתר על המידה מתייבש התאים לנסיון, מפחית את יעילות התיכנות. להעביר לצלחת עם תאים בחזרה לתוך החממה נמוך-או₂ .
2. Transfect fibroblasts עם 5 µL של ריאגנט תרביות תאים RNAiMax לכל 1 µg של mRNA שונה, µL 1 מהתרכובת תרביות תאים לכל pmol 6 של miRNA מחקה לפי תקנים.
   הערה: תוצאות אופטימליות מתקבלים כאשר transfections המשך עבור 16 – 20 h. תרביות תאים הכימית הוא מדולל 10 x; ng/µL 100 mRNA שונה קוקטייל זה מדולל 5 x; מחקה-miRNA pmol/µL 5 לערבב הוא מדולל 8.33 x עם המאגר תרביות תאים לפני complexation. לקבלת סיכום של ההתקנה תרביות תאים, ראה טבלה 1 .
   1. בזמן הכנת תקנים מערבב, למזער חשיפה אפשרית של ריאגנטים RNase על-ידי ביצוע מעבדה סטנדרטיים.
   2. Equilibrate של aliquot של המאגר תרביות תאים (שלב 1.3) עבור 1 h RT. אין להשתמש אמבט מים 37 ° C או חממה כדי לחמם את המאגר תרביות תאים.
   3. הסרה של aliquot יחיד של ששונה mRNAs (33 µL), miRNA מחקה (14 µL) מ-80 מעלות צלזיוס לחמם אותן כדי RT למשך כ 3-5 דקות, עד הקרת. לא להפשיר את aliquots ב 37 º C. ספין אותם למטה בקצרה ב microfuge.
   4. חמים הכימית תרביות תאים כדי RT למשך כ 3-5 דקות. אל תשתמש אמבט מים 37 ° C או חממה. היפוך הצינור סגור 2 – 3 פעמים כדי לערבב הכימית. . תסובב את זה למטה לזמן קצר ב- microfuge
   5. העברת µL 279 המאגר תרביות תאים RT לתוך צינור microcentrifuge נטולת RNase. להוסיף µL 31 מהתרכובת תרביות תאים כדי להשיג נפח סופי של µL 310. לערבב ביסודיות על ידי pipetting. לא מערבולת. דגירה הצינור ב RT עבור 1 דקות.
      הערה: אמצעי אחסון זה מהתרכובת מדולל תרביות תאים מספיקה למתחם ששונה mRNA והן miRNA מחקה aliquots מהשלב 3.2.3.
   6. להוסיף µL 132 המאגר תרביות תאים RT aliquot 33 µL של mRNA שונה. פיפטה בעדינות לערבב: אחסון הסופי הוא 165 µL.
   7. להוסיף µL 102.6 המאגר תרביות תאים RT aliquot 14 µL של miRNA מחקה. פיפטה בעדינות לערבב: אחסון הסופי הוא 116.6 µL.
   8. הוסף µL 165 מהתרכובת תקנים מדולל מהשלב 3.2.5 כדי מדוללת mRNA שונה שלב 3.2.6. פיפטה לערבב: אחסון הסופי הוא 330 µL.
   9. הוסף µL 116.6 מהתרכובת תקנים מדולל מהשלב 3.2.5 לתערובת מחקה miRNA מדולל מהשלב 3.2.7. מערבבים היטב (נפח סופי הוא 233.2 µL). תקופת דגירה של 15 דקות ב RT כדי לאפשר המאגר תרביות תאים למתחם עם mRNAs שונה, miRNA מחקה.
   10. הסר את הלוחית עם תאים של החממה נמוך-או₂ . להוסיף 100 µL (1 µg) של מורכבות שונה mRNA תרביות תאים שילוב כל טוב, dropwise על פני הבאר. לפזר את מתחמי תרביות תאים על-ידי בעדינות אך ביסודיות לזעזע את הצלחת עם תנועה למעלה/למטה ואז שמאלה/ימינה. לא מערבולת את הצלחת לערבב.
   11. להוסיף 66.7 µL (20 pmol) של המיקס של תרביות תאים מחקה miRNA ומורכבת מכל קידוח, dropwise על פני הבאר. לפזר מתחמי תרביות תאים על-ידי בעדינות אך ביסודיות לזעזע את הצלחת עם תנועה למעלה/למטה ואז שמאלה/ימינה. לא מערבולת את הצלחת לערבב.
   12. למקם את התאים transfected tri-גז החממה ב- O₂ מוגדר כ- 5% (נמוך-או₂). לאחר הצלחת מוגדר, לפזר את מתחמי תרביות תאים שוב על ידי בעדינות אך ביסודיות לזעזע את הצלחת עם תנועה למעלה/למטה ואז שמאלה/ימינה.
   13. פיפטה 4 מ של התכנות בינוני לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ולמקם אותו בחממה נמוך-O₂ עם כובע התיר equilibrate בין לילה. אל תוסיף bFGF ו- B18R עד למחרת היום.

צינור 1 - דילול RNAiMax (1רחוב mix)
מגיב	ריכוז	נפח
מאגר תרביות תאים		279 ΜL
RNAiMax (להוסיף 2)	10 x	31 ΜL
		סה כ: µL 310
		(דגירה 1 דקות בטמפרטורת החדר)
צינור 2 - mRNA שונה לערבב (2nd mix)
מגיב	ריכוז	נפח
מיקס mRNA שונה	100 ng/µL (5 x)	33 ΜL
מאגר תרביות תאים		132 ΜL
		סה כ: µL 165
		(להוסיף נפח שווה RNAiMax מדולל צינור 1)
צינור 3 - miRNA מחקה לערבב (3rd mix)
מגיב	ריכוז	נפח
miRNA מחקה מיקס	5 pmol/µL (8.33 x)	14 ΜL
מאגר תרביות תאים		102.6 ΜL
		סה כ: µL 116.6
		(להוסיף נפח שווה RNAiMax מדולל צינור 1)

טבלה 1: הכנת תערובת תרביות תאים.

4. החלפת Reprogramming בינוני בין Transfections (ימים 2, 4, 6, 8, 10 ו- 12)

1. החלף את בינוני 16 – 20 h תקנים שלאחר כמתואר ב- 3.1.1–3.1.2. להוסיף bFGF ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ"ל ו B18R כדי ריכוז סופי של 200 ng/mL לתוך התיכנות aliquots בינונית.
2. לפקח על הביטוי mWasabi מדי יום כדי לוודא איכות תרביות תאים באמצעות מיקרוסקופ נקבעה לדמיין EGFP.
   הערה: ביטוי mWasabi צריכה להיות מינימלית לכאורה ביום 2 ולאחר לודיג בהירות עם כל תרביות תאים נוספים.

5. כל אחר-יום Transfections (ימים 3, 5, 7, 9, 11 ו- 13)

1. לבצע תרביות תאים כפי שמתואר בשלב 3.2. אל תשנה את המדיום בימים של תרביות תאים.
2. להכין aliquot 4 מ"ל של התכנות בינוני ומניחים אותו בחממה נמוך-O₂ כדי equilibrate לשינוי בינוני למחרת היום. אל תוסיף bFGF ו- B18R עד למחרת היום.

6. נהלים שיש לבצע לאחר גמר תרביות תאים

1. לבצע שינויים בינונית מדי יום מיום 14 דרך כ יום 17. לחמם 7 מ של התכנות בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס. להוסיף bFGF ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ"ל.
   הערה: B18R כבר לא נחוץ לאחר תרביות תאים הסופי. מעבר יום 14, זה כבר לא הכרחי כדי equilibrate בין לילה המדיום בחממה נמוך-O₂ .
2. הסר את המדיום של כל הבארות באמצעות פיפטה סרולוגית. להמשיך להימנע משימוש השאיפה. להוסיף 2 מ של התכנות בינוני בתוספת bFGF לכל טוב.
3. בימים 17 ו-18, לנתח את בארות reprogrammed תחת מיקרוסקופ הפוכה או ויבתר. אם המושבות נוצרות בסמיכות זו לזו בשל יעילות גבוהה של התכנות ואין אפשרות מבודד באופן ידני, להפריד את המושבות על-ידי ביצוע passaging אופציונלי של וולס היו שמתואר בשלב 7 להלן. אם המושבות הינם דליל מופרדים היטב, לבחור באופן ידני שיבוטים ישירות מ- reprogrammed טוב כפי שמתואר בשלב 8 של תת-תרבות iPSCs על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

7. הליך אופציונלי: Passaging תאים מבארות מחדש באמצעות EDTA

1. הכן 0.5 מ מ EDTA DPBS (EDTA) על ידי דילול הפתרון מניות של EDTA 0.5 M. מסנן לחטא EDTA באמצעות מערכת סינון ואקום 0.22 מיקרומטר.
2. להכין pluripotent מזין ללא תאי גזע (PSC) בינונית (למשל, mTeSR1) על פי הוראות היצרן. לחמם מ 32 ל PSC בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס.
3. מעיל כל בארות של שתי צלחות. ובכן 6 תבנית עם המלא hESC מטריצה חוץ-תאית (ECM) ההוראות של היצרן. חותם צלחות עם סרט פרפין, דגירה אותם עבור h 1-RT.
4. וארוקן את פתרון ה-ECM של הלוחות מראש ומחוממת ולהחליף אותו עם 2 מ ל PSC בינוני לכל טוב. אל תאפשר את פני השטח של הבארות להתייבש. להגדיר אותם הצידה.
5. האחות המדיום התיכנות מבארות היו 2 ביום כאשר המושבות וגדולים בבירור בנוי (בדרך כלל יום 18). לשטוף פעם עם 1 מ"ל של EDTA, וביופסיה.
6. להוסיף 1 מ"ל של EDTA לכל טוב. תקופת דגירה של 4 דקות ב 37 º C.
7. בעדינות הסר את הלוחית של החממה ולמקם אותו אבטחה בארון.
   הערה: בשלב זה, תאים עשוי להיות מודבקת מאוד רופף, משתחררים ממקומם בקלות.
8. בזהירות תשאף EDTA שתי בארות. להוסיף 3 מ"ל של מדיום PSC ומחוממת מראש לכל ליחס טוב עם EDTA. השתמש של התא-מגרד בעדינות אך ביסודיות מכך התאים שניכם בארות.
9. השתמש פיפטה סרולוגית בעדינות pipette התליה תא ולשבור את הגושים הגדולים. לא פיפטה עד כל כגיהנום תא נעלמו. לשמר iPSC אשכולות.
   הערה: ציפוי גושים גדולים לא תשפיע iPSC המושבה תוצר. אם יש גושים תא גדול יתר על המידה, פשוט להימנע להעביר אותם לתוך המנה הבאה.
10. באמצעות פיפטה סרולוגית, פזר באופן שווה תאים מכל קידוח EDTA שטופלו על-ידי pipetting 0.5 mL לבאר כל צלחת 6-ובכן מצופים ECM.
    הערה: אל תשלבו תאים מן הבארות reprogrammed (קרי, היו גם 1 צריך להיות מופץ באופן שווה לתוך צלחת 6-הבאר הראשונה, היו 2 טוב יופצו באופן שווה 6-ובכן המשקולת השני).
11. העבר את התאים מצופה בחזרה לתוך החממה נמוך-או₂ . לפיזור אחיד תאים, מנערים כל צלחת הגב וושוב, צד אל צד. לא מערבולת. החלף את המדיום PSC מדי יום.

8. איסוף iPSC המושבות

1. לחמם-15 מיליליטר PSC בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס. מעיל כל בארות של לוח 6-ובכן אחד עם ה-ECM המלא hESC ההוראות של היצרן. לאטום את הצלחות עם סרט פרפין, דגירה אותם עבור h 1-RT.
2. האחות המדיום תרבות מבארות בשימוש כדי לאסוף את iPSCs. לשטוף פעם עם 1 מ"ל של EDTA, וביופסיה. להוסיף 1 מ"ל של EDTA לכל טוב. תקופת דגירה של 4 דקות ב 37 º C. בעוד התאים הם המקננת, וארוקן את פתרון ה-ECM של הלוחות מראש ומחוממת והחלף 2 מ ל PSC בינוני לכל טוב. להפריש את הצלחות.
3. הסר בעדינות לצלחת עם iPSCs כדי לבחור בהם מתוך החממה ולמקם אותו אבטחה בארון.
   הערה: בשלב זה, תאים עשוי להיות מודבקת מאוד רופף, משתחררים ממקומם בקלות.
4. בזהירות תשאף EDTA. להוסיף בעדינות 3 מ"ל של מדיום PSC מראש ומחוממת, מטפל לא להוציא iPSC מושבות.
5. להעביר הצלחת אל טווח הפוכה או ויבתר טוב יותר להמחיש מושבות. הכן על פיפטה 1 מ"ל עם טיפ סטרילי. את הבוכנה במלואו ולאחר מכן שימוש בקצה פיפטה יחפ מושבה בעדינות תוך כדי ציור לאט נוזל לתוך קצה כדי לאסוף את המושבה. צייר כמו בינוני קטן ככל האפשר תוך איסוף המושבה iPSC.
6. כדי להעביר את המושבה, פיפטה למעלה ולמטה 3 – 4 פעמים לבאר בודדת של צלחת מצופים ECM מהשלב 8.2. חזור עד 6 מושבות בחרה והעבירו לתוך בארות בודדים. לבחור מושבות לא יותר מ-2 מבאר יחיד כלשהו אם אופציונלי passaging המתואר בשלב 7 בוצע.
7. השתמש פרוטוקול סטנדרטי בתאי גזע אנושיים להקפיא את כל בארות הנותרים. להפשיר, צלחת מחדש קפוא מניות אם המושבות יותר, יש לבחור מאוחר יותר.

9. אפיון iPSCs

1. לבצע TRA-1-60 מכתים לניתוח של התכנות יעילות (יום 18).
   הערה: 2 מתוך 3 בארות מחדש הם passaged עבור איסוף המושבה בעתיד. הנותרים טוב יכול לשמש עבור צביעת TRA-1-60. הליך זה יכול להתבצע על גבי ספסל מעבדה.
   1. לשטוף את reprogrammed טוב עם 1 מ"ל ל- PBS. לתקן תאים עם מתנול כקרח ב-20 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
   2. וביופסיה מתנול. יבש הבאר עבור 2 דק יש להיזהר לא יבש מדי. התאים התייבשו מספיק כאשר הם הופכים צבע שקוף/מט.
   3. לשטוף היטב 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS במשך חמש דקות עם טלטול עדין. במהלך מנקי, להכין 3 מ ל מי חמצן 3% ב- PBS.
   4. מחוק לגמרי מגניב. להוסיף 2 מ ל תמיסה מדוללת. תקופת דגירה של 15 דקות ב RT ברעידות עדין. להכין 4 מ"ל של הפתרון חסימה: 10% שור-אלבומין (BSA) ב- PBS.
   5. האחות של תמיסה. לשטוף היטב 2 פעמים עם 1 מ"ל של PBS במשך 5 דקות.
   6. האחות PBS ולהוסיף 2 מ"ל של חסימת פתרון לתוך הבאר. תקופת דגירה של h 1-RT.
   7. לשטוף היטב 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS במשך חמש דקות עם טלטול עדין.
   8. לדלל העיקרי נוגדן anti-TRA-1-60-מטריים בפתרון חסימה בתוספת אזיד הנתרן 0.05%. להכין 1 מ"ל של דילול נוגדנים עבור 1 טוב של כל תבשיל תבנית 6-. טוב. מוסיפים נוגדן דילול הבאר, לעטוף את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע התאיידות. דגירה בין לילה ב 4 ° C עם טלטול עדין.
      הערה: אם יש צורך, הדגירה עם נוגדן ראשוני יכול להיעשות עבור h 1 ב RT ברעידות עדין. דילול נוגדן ראשוני ניתן מחדש עד 5 פעמים.
   9. לאחר דגירה עם נוגדן ראשוני, לשטוף היטב 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS במשך חמש דקות עם טלטול עדין.
   10. לדלל משני העכבר אנטי מצומדת HRP הנוגדן-1:200 בפתרון חסימה. דגירה הבאר עם דילול נוגדנים משניים עבור 2 h ב- RT ברעידות עדין.
   11. האחות דילול נוגדנים משניים ולשטוף היטב 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS במשך חמש דקות עם טלטול עדין.
   12. במהלך לשטוף את השלישי, להכין את הפתרון המצע בעקבות ההוראה של היצרן. לאחר השטיפה הסופית האחות PBS. להוסיף 1 מ"ל של הפתרון המצע, דגירה עד בצבע הרצוי מפתחת (כ- 10 דקות).
   13. האחות הפתרון המצע. לשטוף היטב עם מים במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
   14. לספור את המושבות, אם רצונך בכך. התכנות יעילות = (מספר מושבות) / (מספר של מצופים fibroblasts) x 100%.
   15. לאחסון לטווח ארוך, תשאף מים מהצלחת ויטראז'ים ולאחר מילה נהדרת בין לילה-RT. חותם לצלחת מיובשים עם מצלמות-מיקרוסקופים ולאחסן ב 4 ° C עד 2 שנים להעריך את יעילות התיכנות מאוחר יותר.

תוצאות

זה בדרך כלל לוקח כ 5-6 שבועות של אתחול של פיברובלסט התכנות כדי הקפאה של הבקבוקונים הראשונה של iPSCs (איור 1). פרוטוקול התיכנות יכולים להיות מסווגים בדרך כלל לתוך בשני שלבים. שלב א' כולל התרבות פיברובלסט, שבעה transfections, עם ה-RNA התיכנות קוקטייל שבוצעה בכל ה 48 שלב 2 כולל בידוד, הרחבה, ואפיון של המושבות iPSC.

לפני ביצוע בפרוטוקול, זה צריך להבטיח שמפות fibroblasts כדי לתכנת הם באיכות טובה. Fibroblasts בריא אמור להופיע בצורת כישור, הפרעה דו קוטבית, ו- refractile עם זמן הכפלה של 24 שעות. ביום 0, התאים 250,000 מצופה לתוך תבשיל 10 ס מ ביום-2 אמור לגדול confluency 40%-60% (איור 1, יום 0), תשואה כ 6 – 10 x 10⁵ תאים. תאים מתרבים בקצב איטי יותר יכול להיות מפוצה על ידי ציפוי-צפיפות גבוהה יותר ביום-2, וביום 0 עבור התכנות.

Fibroblasts אמור להופיע מאוד דליל ציפוי הבאים לבאר של תבשיל טוב 6 תבנית עבור התכנות (איור 2, יום ראשון). עשרים וארבע שעות בעקבות של תרביות תאים הראשון, fibroblasts לאבד את צורתם פלך, לאמץ מורפולוגיה יותר מעוגל (איור 2, יום שני), אשר נשמר דרך שאר התכנות. קרינה פלואורסצנטית ירוק מ mWasabi mRNA עליו להיות מינימלית נצפות ביום 2, בהתמדה לודיג בהירות כדי שניתן יהיה ביום 4. היכולת לזהות קרינה פלואורסצנטית mWasabi יכולים להיות תלויים טווח רגישות וההתקנה. תא צפיפות בהדרגה ובאופן עקבי יגדל בכל רחבי transfections שלושת (ימים 1-6), עם פרץ לכאורה בהתפשטות המתרחשים בין ימים 7 ו- 8. התאים אמורה להופיע confluent במידה רבה על ידי יום 10 (איור 2, יום 10). המושבות iPSC הראשון יכול להופיע מוקדם ככל יום 11 (איור 2, היום ה-11); עם זאת, מושבות לא ייתכן נצפות עד היום ה-18. בדרך כלל, לפי ימים 15 – 18, יהיו מושבות iPSC גדול וברור כי נבדלים בבירור שמסביב, שהיישום מחדש fibroblasts (איור 2, היום 15 ו- איור 3, יום 17). Immunostaining של דה מרקר pluripotency טרה-1-60 ניתן לבצע כדי להעריך את יעילות התיכנות (איור 3, יום 17, טרה-1-60). מניסיוננו, רוב קווי פיברובלסט תשואות מאות מושבות לכל מחדש טוב (איור 3, כניסה B).

ציפוי שיוצרת צפיפות היא הסיבה הנפוצה ביותר עבור יעילות מופחתת של התכנות בפרוטוקול שלנו, קשורה לעיתים קרובות עם fibroblasts שאינם נגועים, senescent, ו/או מעבר גבוהה. אם ציפוי צפיפות נמוכה מדי, יהיו תיקונים עקרה acellular גדול בקצה של התכנות (איור 4C), ויוצרים מושבות iPSC עשוי לא (איור 4D). התאים היו צריכים להיות מאוד confluent עד יום 14 (להשוות איור 4A , 4B איור 2, יום 14). באופן דומה, אם התאים נמצאים מצופה גם בצפיפות או להתרבות מהר מדי, התכנות יעילות באופן דרמטי מוקטן.

כדי לשמור על הומוגניות של החולה, נגזר iPSCs, חשוב להרחיב שורות תאים של מושבה בודדת. מאחר התכנות יעילות גבוהה מאוד של התקנון שלנו, השכנה iPSC מושבות ייתכן בסמיכות ולצמיחתם לתוך כל עוד (איור 3, ימים 15-17). זה לפעמים מקשה להפרדת מכנית מושבה בודדת עבור משובט הרחבה. מצאנו כי זה עוזר מותכים מחדש ובכן, למהול אותו על פני שטח גדול יותר תרבות. יחס טוב מעבר מורכבת באופן שווה פיצול צלחת 6-ובכן-תבנית reprogrammed ברחבי צלחת 6-ובכן כולו.

בעקבות המעבר דילול, iPSCs ינבכ מושבות והם שקל להבחין fibroblasts (איור 5, היום ה-18). בתחילה, ניתן לארוז iPSC מושבות רופף ויש תאים בודדים cytoplasmic שטח גדול יחסית. במהלך 4-7 ימים, iPSCs להתרבות ויוצרים מושבה בחוזקה וגדוש האופייני עם קצוות מוגדרים. תאים בודדים בתוך המושבה יש חלק גרעיני גדול עם nucleoli (איור 5, ביום 22). הם היו מושבות רבות שיוצרות היטב כל, רק אלו עם מורפולוגיה iPSC קלאסי לאסוף להרחבת.

איור 1 : תכנות מחדש של האדם fibroblasts לתוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs). עבור התכנות של האדם fibroblasts פרוטוקול סכמטית מוצג. Fibroblasts הם passaged קודם על צפיפות נמוכה לבאר של תבשיל תבנית 6-ובכן, ואחריו transfections שבע שבוצעו במרווחים של 48 שעות. בינוני הוא הוחלף 16 – 20 h אחרי כל תרביות תאים. IPSCs היו הם passaged לראשונה כ יום 18 ולאחר המשובטים מושבות נאספות על ידי יום 26. בדרך כלל, נגזר פיברובלסט iPSC קווים שיכול להיות קפוא לאחסון לטווח ארוך על ידי ביום ה-38. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : להחליפן בתמונות מדי יום במהלך כל יום של התכנות. Fibroblasts צריך להיות כ- 40 – 60% confluent בזמנו של המעבר ליזום התכנות (יום 0, התאים הם מצופים בקערה 10 ס מ). תרביות תאים הראשונה (T1) מתרחשת ביום 1, התאים אמורה להופיע דליל מאוד בשלב זה. למחרת (יום 2), מורפולוגיה מעוגל יותר צריך להיות ברור. התאים ימשיכו להגדיל בצפיפות לאורך כל הפרוטוקול עם אשכולות iPSC מתחיל להופיע מוקדם ככל יום 11 (בעיגול אדום). ביום 15, מושבות iPSC יהיו גדולים עם גבולות דיסקרטי. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : הקמת המושבה בעקבות transfections עם התכנות שונה mRNAs ו miRNA מחקה. ההגדלה נמוך תמונות נלקחו של נציג התכנות בימים 15 – 17. בעקבות תרביות תאים הסופי, יהוו iPSCs היו מושבות ברור עם גבולות מוגדרים להרחיב במידה ולא לדחוס להיות נבדל ברור כי היו fibroblasts שמסביב. Immunostaining של דה מרקר pluripotency טרה-1-60 מעיד על קיומם של iPSCs (שיבוץ A) והוא יכול לשמש עבור חישוב של התכנות יעילות על ידי ספירת כל המושבות בתוך לבאר בודדת (שיבוץ B, דוגמאות של המושבות אפשר לספור בעיגול ירוק). סרגל קנה מידה = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : להחליפן בתמונות של צפיפות תת אופטימלית ציפוי עבור התכנות. (A, B) דוגמאות fibroblasts כי הם דלילים מדי ביום 14 של התכנות (להשוות איור 2, יום 14). (ג) הגדלה נמוכה התמונה ביום 17 של התכנות עם תיקון גדול, עקרה בעיגול אדום. (D) הבאר אותו היה קבוע, מוכתם TRA-1-60 לאשר המסכן הכוללת התכנות יעילות עקב צפיפות התאים נמוך. גודל ברים = 200 מיקרומטר (A, B), ו- 1 מ מ (C, D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : להחליפן בתמונות של iPSCs לאחר המעבר הראשונית- לאחר השלמת transfections עם התכנות ששונה mRNAs ו miRNA מחקה, מחדש תאים הם passaged לפי ימים 17 – 20. iPSCs יש יתרון צמיחה בינוני PSC, במהירות לעקוף כל fibroblasts זה היו שהיישום מחדש. בתחילה, iPSCs יהוו מושבות שעלולים להופיע עם גבולות מוגדרים היטב. בתוך ימים אחדים, התאים במהירות להתרבות ולקחת על המורפולוגיה האופיינית של תאים אציקלוביר עם יחס גבוה של הגרעין אל הציטופלסמה, התקבצות בחוזקה לתוך המושבות עם גבולות ברורים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה הרלוונטית קלינית, ללא שילוב, המבוסס על ה-RNA, המאפשר התכנות של פיברובלסט אנושית רגילה, הקשורים למחלה קווי לתוך iPSCs יעילות גבוהה במיוחד. עד כה, כל שורה פיברובלסט האנושי שניסינו לתכנת עם פרוטוקול המתואר הניב מספר מספק של iPSCs באיכות גבוהה עבור יישומים במורד הזרם. IPSCs וכתוצאה מכך יכול מיד להיות מועברים והתרחבה בתנאים מזין ללא תרבות.

איכות fibroblasts עבור התכנות:

התכנות ההצלחה תלויה בכבדות איכות מתחיל fibroblasts. באופן אידיאלי, התכנות צריך להיות יזם עם fibroblasts המעבר הנמוך ביותר הזמינים להשיג את היעילות הגבוהה ביותר. התכנות יעילות היא הטובה ביותר עם fibroblasts מעבר 2 – 4. התכנות עדיין יכול לעבוד עם גבוהה-מעבר (פסקה 5-8), אפילו senescent fibroblasts, אמנם עם יעילות מופחתת לפעמים נמוך-המעבר fibroblasts אינם זמינים או דגימות החולה יש מוטציה גנטית אשר מונע גידול בריא. במקרה זה, אופטימיזציה של צפיפות ציפוי ראשוני עשוי להידרש. התכנות של פיברובלסט פרוץ קווי מזוהה בדרך כלל עם מוות של תאים מוגברת במהלך RNA transfections. כתוצאה מכך, התאים התכנות טוב יופיע להיות דליל על ידי ימים 10 – 14 של התכנות. אזורים גדולים acellular גם יהיה גלוי בתוך הבאר. אם זה המקרה, פרוטוקול התיכנות תצטרך להיות יזם מחדש עם מספר גדול יותר של ההתחלה הראשונית של fibroblasts. ציפוי תאי קלט 3,000 לכל טוב של תבשיל טוב 6 תבנית פועלת בעקביות לקווים פיברובלסט לרוב המבוגרים. עם זאת, הגדלת מספר ציפוי עד 5,000 – 10,000 (50,000 שורות senescent) עשוי לסייע לשיפור התכנות של המחלה-הקשורים דגימות, כפי שדווח ב- הפרסום הקודם שלנו⁸. לעומת זאת, תאי להגיע confluency מוקדם מדי יכול גם להיות עמידים בפני התכנות. אם תאים שעברו transfections עם התכנות RNAs להתרבות מהר מדי (כפי שקורה לפעמים עם ראשי fibroblasts neonatal), אתחול התכנות עם fibroblasts 500 לכל טוב של תבשיל טוב 6 תבנית⁸.

טיפול של המאגר תרביות תאים:

ה-pH של המאגר תרביות תאים (בינוני מופחתת-סרום לכוונן את רמת החומציות של 8.2) הוא בעל חשיבות עליונה כדי להשיג את היעילות תקנים האופטימלי הנדרש עבור זה התכנות פרוטוקול. מסיבה זו, מומלץ מספר אמצעי זהירות לגבי הטיפול של המאגר תרביות תאים. מצאנו כי חשיפה קצר אפילו המאגר תרביות תאים אוויר אטמוספרי משפיעה על ה-pH של המאגר. לכן המאגר תרביות תאים צריך להיות aliquoted לתוך מיכל בורג מכסה עם המרחב האווירי מינימלי (אנו משתמשים או 5 או 15 מ"ל פקקי בורג חרוטי צינורות). כדי להוסיף ולצמצם את החשיפה אוויר, להשתמש בכל מאגר תרביות תאים aliquot לכל היותר שני transfections. לבסוף, מאז pH השפעות הטמפרטורה, זה קריטי כי המאגר תרביות תאים הוא equilibrated כדי RT להרכבת מתחמי תרביות תאים. מומלץ לא לחמם את המאגר תקנים ל- 37 מעלות צלזיוס.

Passaging של iPSCs:

בעוד רבים שפורסמו קודם לכן להמליץ פרוטוקולים איסוף iPSC בודדים מושבות בסוף התכנות, שזה יכול להיות קשה להשיג היעילות של התכנות היא גבוהה מאוד או אם המושבות אשכול ביחד, כפי שקורה לעתים קרובות במקרה שלנו פרוטוקול. לכן, אם המושבות iPSC בסמיכות זו לזו, מומלץ קודם passaging את התאים כדי להפיץ מחדש iPSCs באופן ידני לפני מושבות. ישנם מספר יתרונות לביצוע שלב מעבר זה מוקדם. לפזר את המושבות נותן להם יותר מקום לצמוח, מניב מושבות הרבה יותר גדול עבור איסוף מאשר אחרת יכולה להיות מושגת בבאר המקורי. זה משפר באופן משמעותי את אחוזי הצלחה בהקמת קו iPSC שיבוט שנאספו. אנו מוצאים גם זמן תרבות נוספים עם fibroblasts, אמנם ביחס מדולל, שמופיע כדי לשפר את איכות ממוצעת של המושבות iPSC שנאספו. Fibroblasts שהיישום reprogrammed עשוי לספק תמיכה גורמים paracrine, אשר ממשיכים לעזור להקים את iPSCs ולהקל את המעבר ישיר לתוך תא מזין ללא תרבות תנאים. Fibroblasts והילברט. יש חיסרון צמיחה סלקטיבית בהשוואה ל- iPSCs כאשר תרבותי ב- mTeSR1 לכן, האוכלוסייה מזהמים תאי פיברובלסט הוא מדולל במהירות כדי כמויות זניח בתוך 3-4 קטעים.

רוק מעכבי כגון Y-27632 משמשים לעתים קרובות לתרבות שגרתית של האדם iPSCs. מצאנו כי תרבות בתדירות גבוהה ו/או ארוכה של כמה שורות iPSC עם Y-27632 יכולות להיות השפעות מזיקות על האיכות הכוללת. בעת שימוש צליעה passaging בשיטה, כגון עם EDTA, Y-27632 אין צורך לשמור על יכולת הקיום iPSC לאחר פיצול. . חיסלנו לחלוטין המדיה וחדשניות עם Y-27632 עבור כל iPSC בידוד, הרחבה או תרבות שגרתית

פרוטוקול מגבלות:

מגבלה אחת כדי לתאר RNA-הגישה המבוססת על התיכנות היא הראשונית העלות והמורכבות המשויכות הכנת ריאגנטים התיכנות. למרות תהליכי הכנה ליצירת mRNA ריאגנטים הם עניין של שגרה, היה בעבר תיאר (PCR, תמלול במבחנה , טיפול DNase, מיצוי, dephosphorylation, טיהור), מצטברת לייצור mRNA ריאגנטים הוא תהליך ממושך יחסית, לא טריוויאלי. אתגר מרכזי נוסף על פרוטוקול זה הוא הצורך transfect תאים כל 48 שעות, הגדלת עוצמת העבודה של פרוטוקול התיכנות. שיקולים אלו ייתכן שהעלות אם התכנות של רק כמה דוגמאות החולה רצוי. עם זאת, אם השיקול הוא הדור של iPSCs הרלוונטית קלינית או להשגת יעילות התיכנות מאוד גבוהה, הגישה המתוארת התיכנות מבוססי ה-RNA הוא אידיאלי.

לסיכום, תיאר יעילות גבוהה RNA בשיטה המבוססת על התיכנות נשענות על תרביות תאים ממוטבת יעילות סוג תאים סומטיים כדי לתכנת כפי שמתואר הפרסום הקודם שלנו⁸. פרוטוקול תרביות תאים RNA שהוצגו במחקר זה מכוון מאוד עבור fibroblasts העיקרי אנושי אך ניתן להתאימו באופן פוטנציאלי את סוגי תאים אחרים כדי לשפר את יעילות התיכנות של תאים סומטיים שונים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid templates for PCR
pcDNA3.3_KLF4	Addgene	26815
pcDNA3.3_SOX2	Addgene	26817
pcDNA3.3_c-MYC	Addgene	26818
pcDNA3.3_LIN28A	Addgene	26819
pCR-Blunt_hM3O	Addgene	112638
pCR-Blunt_hNANOG	Addgene	112639
pCR-Blunt_mWasabi	Addgene	112640
Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics
Forward Primer	Integrated DNA Technologies	TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG
Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale)	Integrated DNA Technologies	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA
(ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G	New England Biolabs	S1411S
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix	Agilent	600850-51
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate	Trilink Biotechnologies	N-1014
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289L
DNase I	NEB	M0303S
MEGAscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	AM1334
Pseudouridine-5'-Triphosphate	Trilink Biotechnologies	N-1019
Riboguard RNase Inhibitor	Lucigen	RG90910K
RNA Clean & Concentrator	ZymoResearch	R1019
Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000684
Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000715
Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000717
Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000718
Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000719
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated)	Fisher	AM9937	Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics
Fibroblast culture and reprogramming
0.1% Gelatin in H2O	StemCell technologies	#07903
Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System	EMD Millipore	SCGVU05RE	Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS
2-Mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
6-well plates (tissue culture treated)	Corning	3516
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Fetal Bovine Serum	Fisher	26-140-079
FGF Basic	ThermoFisher Scientific	phg0263
GlutaMax Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061	Glutamine supplement used for the prepration of media
Heat Inactivated FBS	Gibco Technologies	10438026
KnockOut Serum Replacement	ThermoFisher Scientific	10828010
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778500	The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent
MEM	ThermoFisher Scientific	11095080
MEM Non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140050
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985070	Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062	Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL
10 M NaOH	Sigma-Aldrich	72068	Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated)	Fisher	AM9932	Use to dilute NaOH and wash a pH meter
Pen/Strep/Fungizone	GE Healthcare	SV30079.01
rhLaminin-521	ThermoFisher Scientific	A29248	Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies	14190144
Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red	Life Technologies	2520056
Vaccinia Virus B18R (CF)	ThermoFisher Scientific	34-8185-86
iPSC culture
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs
EDTA, 0.5 M stock solution	K&D Medical	RGF-3130	Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts
Antibodies and Detection
Rabbit anti Mouse (HRP conjugated)	Abcam	ab97046
Tra-1-60 (mouse anti human)	Stemgent	09-0010
Hydrogen Peroxide (30%)	LabChem	LC154301	Dilute to 3% with PBS
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703100
Phosphate-buffered salin (PBS)	Hyclone	SH30258.02	Supplied as 10x, dilute to 1x
VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4800
Special Equipment
Description			Notes
Biological safety cabinet
Regular humidified tissue culture incubator			Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37 °C.
Tri-gas humidified tissue culture incubator			Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Use for the reprogramming procedure.
pH Meter			Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible.
Inverted microscope			Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency.