גישה זו לא משוחדת של דגימה TEM מקטעים במדעי המוח

Summary

אנחנו מציגים את הרומן זרימת עבודה מיקרוסקופ אלקטרונים החקירות של רקמת המוח. השיטה מאפשרת למשתמש לבחון תכונות עצביים בצורה לא משוחדת. לצורך ניתוח היסודות, אנו מציגים גם קובץ script automatizes רוב זרימת העבודה עבור דיגום אקראי.

Abstract

חקירות של התכונות ultrastructural של הנוירונים, הסינפסות שלהם אפשריים רק עם מיקרוסקופ אלקטרונים. במיוחד עבור הפצות של תכונות כגון השוואתית של השינויים בצפיפויות, פרוטוקול דגימה לא משוחד חיוני עבור תוצאות אמינות. כאן, אנו מציגים זרימת עבודה עבור רכישת התמונה דגימות המוח. זרימת העבודה מאפשר דגימה אקראית שיטתית אחיד בתוך אזור המוח מוגדר, התמונות ניתן לנתח באמצעות של disector. טכניקה זו היא הרבה יותר מהר מאשר בדיקה נרחבת של מקטעים טורי אבל עדיין מציג גישה אפשרית כדי להעריך את צפיפויות ואת הפצות של תכונות ultrastructure. לפני הטבעה, סעיפים מוכתמים vibratome שימשו כנקודת התייחסות לזהות את האזור במוח תחת חקירה, אילו עזרתי להאיץ הכנה הכוללת הדגימה את תהליך. גישה זו שימשה השוואתי לחקור את ההשפעה של סביבה מועשרת-דיור על מספר פרמטרים ultrastructural במוח העכבר. בהתבסס על השימוש המוצלח של זרימת העבודה, שינינו אותה למטרת ניתוח היסודות של דגימות המוח. אנחנו אופטימיזציה הפרוטוקול מבחינת הזמן של אינטראקציה של המשתמש. אוטומציה של כל השלבים גוזלת זמן באמצעות קומפילציה קובץ script עבור תוכנת קוד פתוח SerialEM מסייעת למשתמש להתרכז העבודה העיקרית של רכישת המפות היסודות. כמו זרימת העבודה המקורית, שילמנו תשומת לב את הגישה מוטים הדגימה כדי להבטיח תוצאות אמינות.

Introduction

במיקרוסקופ אלקטרונים, לעתים קרובות מאתגרת לדגימת אזורים נציג בתוך הסעיפים. אנו, כצופה, לעיתים קרובות מוטים להסתכל על אזורים ספציפיים נמשך לידיעתנו על ידי תכונות בולט של המדגם, מניעת מדגם יופץ. ובכן, לא משוחד. דגימה מוטה יכול רק להימנע אם כל חלק של האזור עניין מקבל את ההזדמנות אותו בסוף אלקטרון micrograph¹. זה אפשרי למנוע דגימה מוטה ללא פתרון תוכנה, לדוגמה, על-ידי לחיצה על כדור העקיבה של המיקרוסקופ באופן ידני בלי להסתכל התמונה, כדי לבחור אזורי דגימה בכל מקום הבמה עוצר. אבל הצר, זה לא הליך אקראית, כי, במודע או שלא במודע, המשתמש יכול להשפיע על תנועת הבמה, ואת, יתר על כן, זו אינה דרך מתוחכמת של בחירת אזורים הדגימה. דגימה אקראית הופך להיות חשוב במיוחד אם זוגות של מקטעים משמשים כדי להעריך את מספר מבנים אמצעי מסוים, לדוגמה, עבור stereology¹, אשר דורשת זוגות של מקטעים, במרחק ידוע מזה. זה גם יהיה אפשר להסתכל רק מקטע יחיד להעריך את מספר מבנים ספציפיים², אבל עם גישה זו חוקרים נוטים להפריז הצפיפות המספרי של מבנים גדולים יותר, אלא אם המבנים הם קטנים מאוד השוואה עם העובי סעיף. גישות חלופיות הן לשחזר אמצעי אחסון של רקמות ממקטעים טורי, וכך לקבל את הנתונים הרצויים³. אבל זה זמן מאוד לצרוך וגישה לא ריאלי לחקר השוואתי (גדול).

כדי להתגבר על בעיות אלה, פותחו זרימת עבודה המאפשר החוקר לבחור דוגמאות להשגת אלקטרון micrographs-מרווח קבוע בתוך סעיפים דקים. המיקום של micrographs אלקטרון הוא אקראי, ומאפשר דגימה לא משוחדת. הגישה מתאימה הן לקביעת צפיפות המספרי של מבנים (לדוגמה, הסינפסות בתוך מסוימים מורכב נפח^4,5), את הממדים של תכונות מבניות (לדוגמה, רוחב החריץ סינפטית, או הקוטר של צפיפות postsynaptic^4,5).

זרימת העבודה משתמשת נקודה אקראית מחוייט דגימה תוכנה (RPS) (שנכתב ב Java script באמצעות Scripting התוכנה שסופקה עם מיקרוסקופ שלנו) מחשב באופן אוטומטי עמדות ברשת בתוך אזור מוגדר מראש של עניין מקטע דקים. התוכנה RPS עוברת את השלב של מיקרוסקופ אלקטרונים נקודות מוגדרות מראש אלה, כך micrograph אלקטרון יכול להתבצע בכל נקודה. ראשית, המשתמש מגדיר אזור עניין בתוך המקטע דק. לאחר מכן, התוכנה RPS מחשב עמדות ברשת בתוך אזור זה. ה-x / y הקואורדינטות של העמדה הראשונה נוצרות באופן אקראי, ועל המקומות הנותרים ממוקמים במרווחים רשת רגיל בכל הנוגע העמדה הראשונה. כי כל חלק של האזור של עניין יש אותו סיכוי של נבדק, הדבר מאפשר איסוף נתונים מינימלית. גישה זו של דגימה נקראת גם דגימה אקראית שיטתית אחיד (ראו הפניות^6,7 לפרטים נוספים).

לקביעת הצפיפויות המספרי של מבנים, אנו עובדים עם זוגות של מקטעים הנמצאים מרחק ידוע בנפרד. לאחר קבלת micrograph אלקטרון מהסעיף הראשון באחד המיקומים מראש, סעיף טורי TEM תוכנה (החלק של חבילת התוכנה שקיבלת עם מיקרוסקופ אלקטרונים שלנו) עובר עד לנקודה המתאימה במקטע השני, על מנת להשיג micrograph של אלקטרונים של המיקום המתאים. זה חוזר על עצמו עבור כל מיקום ברשת מוגדר מראש. בגישה שלנו, disector משמש כדי לספור את מספר החלקיקים בכל צמד אלקטרון micrographs^8,9. Disector כולל זוג ספירת מסגרות, אחד עבור כל סעיף^8,9. הצפיפות המספרי של אובייקטים נקבעת על-ידי רק לספור חפצים גלוי במקטע הראשון (או התייחסות בסעיף) אך לא על המקטע השני (או סעיף בדיקת מידע). פעולה זו מאפשרת להעריך את צפיפויות המספרי של אובייקטים דרך מהירה ויעילה^8,9. בנוסף על מקטעים בודדים, תכונות מבניות מימדי ניתן למדוד.

אנחנו החלת זרימת עבודה זו בהצלחה כדי להעריך את ההבדלים במספרים סינפסה בהיפוקמפוס של עכברים שנחשפו לסביבת מועשר (EE) לעומת הסביבה סטנדרטי (SE) דיור התנאים^4,5, מתנאי הדיור גם להעריך את ההבדלים ultrastructural בין פראי סוג (WT) עכברים neuropeptide Y (NPY) KO עכברים נשמרים תחת SE ו הנדסת חשמל⁵. היעד שלנו היה להסתכל באופן ספציפי על תכונות מבניות של הנוירונים, כגון דחיסות סינפטית מספריים, המרחק של אזור פעיל בחתכים ושל צפיפות postsynaptic, רוחב החריץ סינפטית, ומספר הסינפטיות, כדי להעריך שינויים בקישוריות העצבית והפעלה בין התנאים ניסיוני שונים. בנוסף, היינו מעוניינים הצפיפות המספרי של ליבה צפופה שלפוחית (DCV) בנוירונים כדי לקבוע את כמות neuropeptides המאוחסן באזור מסוים במוח.

בהתבסס על ההצלחה של הגישה שלנו עבור המחקרים שתוארו לעיל, בשלב הבא שלנו, אנחנו הסתגלו שלנו זרימת העבודה כדי לבחור אזורים לא משוחד מנתח היסודות בתוך דגימות המוח האנושי. זה נעשה כדי התמונה ברזל, אשר מאוחסן בקשירת ברזל המולקולות של נוירונים ותאי גליה. בשביל זה, חיברנו קובץ script אשר אפשרה לנו להפוך לאוטומטי רוב הפעולות עבור תהליך ההקרנה אקראי סעיפים המוח באזור מוגדר.

Protocol

כל ניסויים אושרו על-ידי ועדת אתית הפדרלי משרד המדע, המחקר של הרפובליקה האוסטרית (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 ו- BMWF-66.010/0037-II/3b/2013), או ועדת אתיקה של האוניברסיטה הרפואית של גראץ, מספר 28-549 ex 15/16, וניצח על פי ההנחיה של המועצה האירופית קהילות של 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC) ואת ההנחיה של הפרלמנט האירופי ושל המועצה של 22 September2010 (2010/63/האיחוד האירופי). הניסויים בבעלי חיים היו עיצב וביצע כך מספר בעלי החיים שבהם משתמשים היה ממוזער.

1. ניתוח של קיבוע של הרקמה

1. המתת חסד עכברים (21 שבועות הישן, נקבה C57BL/6J עכברים, C57BL/6N עכברים; עכברים WT ו NPY KO זכר על C57BL מעורב / 6:129 / SvJ (1:1) רקע בהתאמה) על ידי הזרקת פנטוברביטל 150 מ"ג/ק"ג intraperitoneally.
2. הסר את השכל של הגולגולת, מייד חותכים אותם לשניים (להפריד בצד שמאל בין האונה הימנית) - באמצעות אזמל.
3. מיד למקם את החצאים לתוך מיכלי זכוכית עם 2% פורמלדהיד, גלוטראלדהיד 2.5% ב- 0.1 M cacodylate מאגר (CH₃)₂אסו₂Na·3H₂O, pH להתאים ל- 7.4 עם 1 מ' NaCl), pH 7.4 ב 4 º C.
   התראה: כתות ומייצבים רעילים, צריך להיות מטופל בקפידה רבה. השתמש רק עם כפפות מגן מתחת למכסה המנוע fume.
4. לתקן את החצאים המוח 2 ימים ב- 4 ° C ולשטוף אותו למאגר לפחות 24 שעות, גם ב 4 º C. היקף המאגר צריך להיות על tenfold נפח דגימה.

2. לזהות את האזור של עניין בתוך המוח על-ידי השוואת סעיפים Vibratome עם הפניה קטעים מן העכבר מוח אטלס¹⁰

1. המקום המדגם המוח אל vibratome. ודא הכיוון של המוח נכון (במקרה זה, כיוון הילתית נבחרתי ההיפוקמפוס).
2. לקצץ עד לאזור של הריבית (ROI) במוח. לחתוך את הסעיפים-עובי גדול (למשל., 100 מיקרומטר) עד החלק של המוח עם האזור עניין מתמלאת, לזרוק את כל קטע.
3. להתחיל לחתוך הסעיפים vibratome עם עובי 20 מיקרומטר בתחילת החלק במוח עם רועי ולמקם את הסעיפים vibratome על משטח זכוכית. תכתים אותם (Nissl כתם) על-ידי הצבת את המקטעים לתוך 0.05% אצטט thionine סודיום אצטט מאגר, 4.2 pH עבור 1 דקות (איור 1Ai).
4. להשוות את סעיפים מוכתמים בהרי האטלס מוח העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור ולהמשיך הביתור ועל צביעת עד הקואורדינטות במוח הרצוי נגישים.

3. קבלת את אזור הדגימה להטבעה

1. ברגע המקום הנכון מזוהה, להתחיל חיתוך מקטע אחד ב 150 עובי מיקרומטר עם vibratome.
2. Microdissect בסעיף vibratome זה עם סכין גילוח תחת המיקרוסקופ סטריאו. לחתוך את החלקים סביב רועי. המקטע צריך להיות בגודל מתאים עבור הכנה בשלבים הבאים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) (לא יותר מ- 1 x 1 מ מ²).

4. TEM הכנה - הטבעה, דקים חלוקתה ולא מכתים

1. הטבעה
   1. פוסט-תיקון עבור 2 h ב- 2% אוסמיום ארבע-חמצני בטמפרטורת החדר (RT). השתמש אמצעי כדי לכסות את הדגימה לפחות 10 פעמים נפח דגימה, אך להימנע משימוש עודף לשבועיים כדי למנוע פסולת רעילה מיותרים.
      התראה: אוסמיום ארבע-חמצני רעיל מאוד ויש לטפל באהבה רבה. השתמש רק עם כפפות מגן מתחת למכסה המנוע fume.
   2. מייבשים בעזרת EM כיתה כהלים בשלבים למינימום 20 שימוש של נפח גדול יותר מזה בשלב הקודם (50%, 70%, 80%, 96% ו 100% אתנול).
   3. הכנס פרופילן אוקסיד למשך 40 דקות במקום RT. לתערובת של פרופילן אוקסיד/הטבעה שרף (1:2) עבור 2 h ב- RT ולינה 1:3-4 מעלות צלזיוס.
      התראה: פרופילן אוקסיד הוא רעיל מאוד, צריך להיות מטופל בקפידה רבה. השתמש רק עם כפפות מגן מתחת למכסה המנוע fume.
   4. להטביע את הדגימות שרף 100% על-ידי שינוי השרף 2 פעמים אחרי 60 דקות ואחרי פעם אחת 90 דקות (כל ב 45 מעלות צלזיוס).
   5. לבסוף, למקם את הדגימות לתוך התבניות נכונה ולתת שרף פולימריזציה ב 90 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים (כלאיור 1).
2. זמירה, Sectioning על ultramicrotome.
   1. חתוך את הבלוק, המבטיח כי הצדדים אינם ככל האפשר עבור הסעיפים לדבוק אחד בשני (איור 1וואייי).
   2. התוצרת 55 ננומטר דקים טורי מקטעים (צריך להיות כסף אפור) משתמש של ultramicrotome. השתמש ברשת חריץ (חריץ רוחב 1 x 2 מ מ) מצופה pioloform (איור 1Aiv).
3. Counterstain סעיפים דקים על הרשתות חריץ באמצעות 2% uranyl אצטט עבור 30 min וציטראט עופרת עבור 30 s ב RT (זוהי שיטה סטנדרטית מיקרוסקופ אלקטרונים¹¹).
   התראה: Uranyl אצטט הוא רעיל מאוד, כדאי להימנע מגע ישיר. לטפל רק עם כפפות מגן. חנקת עופרת רעיל אם לבלוע או בשאיפה צריך להיות מטופל בקפידה רבה.

5. הדמיה של ROIs המתאימים על ההפניה ומקטעים בדיקת מידע ב- TEM עם חבילות תוכנה

1. לבחון את הסעיפים על הרשת עם TEM באמצעות הגדלה נמוכה (בהתאם לגודל של הסעיפים) לאוריינטציה וכן להעריך את האיכות של הסעיפים.
2. להפעיל את התוכנה (חבילה של תוכנות ניתוח תמונת TEM, או TIA, שסופקו עם מיקרוסקופ) כדי להפיק תמונות וירטואלי של הסעיפים על-ידי אחסון נקודות הפינה של הסעיפים. המאפשר את התוכנה כדי למצוא את המיקום המתאים של רועי על כל מקטע.
   1. לעבור למדור ובחרו ' הוסף כדי להוסיף נקודות הפינה עבור המקטע הפניה, בדיקת. בצע את ההוראות של החלון המוקפץ. נתחיל עם החלק התייחסות ולאחר מכן המשך עם המקטע בדיקת מידע. ודא כי הזנת בקצוות של המקטע מקבילים לסעיף הבא כנקודות 1 ו- 2 (איור 1Bi).
   2. דמיינו החלק התייחסות תחת הגדלה נמוכה לזהות את האזור של ריבית ולעבור לבמה מיקרוסקופ באמצעות טיה על החלק התייחסות לנקודות פינה מרובים של רועי כדי ליצור חלוקה לרמות של רועי.
   3. להקליט את הקואורדינטות של המצולע שהתקבל באמצעות תוכנה RPS . בשביל זה, לחץ על הוספת קואורדינטות בתיבת הדו-שיח של התוכנה RPS בכל נקודה של המצולע הדרוש כדי לחלק לרמות את רועי בסעיף (איור 1Bii).
   4. להגדיר ולהזין בגודל מתאים עבור אזורים דגימה ו מרחקים בין האזורים לתוך תוכנת RPS (במחקר הציג, הגודל של האזורים דגימה מיקרומטר 7 והוא המרחק ביניהם 20 מיקרומטר, וכתוצאה מכך לפחות 20 אזורי הדגימה רועי). העיתונות לחשב רסטר, ואז התוכנה יוצרת קואורדינטות אזור הדגימה באופן שיטתי אקראי אחיד לתפקידים של micrograph בתוך המצולע (איור 1ביל).
      הערה: לאוריינטציה טוב יותר, את המצולע ואזורי הדגימה בתוך המצולע יכולים להיות מוצגים על ידי תוכנת RPS (איור 1קצת).
3. לאחסן את נקודות דגימה בסעיף הפניה, בדיקת שימוש RPS ותוכנות סעיף טורי TEM . אלו נקודות הציון של montages אשר נרשמים אחרי¹¹.
   1. בתוכנה RPS, הקש ללכת למיקום הבא כדי לעבור את השלב מיקרוסקופ x / קואורדינטות y של כל דגימה אזור במקטע הפניה. ללכת מיקום הכנס לייבוא הקואורדינטות בתוכנה במקטע הפניה. חזור על הפעולה עבור כל נקודות הציון.
   2. לשקף את הקואורדינטות מהמקטע ההפניה לתוך מקטע בדיקת, עבור אל המקטע ולחץ על ' עבור לסעיף'. הזן את מספר הסעיף בדיקת (בדרך כלל ' 2') בחלון שיח.
   3. עבור ההקלטה של montages (ראה שלב הבא), לעבור בין המקטע הפניה, בדיקת כמתואר לפני ושינוי העמדה על החלק התייחסות עם מיקום , סעו למספר. לבחור הקואורדינטה הבאה בחלון שיח.
   4. עבור montages SerialEM כל הדגימה לתאם, ללכת קובץ ולבחור מצרף חדש מתוך התפריט הנפתח. בחר את המספר הנכון של אריחים ואת אחוז החפיפה בחלון שיח. את ההווה לומדים, הגדלה של 5000 X מספיקה לזהות את התכונות סינפטית תחת מחקר, אבל שדה הראייה מוגבל של מצלמה CCD נדרש ביצוע montages של 2 x 2 תמונות. Montages נעשים עם SerialEM.
   5. לפני הקלטת כל מונטאז, להתאים מחדש את המוקד, או, במידת האפשר, הפעל את אפשרות פוקוס אוטומטי בתוכנת הצריבה. בחר את התיקיה כדי לשמור את הקובץ מונטאז ולהתחיל את ההקלטה של העריכה על ידי לחיצה על התחל בתפריט המשנה ' מונטאז ' משמאל ב- SerialEM.

6. לנתח את התמונות TEM עם ImageJ את המסמך Ultrastructural תכונות.

הערה: בגלל זה, חשוב ליצור אוסף מיושר תמונות מהסעיף הפניה, בדיקת.

1. להמיר את התמונה-הזוגות עם ImageJ תמונות מחסנית לתוך קובץ מחסנית וליישר את התמונות עם StackReg (חייב להיות מותקן של ביג-EPFL http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; במקרה הנוכחי, האלגוריתם Affine היה בשימוש). לקבלת מספרי הצפיפויות של תכונות מבניות הסלולר, המאקרו מחוייט ImageJ Disector יוצר מסגרת ספירת בגודל של 5.5 x 5.5 מיקרומטר המונחות בצורה אקראית על התמונה עם זווית אקראי.
2. להפעיל את המאקרו Disector (מיקום בתפריט ImageJ תלוי הספריה בה נשמרה) מגדירים את הפרמטרים (גודל המסגרת ספירת מספר מקטעי) ככל הדרוש (איור 1Cii).
3. לספור את מספר סינפסה/מיקרומטר² באמצעות את Disector. לספור בכל סינפסה בתוך מסגרת ספירת גלוי במקטע הפניה, אך אינם גלויים במקטע בדיקת מידע. להשמיט את הסינפסות המצטלבים עם שני 'אסור קווים' של disector; אבל נחשב הסינפסות-מול 'קווי הקבלה' בשביל זה, השתמש בכלי Multipoint ממוקם על Toolsbar ב ImageJ (איור 2א, איור 2B).
4. למדידת פרמטרים סינפסה, בחר רק את הסינפסות עם בקע סינפטית אוריינטציה חתך (על החלק התייחסות; בתוך המסגרות באותה התמונה המשמש את disector).
   1. להפעיל את התוסף ObjectJ ImageJ מתוך התפריט הנפתח (איור 2א) באמצעות תוספים | ניתוח. פתח פרוייקט חדש מתוך תיבת הדו-שיח נפתחת ObjectJ. פעולה זו תפתח חלון המאפשר למשתמש למבנים חלוקה לרמות ומארק עם סמן הכלי (איור 2B, עיגול אדום). הפרמטרים סינפטית המשמש את הניסויים שהוצגו כאן מתוארים השלבים הבאים.
   2. למדוד את האורך של קרום presynaptic ואורך צפיפות postsynaptic על ידי ציור קו לאורך המבנה באמצעות הכלי סימון (איור 2B, עיגול אדום).
   3. להשיג את הרוחב הממוצע של החריץ סינפטית על ידי ציור המצולע מכסה הן ממברנה קדם ו postsynaptic, ועם הצדדים ישר מקביל מידוויי קו מקוטע, קו מקביל לממברנות בשני.
   4. קביעת המספר של שלפוחית מעוגן, לספור כל שלפוחית שיש מרחק מרבי של קרום presynaptic של קוטר שלפוחית אחת או פחות.
   5. קביעת המספר של שלפוחית מעוגן, לספור האלה שלפוחית עם מרחק מרבי של שלפוחית אחת בקוטר של שלפוחית מעוגן מעוגן או אחרים על הסינפסה באותו.

7. בהפקת למחצה דק מקטעים עבור מיקרוסקופ אור לתכונות מאקרוסקופית המסמך (במקרה הנוכחי המספר הסלולרי) בתוך רועי אותו כמו נבחר לחקירה TEM.

1. מיד לאחר חיתוך הסעיפים דקים עבור TEM, חותכים שני מקטעים למחצה דק, 0.5 מיקרומטר סמיך, מיד סמוכים זה לזה. מניחים על משטח זכוכית, תכתים אותם באמצעות פתרון טולדין כחול 0.5%. במקום מכסה על הסעיפים (עם DPX הרכבה בינונית, המורכב distyrene, plasticizer (tricresyl פוספט) וכן קסילן). אלה שני מקטעים משמשים כדי לספור את מספרי הטלפון הנייד.
2. צילום הסעיפים למחצה דק בהגדלה נמוכה באמצעות מיקרוסקופ אור.
   הערה: המבנים תחת חקירה חייב להיות ניתן לזיהוי של תמונות. במחקר הנוכחי, 20 X הגדלה שימש לזיהוי תאי הגוף. במידת הצורך, יכול להיות תפר תמונות מרובות יחד עם תמונה בתוכנת עיבוד.
3. ליישר הזוגות של שני קטעים רצופים למחצה דק עם תמונה בתוכנת עיבוד (למשל., ImageJ).
   הערה: הבדלים של סיבוב וגודל (יכול להתרחש עקב דחיסה חפצים שהוצגו על ידי תהליך אופטים) צריך להיות מותאם עבור כיסוי מושלם בשני הסעיפים.
4. סימון הגבול של רועי על התמונה מיקרוסקופ אור. רועי חייבת להתאים רועי משמש את התמונות TEM. למטרה זו, לטעון את התמונות לתוך ImageJ ובחרו את הבחירה מצולע Toolsbar (איור 2א).
5. ליצור רשת מעל לתמונה כל שימוש ImageJ על-ידי פתיחת נתח | כלים | רשת ולהגדיר את הפרמטרים לפי הצורך.
6. לחשב את השטח והנפח של המצולע מתוך מספר נקודות הרשת בתוך האזור של ריבית ו סעיף עובי (נפח = N_{הפקולטה למדעי המחשב} * _GS * h_רחוב ; N_{הפקולטה למדעי המחשב} = ספרתי לחצות חלקים; _GS = גודל רשת; h_ST = סעיף עובי).
7. לספור את מספר גרעינים מגופים תאים עצביים בתוך רועי אם הם נמצאים רק בחלק אחד. בחר את הכלי Multipoint ב ImageJ מ Toolsbar ולסמן את התאים. לאחר ספירת התאים על כל סעיף, לחשב את מספר התאים לכל אמצעי אחסון (; ג_צפיפות = צפיפות התאים; ג_ספירת = ספירת תאים).
8. להקליט את כל המידות בחלון תוצאות ObjectJ (איור 2C). לייצא ולשמור אותם לשימוש נוסף.

8. שימוש ב- SerialEM Script כדי למטב לניתוח מוח הדגימות בשילוב עם DigitalMicrograph (מיט, המסופקים עם מסנן הדימות).

1. כוונון של הדמיה מסנן (GIF).
   1. טען את הדגימה TEM ושימוש ללכת אל חור במדגם עבור כוונון GIF על כדור העקיבה או הג'ויסטיק של המיקרוסקופ.
   2. מעבר אנרגיה מסונן TEM (EFTEM) ב- DM תוכנה/או DM ובחר מצלמת CCD DM.
   3. בחר את רמת ההגדלה לניתוח אלמנטלים (ההגדלה תלויה האזור/המבנה של ריבית; במקרה הנוכחי, ההגדלה הינו ממוקם במרחק של 76 ק עד 125 k). הגדר זמן החשיפה 0.001 s ולהתחיל תצוגה.
   4. ממקדים את הקרן בזהירות עד הקצוות ניתן לראות מרכז הקרן בתמונה. להקטין את הצמצם C2 / אובייקטיבית עד הקצוות של הצמצם גלויים, מרכז הקורה עם כדור העקיבה עבור הקרן.
   5. Defocus הקורה (סביב C2 46.2%, זמן החשיפה עבור כוונון צריך להיות סביב 0.05 s) ולמצוא אפס איבוד הפסגה (האזור) על-ידי לחיצה על לחצן האזור . להתחיל את ההליך כוונון על-ידי לחיצה על לחצן מלא מנגינה .
2. להשיג נקודות אקראיות של רכישה.
   1. לחזור TEM הדמיה מצב, בחר את המצלמה ולבדוק את המוקד בהגדלה 10 k (התאם ציר z ו מוגדר defocus בשכבות אפס).
   2. בחר LM 75 X הגדלה ובדוק אם המצלמה לא הוכנס (אחרת זה לא יכול להיות נשלט על ידי תוכנת SerialEM).
   3. SerialEM ומתחילים לפתוח פרוייקט חדש.
   4. פתח את ' ניווט '. בדוק את ההגדרות עבור מצלמה מצלמה & סקריפט פקדים (עבור תצוגה , רשומה) ולהתחיל תצוגה (המצלמה מוכנס באופן אוטומטי).
   5. כדי להפוך את פינה מפה של המקטע דקים, לבחור להוסיף נקודות בחלון הדפדפן.
      1. להגדיר את נקודות הפינה בקצוות של מקטע דקים. להעביר את הבמה לנקודת פינה על-ידי החזקת המקש הימני בעכבר. כאשר פינה של המקטע, להוסיף נקודת פינה עם לחץ על העכבר השמאלי. חזור על התהליך כדי להוסיף 3 נקודות פינה. ודא כי בחלון הדפדפן תיבת C עבור נקודות פינה הוא תיקתק על הנקודות מאוחסנות.
      2. כדי להתחיל את מונטאז פינה (עדיף בהגדלה LM 75), ללכת Navigator ב SerialEM-שורת התפריטים ובחר Montaging & רשתות , הגדרת פינה מצרף מתוך התפריט הנפתח.
         הערה: הטוב ביותר להתאים את ההגדרות עבור הפרמטרים הרשומה שבחרת מוצגים. לשנות אותם במידת הצורך. במקרה הנוכחי, רק אחוז החפיפה השתנה ל-20%.
   6. חלוקה לרמות הסעיף/רועי על התמונה מונטאז. לבחור להוסיף מצולע בחלון הדפדפן, המתאר את המקטע עם מספר נכון-לחיצות עכבר. לבחור רשת הוספה של נקודות בתפריט הנפתח navigator, מגדירים את המרחק בין הנקודות (המרחק תלוי בשאלת ניסיוני; למשל-, 10 מיקרומטר, איור 3).
   7. בצע את פקודות ה-script. הזן את מספר נקודות הרשת כפי שמוצג בחלונית ' ניווט ', הזן את מספר נקודות רכישה (למשל., 20).
   8. להגדיר את הסף תאורה כך התסריט יכול למנוע רשת ברים. בעקבות הפעלת פקודות script ולהעביר את הבמה באופן ידני כדי לכסות את שדה הראייה לפי רבעון אחד עם בר-רשת. לפי הערך המוצג, הזן ערך סף תאורה (צריך להיות גבוה יותר מהערך המוצג).
   9. המתן עד הנקודות עבור רכישת נבחרו וסיימה השגרה בישול.
      הערה: זה לוקח הרבה זמן, יכול להיות לילה; קובץ ה-script שולח המיקרוסקופ למצב המתנה לאחר שסיים את השגרה בישול; השגרה בישול חשוב לייצב בסעיפים כשקרן האלקטרונים.
3. אנרגיה מסונן לניתוח TEM (EFTEM)
   1. בחרו מצב EFTEM ב TIA/מיט ובחר מצלמת CCD DM.
   2. מרכז הקורה ופעל הפעלת פקודות script שיעביר את הבמה כדי לתאם כל דגימה.
      הערה: המשתמש יתבקש אם עליך להעביר את הבמה את הקואורדינטה הבא.
   3. ליישר אפס איבוד הפסגה (האזור) ולהגדיר C2 ~ 46.2%.
   4. הגדר את האנרגיה-60 eV (במקרה זה, הערך מוגדר איתור של M-הקצה Fe), לשסף בזמן 10 eV וחשיפה -0.4 ס' הוספה הסדק והגדר C2 ~ 43.9%.
   5. תתחיל התצוגה ולהתמקד את התמונה.
   6. הגדר C2 46.2%, ליישר את האזור ולקבוע C2 לחזור 43.9%.
   7. רוכשים את היסודות מפה עם היסודות הגדרות ספציפיות.
      הערה: ניתן להשתמש בהגדרות ברירת המחדל בתיבת הדו-שיח ' ייבוא ', אך מומלץ לבחון אלו מראש, במידת האפשר; דוגמה סינון תמונות מוצגות באיור4.
   8. הגדר C2 46.2% ולרכוש עובי מפה.
   9. חזור על כל רכישת נחוש הנקודות (שלב 8.3.2-8.3.12).
   10. בצע את ההוראות של התסריט ולקבל את micrographs אלקטרון יחיד או montages של נקודות רכישה. בחר את רמת ההגדלה כך כל (אולטרה-) מבניים המידע הוא גלוי/לזיהוי.
   11. שמירת קובץ יומן רישום, נווט וחלון התוצאות ולהסיר הסדק.
   12. סגור את השסתום, להסיר את הדגימה וכבה את TEM.

תוצאות

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה כדי לבחור את האזורים עבור TEM באופן אוטומטי, לא משוחד. המשתמש בוחר את תחום העניין בתוך מקטע דקים תחת TEM, ומשתמש מספר פתרונות תוכנה עבור זרימת העבודה לרבות התוכנה שלנו- RPS מחשבת באופן אוטומטי את הקואורדינטות של 20 אזורים הדגימה בתוך האזור של ריבית. לאחר מכן, השלב TEM מועבר בכל אזור הדגימה לצילום. זה אפשרי לניתוח מקטעים בודדים והן לניתוח זוגות של מקטעים, מרחק ידוע לגזרים, המאפשר בחירת אזורים עבור הדמיה ללא משוא הפנים של החוקר.

זרימת עבודה זו הוכיח בעל ערך לתיעוד תכונות ultrastructural העכבר מוח סעיפים^4,5. במחקרים אלה, השכבה תא פולימורף של הכישור משוננת (DGpl) נבדקה כאזור של עניין. השיטה שלנו הוכיחה עצמה מתאימים לבחינת את די. ג'י, כי קטע הילתית DG הגבי (Bregma −1.3) נכנס לתוך מקטע דקים שלו מתאר מזוהים בקלות בהגדלה נמוכה. אם באזורים אחרים במוח להיבדק, זה יהיה חשוב לבדוק את גודלם ואת להבחין בתכונות לפני תכנון הניסויים.

החלה של זרימת העבודה המתוארת כאן הראה כי דיור EE מגביר את רוחב החריץ סינפטיים באופן משמעותי ב- DGpl⁴, בכל הנוגע תנאי מגורים רגיל. יתר על כן, המספר של שלפוחית ליבה צפופה היה ירד באופן משמעותי הנדסת חשמל-שוכנו חיות⁴, המציין את השינויים בהבית של neuropeptides. כאשר עכברים knockout WT ו NPY הוחזקו בתנאים הנדסת חשמל, מספר הנוירונים/µm³ ב DGpl עלה בזמן צפיפות DCV ירד בכל הנוגע SE-דיור⁵. לעומת זאת, נוקאאוט NPY הביאה לעלייה משמעותית של הסינפטיות בבריכה מילואים (מעוגן הסינפטיות) עצמאית של דיור בתנאים⁵. ההשפעה של הנדסת חשמל על רוחב החריץ סינפטית התהפכה בקבוצה NPY KO וכתוצאה מכך הבדל משמעותי בין הנדסת חשמל-שוכן WT ו NPY KO עכברים⁵. נלקח יחד עם מחקרים התנהגותיים של WT ו NPY ההסתרה חיות נערכים תחת שני סוגי תנאי מגורים, מציין תפקיד מכריע של NPY על ההשפעות הנוירוביולוגי של הנדסת חשמל⁵.

להמחשת הברזל מאוחסנים במוח האנושי, תסריט נערך עבור תוכנה SerialEM יבחר באופן אקראי הנקודות של רכישת מ בתוך מקטע שלם ודק במיוחד, עם המטרה של השגת אנרגיה מסונן אלקטרון micrograph על כל אחת מהנקודות האלה . לאחר טעינת המקטע לתוך המיקרוסקופ האלקטרוני, ה-script לבצע הייצוב של הסעיף (כלומר., השגרה 'הדגימה-בישול') בן לילה. קובץ ה-script ואז נבחר באקראי מספר נקודות מוגדרות מראש על ידי המשתמש מאלה המסומנים על פומפיה באיור3. על-ידי הפקת מיקרוסקופ מבחן ובדיקת רמות האפור שלה, ה-script בדק אם הנקודות שבחרת היו ממוקמים על חלק גלוי של המקטע, דוחה את הנקודות שנחתו על רשת ברים. רוב זרימת העבודה טופלה על ידי ה-script עם אינטראקציה מינימלית של המשתמש. עם זאת, לא ניתן היה לרשום באופן אוטומטי אנרגיה מסונן micrographs (עם הגדרה זו), כמו גם מעט אור על השגרה פוקוס אוטומטי של SerialEM. לכן, החלפנו לתוכנה מיט ברגע התסריט היה עברה את השלב בכל נקודה, יש להתאים את המוקד ביד, ועשה תמונה EFTEM של ברזל. דוגמה לתמונה ברזל EFTEM פוסט-מורטם המוח האנושי מוצג באיור4.

איור 1. איור של זרימת העבודה. (א) השלבים העיקריים של הכנת המדגם מוצגים (בכיוון החץ): vibratome מקטעים (i), embedding(ii), חיתוך קטעים למחצה דק, דקים (iii), ותפיסה בזוגות סעיפים דקים על רשתות נחושת (iv). (B) שימוש הן של הספק מיקרוסקופ ותוכנות מחוייט RPS כדי ליצור נקודות הציון אזור הדגימה, הקובעות את האתרים הקלטה. נקודות הפינה של הסעיפים מאוחסנים התוכנה מיקרוסקופ, רועי המותווה (המזוהה עם העזרה של הסעיפים למחצה דק) (i); רשת של דגימה אזורים נוצר על רועי, שינוי אקראי (חץ אדום) הוא הציג ב- x ו- y. המשמרת הוא קטן יותר מאשר המרחק בין האזורים דגימה, (חיצים שחורים), כך במקום ריבועים שחורים, אשר להם אין shift, הריבועים הכחולים, אשר יוזזו באופן אקראי, משמשות לקביעת האתרים הקלטה (ii); רק דגימה אזורים בתוך גבולות רועי (מצוירים כריבועים כחולים) משמשים עבור הקלטה. Micrographs עשויים במקטע הפניה (ריבועים שחורים) והן במקומות המתאימים במקטע בדיקת מידע (ריבועים כחול) (iii). (ג) מיקרוסקופ נעשית על כל אזור הדגימה בהגדלה גדולה מספיק; מצרף המורכבת של מספר תמונות הממוזג הוא עשוי במידת הצורך (במקרה זה, 2 x 2 תמונות מוזגו יחדיו) (i); מסגרת ספירת הוא שנוצר שמוצג ככיסוי בתמונה, מבנים בתוך המסגרת, על "קווי הקבלה' (קווים מקווקווים מסגרת) תימנה, אבל לא אלה על"קווים אסורים"(מסגרת מלא שורות) (ii). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 . מדידת פרמטרים ultrastructural על זוג סעיפים דקים עם מסגרת ספירת לא משוחדת. (א) סקירה של החלונות ImageJ המשמש עבור ספירת וניתוח מבנים הסלולר. הצד השמאלי מציג את micrograph אלקטרון עם המסגרת ספירת ככיסוי. בצד ימין: בממשק המשתמש ImageJ (מלבן כחול) עם התפריט הנפתח (למעלה) ואת הכלים (להלן); עורך אובייקט ObjectJ (מלבן ירוק); חלון כלי ObjectJ (מלבן כתום) שבו ניתן לבחור בכלי למדידת לבין החלון ObjectJ תוצאות (מלבן שחור) שבו מתועדים כל המדידות. (B) פרט מן מציג הסינפסות מסומן ב- micrograph אלקטרון (הסינפסות על שני חלקים - חיצים; סינפסה רק על הסעיף בדיקת מידע-ראשי חץ). אלה מסומנות באמצעות הכלי Multipoint (עיגול אדום) של סרגל הכלים של ImageJ. (ג) שמות והפרמטרים מדידה של תכונות סינפטית מוגדרים באמצעות כלים ObjectJ. סמן-הכלי ואת התכונה עניין נבחרו והחלוקה לרמות נמשכו בתמונה משמאל-לחיצות עכבר לאורך המבנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3. בחירת דגימה אזורים למיפוי אלמנטלים בתוך ROI עבור אנרגיה מסונן במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. SerialEM משמש כדי לבחור אזור עניין להציע מספר גבוה של הדגימה האזורים במלון מרווח קבוע (ורוד צלבים של תמונות A ו- B). תסריט ואז בוחר באופן אקראי דגימה (של הקואורדינטות מוגדרת מראש) אזורים עבור רכישת. דגימה אזורים עם תאורה המסכן נדחות להימנע וברים רשת התחנות script ברגע 20 אזורים דגימה ומוארת נבחרו בתוך רועי. (א) סקירה של כל האזור של עניין, שתואר על ידי מצולע, עם מספר גבוה של הדגימה אפשרי אזורים המסומנים X. A של פרט (B) מציג את האזורים דגימה לפני בחירה אקראית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 4. דוגמה של רכישת היסודות מפה (EFTEM). (א) שדה בהיר micrograph TEM של האזור סביב נקודת רכישה. אזור שנבחרו באקראי שימש כדי להשיג מפה של היסודות, מסומן על ידי מלבן שחור. (B) EFTEM מראש קצה התמונה חלון לאזור שנבחרו באקראי. (ג) EFTEM פוסט-קצה התמונה חלון באותו האזור. (ד) מפה היסודות של ברזל באותו האזור (M-קצה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשר החוקר לקבל נתונים על תכונות ultrastructural בצורה לא משוחדת. . זה הרבה פחות לארוך זמן רב יותר נפח חקירות ממקטעים טורי. מספר יישומים שונים משמשים להשגת מטרה זו. בהתחלה, התוכנה שלנו- RPS בהזמנה אישית (עבור פרטים על זמינות, אנא צרו קשר עם המחבר המקביל) משמש כדי להציג את הבמה-משמרת אקראי כדי לבחור את הקואורדינטות אזור הדגימה. דבר זה מאפשר דגימה אקראית שיטתית אחיד של רועי. בשלב הבא, עבור ספירה של מבנים ספציפיים, שינינו את שיטת disector, שבו מושווים 2 חתכים רצופים עם מרחק ידוע, בדרך מקורית לעומת מחקרים קודמים^13,14,15 כפי שנהגנו שלנו RPS תוכנות עבור דגימה אקראית שיטתית אחיד. פעולה זו חוסכת זמן לעומת 3D-שחזור כל אמצעי אחסון ממקטעים טורי. התוכנה RPS בהזמנה אישית מפותחת במיוחד עבור סוג אחד של מיקרוסקופ הוא גורם מגביל לשחזור זרימת העבודה. חלופה מתוכנה מסוימת זו יהיה יישום זה מאפשר scripting, התואם לדגמים אחרים מיקרוסקופ.

אנחנו משתמשים בהצלחה גישה זו שלנו השוואתי^4,5. על חלקים דקים של הרקמה העצבית, תחום העניין היה המתוארים, התמונות צולמו על ידי דגימה אקראית שיטתית אחיד בתוך אזור זה. יש לציין כי האזור של עניין, השכבה פולימורף של הכישור משוננת, הוא אזור קטן למדי לחקור אשר עשוי להיות מועיל עבור הגישה שלנו. תוך disector המונחות, הערכנו את מספר DCV, מספר תכונות ultrastructural של סינפסות DGpl של עכברים בוגרים שוכנו SE, הנדסת חשמל, כמו גם למבוגרים WT עכברים לעומת עכברים knockout NPY למבוגרים. באמצעות הגישה שלנו, הנתונים שנאספו הראו שינויים בחלק מהפרמטרים ובדוקים. ממצאים אלה אישר על אלה מחקרים דומים אחרים חיות לנוער².

החיסרון של שימוש ניסיוני זרימת עבודה זו ייתכן כי ריבוי-application-גישה זו אינו אידיאלי מבחינת ידידותיות למשתמש, המשתמשים צריכים להרגיש בנוח עם ממשקי משתמש שונה (במקרה שלנו, הממשק למשתמש, סעיף טורי TEM RPS, ותוכנות SerialEM). ללמוד להתמודד עם כל היישומים בדרך יעילה נמצא זמן רב, צריך להילקח בחשבון. משקיע את הזמן בלימוד השימוש זרימת עבודה זו זאת, עדיין בבירור חיובית לאורך זמן אשר יש צורך לנתח כל אמצעי אחסון עם טורי מקטע TEM. השיטה של שימוש disector שבוצעה על-ידי שיטתית דגימה אקראית אחיד באזור עניין מספיקה להציג נתונים אמינים¹ ללא צורך לחקור את כמות גבוהה של חלקים/אמצעי האחסון.

על מנת למקסם התוצאה בלימודים, זה היה חיוני לקבל טיפול טוב במהלך הכנת הדוגמא, שימור הרקמה ולמבנים בלבד אינה קריטית להערכת תכונות מבניות, אלא גם לזיהוי האזור עניין חד משמעית. גורם מרכזי, אולי עוד חסרון של שיטה זו, היא כי באיכות גבוהה של זוגות סעיפים דקים נדרש: חייב להיות ללא חורים או קמטים כך שתכסה את האזור תחת חקירה באחד הסעיפים, ועל העובי סעיף להיות לשמור על הומוגניות. החוקר צריך להיות מאומנים היטב ultramicrotomy. טיפול יש גם יש לנקוט כאשר הדימות בסעיפים TEM, כפי הסעיפים רגישים נזק הקורה אלקטרון ולא ניתן להפריד בקלות. יתר על כן, חשוב לבחור את המספר הנכון של אזורים דגימה של רועי. בהתאם המטרה ניסיוני, ההגדלה של micrographs אלקטרון יש להגדיר בקפידה. לניסויים שלנו בפרט, ספירת הסינפסות במערכת העצבים המרכזית, 20 מחוזות ריבית על מקטע אחד עם השטח של מיקרומטר 30.25² הם אופטימליים. מומלץ להכשיר כוח אדם טוב בזיהוי התכונות המדובר (ב שלנו הסינפסות במקרה, תכונות סינפטית ו DCV) כדי לקבל תוצאות אמינות. כדי לזהות הסינפסות, הסינפטיות חייב להיות ניתן לזיהוי ודורש זאת ברזולוציה של פחות 10 ננומטר. בשביל זה, הגדלה של 5000 X היה אופטימלי, אבל זה חייב לציין כי ההגדלה תלויה בחומרה פרמטרים כגון לסוג ולמיקום של המצלמות צריכים להתאים לסוגים אחרים מיקרוסקופ ו/או מצלמה. יש גם לציין כי הפרוטוקול משתמשת יישומים ספציפיים עבור TEM אחד, כי משתמשים עם דגמים אחרים יש לשקול את ההבדלים בכיוונון.

אנו מאמינים שזרימת העבודה שלנו ניתן להתאים ליישומים רבים אחרים לא רק במדעי המוח אלא בשדה רחב של המדע הביולוגי גם חומר מדעי (כאשר הרזולוציה הגבוהה של TEM נדרש) בכל פעם שאלת המחקר דורש מדים שיטתית דגימה אקראית ואת כמות דגימות להיבדק מבקש זמן דרך יעילה של ניתוח. לדוגמה, אנו מעוניינים כיום לוקליזציה מאגרי ברזל במוח האנושי. בשביל זה, אנחנו הסתגלו לאחרונה זרימת העבודה שלנו, כדי לאפשר ניתוח היסודות על סעיפים דקים באזורים שנבחרו באקראי. על מנת לצמצם את מספר היישומים הנדרשים עבור זרימת העבודה, כיוונו ליישם בעזרת התוכנה SerialEM בלבד, כי זה יכול להיות מתוכנת כדי להזיז את הבמה כדי להגדיר מראש את נקודות שניתן לבחור באופן אקראי. יצרנו קבצי script מותאמים אישית כדי לשלוט TEM, במטרה automatizing זרימת העבודה לגמרי. זה הוכיח האפשריים חוץ autofocusing שותק במצב הדמיה מסוננים, אשר לא נכנע מספק תוצאות. ולכן השתמשנו מיט תוכנה למיקוד, להשגת תמונות אנרגיה-מסוננים.

לסיכום, אנו מציגים פתרונות תוכנה לסייע בהשגת אלקטרון micrographs בצורה בלתי לא משוחדת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pentobarbital	SigmaAldrich	P3761
Formaldehyde	Merck	1040051000	1kg
Glutardialdehyde	Science Services	E 16210	25%; 100ml; EM grade
cacodylate buffer	Merck	C4945	250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate
Thionine acetate/Ceristain	Merck	861340
acetic acid	Merck	1000631000	1 L
Sodium hydroxide	Merck	1064951000	1 kg, pellets
osmium tetraoxide	Science Services	E 19110	10x1g
TAAB embedding resin	Science Services	TAT001	500g
DMP-30	Science Services	TAD024	100g
DDSA	Science Services	TAD025	500g
Uranyl acetate dihydrate	Plano GmbH	19481	depleted, 25g
Ultrastain 2	Leica	16707235	Lead citrate
Toluidine blue solution	Agar Scientific	AGR1727	10g
Pioloform	Plano GmbH	R1275	10g Powder
Proylenoxide	SigmaAldrich	82320-1L	1L
DPX embedding medium	Plano GmbH	R1320	embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml
Vibratome, Leica VT 1000	Leica Microsystems, Vienna, Austria
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Tecnai G2 20	FEI,Eindhoven, Netherlands
Megaview wide angle camera	Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany
US 1000 digital camera	Gatan, Pleasanton, USA
TEM Imaging Analysis Software	FEI,Eindhoven, Netherlands
FEI Serial Section Software	FEI,Eindhoven, Netherlands
Fiji, ImageJ 1.52e	National Institute of Health, USA
SPSS 20.0	SPSS Inc., Chicago, IL, USA
SerialEM	Regents of the University of Colorado
RPS (random point sampling) software 0.9a	custom-made
Disector v1.0.2 (ImageJ macro)	custom-made
EFTEMSerialEM (SerialEM script)	custom-made