Neuroscience bölümlerinde TEM örnekleme tarafsız bir yaklaşım

Özet

Biz beyin dokusunun elektron mikroskobu araştırmalar için yeni iş akışı tanıtmak. Yöntemi tarafsız bir biçimde nöronal özelliklerini incelemek kullanıcı sağlar. Elementel analiz için Ayrıca randomize örnekleme için iş akışı çoğu automatizes bir script mevcut.

Özet

Araştırmalar neurons ve onların sinapslarda ultrastructural özelliklerinden sadece elektron mikroskobu ile mümkündür. Özellikle yoğunlukları değişiklikleri karşılaştırmalı çalışmalar ve dağılımları gibi özelliklerin, yansız örnekleme iletişim kuralı için güvenilir sonuçlar önemlidir. Burada, beyin örnekleri resim alma için iş akışı mevcut. İş akışı tanımlı beyin bölgesi içinde sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme sağlar ve görüntüleri bir disector kullanılarak analiz edilebilir. Bu teknik çok seri bölümler kapsamlı sınav hızlıdır ancak hala yoğunlukları ve ultrastructure özellikleri dağılımları tahmin etmek için uygun bir yaklaşım sunuyor. Katıştırma önce lekeli vibratome bölümleri, soruşturma, hangi yardım hız yukarıya genel numune hazırlama süreci altında beyin bölgesi tanımlamak için bir referans olarak kullanılmıştır. Bu yaklaşım bir zenginleştirilmiş-konut çevre ultrastructural parametrelerinde birkaç fare beyin etkisini araştıran karşılaştırmalı çalışmalar için kullanıldı. İş akışı başarılı kullan seçeneğine göre biz beyin örnekleri elementel analiz amacıyla uyarlanmış. İletişim kuralı kullanıcı etkileşimi zaman açısından en iyi duruma getirilmiş. Açık kaynak yazılım SerialEM için bir komut dosyası derleme tarafından zaman alıcı adımlar otomatikleştirme kullanıcı temel haritalar edinme ana çalışmalarına odaklanmaya yardımcı olur. Orijinal iş akışı olduğu gibi biz güvenilir sonuçlar güvence altına almak için yansız örnekleme yaklaşım dikkat.

Giriş

Elektron mikroskobu, bölümler içindeki temsilcisi bölgeleri örnek için zordur. Biz, bir gözlemci olarak, sık sık belirli bölgeler dikkatimizi örnek, göze çarpan özellikleri tarafından çizilmiş bakmak için de dağıtılmış, yansız örnekleme önleme önyargılı vardır. Bölgenin ilgi bir her parçası bir elektron test¹' bitiş yukarıya aynı şansı olursa önyargı örnekleme yalnızca önlenebilir. Örneğin, bir yazılım çözümü önyargısız örnekleme mikroskop trackball el ile sahne durur her yerde örnekleme bölgeleri seçin için belgili tanımlık imge vasıl bakmadan iterek önlemek mümkündür. Ama net olarak söylemek gerekirse, bu rasgele bir yordam, çünkü, bilinçli ya da bilinçsizce, kullanıcı hareket sahne alanı üzerinde bir etkisi olabilir ve ayrıca, örnekleme bölgeleri seçme sofistike bir yolu bu değil, değil. Rastgele örnekleme çiftleri bölümlerden kesitler, bilinen mesafe çiftlerini gerektiren stereology¹için belirli birimlerdeki, örneğin, yapılarının sayısını değerlendirmek için kullandıysanız özellikle önem kazanmaktadır. Ayrıca yalnızca tek bir bölümüne bakın ve belirli yapılara²sayısını tahmin etmek mümkün olurdu, ama çok küçük yapılardır sürece bu yaklaşım ile müfettişler sayısal yoğunluğu büyük yapıların abartma eğilimindedir karşılaştırma bölümü kalınlığında. Alternatif yaklaşımlar seri bölümlerden doku birimleri yeniden ve böylece³istenen verileri almak üzeresiniz. Ama bu çok zaman alıcı ve (daha büyük) karşılaştırmalı çalışmalar için uygun bir yaklaşım değil.

Bu sorunların üstesinden gelmek için araştırmacı örnekleri elektron Filmler, ultra-ince kesitler içinde normal aralığı elde etmek için otomatik olarak seçmesine olanak sağlayan bir iş akışı geliştirdik. Elektron Filmler rasgele, yansız örnekleme izin konumudur. Uygun yaklaşımdır yapıları (örneğin, sinapslarda içinde bir belirli neuropil cilt^4,5) sayısal yoğunluğu ve yapısal özellikleri (örneğin, genişliğini sinaptik yarık boyutlarının belirlenmesi için her ikisi de veya çap postsinaptik yoğunluğu^4,5)

İş akışı özel yapım bir rasgele noktası otomatik olarak önceden tanımlanmış bir bölgesi içinde kılavuz pozisyonların Ultra-ince bir bölümü ilgi hesaplar (RPS) yazılımı (bizim mikroskopla sağlanan komut dosyası oluşturma yazılımını kullanarak Java komut dosyasında yazılmıştır) örnekleme kullanır. Böylece bir elektron test her noktada yapılan RPS yazılım elektron mikroskobu aşaması önceden tanımlanmış bu noktalara taşır. İlk olarak, kullanıcı ilgi ince bölümünde bir bölge tanımlar. Daha sonra RPS yazılım bu bölge içerisinde kılavuz pozisyonlar hesaplar. X / ilk konumda y koordinatlarını rasgele oluşturulur ve kalan pozisyonlar açısından ilk pozisyonu normal kılavuz aralıklarla yerleştirilir. Bölgenin ilgi bir her parçası muayene ediliyor aynı şansı olduğundan, bu en düşük düzeyde veri toplama sağlar. Bu yaklaşım örnekleme da sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme denir (bkz: başvuran^6,7 daha fazla ayrıntı için).

Sayısal yoğunluğu yapıları belirlemek için bilinen uzaklıkta mı bölümleri çiftiyle çalışıyoruz. Bir elektron test önceden belirlenmiş pozisyonların birinde ilk bölümünden elde ettikten sonra TEM seri bölümü yazılım (bizim elektron mikroskobu ile sağlanan yazılım paketinin bir parçası) ikinci bölümünde, karşılık gelen nokta için taşır bir elektron test karşılık gelen konum elde etmek. Bu önceden belirlenmiş kılavuzunda her konum için tekrarlanır. Bizim yaklaşım, bir disector elektron Filmler^8,9her çifti parçacıkları saymak için kullanılır. Bir disector bir çift sayma kare, her bölüm^8,9için oluşur. Nesneleri sayısal yoğunluğu yalnızca nesneleri görünür sayılarak belirlenir ilk bölüm (veya başvuru bölümü) ama ikinci bölüm (veya arama bölümüne) üzerinde. Bu nesnelerin bir hızlı ve verimli bir şekilde^8,9sayısal yoğunluğu tahmin etmek için sağlar. Ayrıca tek bölümlerde iki boyutlu yapısal özellikleri ölçülebilir.

Başarıyla hipokampüs synapse sayılarda enriched çevre (EE) koşulları koşulları^4,5konut standart ortamına (SE) göre konut maruz farelerin farklılıkları değerlendirmek için bu iş akışını uygulamış olan, ve aynı zamanda vahşi türü (WT) fareler ve peptit Y (NPY) KO fareler ultrastructural farklılıkları değerlendirmek için SE ve EE⁵altında tuttu. Hedefimiz nöronların, sayısal sinaptik yoğunluğu gibi yapısal özellikleri itibariyle özellikle kesit aktif bölgesinde ve postsinaptik yoğunluğu, sinaptik yarık ve sinaptik veziküller sayısı genişliğini uzunlukları aramak oldu, nöronal bağlantısı ve etkinleştirme farklı deneysel koşullar arasında değişiklikleri değerlendirme için. Buna ek olarak, nöronlar belirli bir beyin alanda saklı nöropeptitler miktarını belirlemek için yoğun çekirdekli veziküller (DCV) sayısal yoğunluğu içinde ilgilenmişlerdir.

Bizim yaklaşım yukarıda bizim sonraki adımda açıklanan Etütler başarısı göre insan beyni örnekleri içinde tarafsız elemental analizler için alanlar seçmek için bizim iş akışı adapte olması. Bu nöronlar ve gliyal hücreler ferritin molekülleri depolanan görüntü demir için yapılmıştır. Bunun için biz bize bir rasgele tarama süreci işlemlerinde tanımlanmış bir alanı beyin bölümlerinin çoğunu otomatikleştirmek izin verilen bir komut dosyası derlenmiş.

Protokol

Tüm deneyler Federal Bakanlığı bilim ve araştırma (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 ve BMWF-66.010/0037-II/3b/2013) Avusturya Cumhuriyeti ya da etik Komisyonu tıbbi Graz Üniversitesi, sayı 28-549 eski bir etik kurul tarafından kabul edildi 15/16 ve 24 Kasım 1986 (86/609/EEC) Avrupa Toplulukları Konseyi yönergesi ve yönergesi sayılı Avrupa Parlamentosu ve Konseyi 22 September2010 göre yürütülen (2010/63/AB). Hayvan deneyleri tasarlanmış ve kullanılan hayvan sayısını en aza şekilde yapılır.

1. diseksiyon ve doku fiksasyonu

1. Fareler ötenazi (21 hafta yaşlı, kadın C57BL/6J fare ve C57BL/6N fareler; erkek WT ve NPY KO fareler üzerinde karışık bir C57BL / 6:129 / SvJ (1:1) arka plan sırasıyla) 150 mg/kg Fentobarbital intraperitoneally enjekte edilerek.
2. Beyni kafatasından kaldırmak ve hemen onları (sola doğru yarımküreden ayıran) - bir neşter kullanarak yarıya.
3. Hemen yarıya % 2 formaldehit ile cam kaplar içine yerleştirin ve 0.1 M cacodylate %2,5 oxazolidin (CH₃)₂AsO₂Na·3H₂O, pH 7.4 ile 1 M için ayarlanmış tampon NaCl), pH 7.4 4 ° C'de
   Dikkat: Fiksajlar zehirlidir ve büyük bir dikkatle ele alınmalıdır. Sadece koruyucu eldiven ve duman başlık altında kullanın.
4. 2 gün 4 ° C ve durulama için beyin yarısı aynı arabellek en az 24 h, ayrıca 4 ° C'de için fix Arabellek hacmi hakkında on kat numune birim olmalıdır.

2. belirlemek ilgi içinde beyin bölgesinin Vibratome bölümleri başvuru ile karşılaştırarak fare bölümlerden beyin Atlas¹⁰

1. Beyin örnek bir vibratome üzerine yerleştirin. Beyin yönünü doğru olduğundan emin olun (Bu durumda, koronal bir yönelim Hipokampus için seçildi).
2. Faiz (ROI) beyin bölgesinin ulaşılana kadar kırpın. Büyük bir kalınlık bölümleri kesme (e.g., 100 µm) kadar beyin bölümü bölgenin ilgi ile ulaştı ve her bölüm at.
3. Vibratome bölümleri ile 20 µm kalınlık yatırım Getirisi ile beyin bölümünün başında kesip vibratome bölümleri bir cam slayt üzerinde yer başlatın. Onları (Nisl leke) bölümleri % 0.05 thionine asetat sodyum asetat tampon pH 4.2 için 1 dk (şekil 1AI) içine yerleştirerek leke.
4. Lekeli bölümleri hafif bir mikroskop kullanarak fare beyin atlas ile karşılaştırmak ve kesme ve istenen beyin koordinatları ulaşana kadar boyama devam edin.

3. bir örnek bölge gömmek için elde etme

1. En kısa zamanda doğru alan tanımlanır, kesme bir bölüm 150 µm kalınlık, vibratome ile başlayın.
2. Microdissect bu vibratome bölüm stereo mikroskop altında bir tıraş bıçağı ile. ROI çevresinde parçalar kesip. Bölüm transmisyon elektron mikroskobu (TEM) (1 x 1 mm²' den büyük olmayan) aşağıdaki hazırlık adımlarını için uygun bir boyutu olması gerekir.

4. TEM hazırlık - gömme, ultra-ince kesit ve boyama

1. Katıştırma
   1. 2 h %2 Osmiyum tetroxide oda sıcaklığında-(RT) için sonrası düzeltme. En az 10 kez numune hacmi ile örnek kapsar, ancak gereksiz zehirli atık önlemek için aşırı sabitleştirici kullanmaktan kaçının için bir birim kullanırsanız.
      Dikkat: Osmiyum tetroxide çok zehirli ve büyük bir dikkatle ele alınmalıdır. Sadece koruyucu eldiven ve duman başlık altında kullanın.
   2. EM sınıf alkoller adımlarla 20 dk. kullanım, bu daha büyük bir hacim içinde belgili tanımlık önceki adım (% 50, % 70, %80, % 96 ve % 100 etanol) kullanarak kurutmak.
   3. Propilen oksit RT. yerde 40 dk propilen oksit/katıştırma reçine (1:2) RT 2 h ve 1:3 gece 4 ° C'de karışımı içine yerleştirin
      Dikkat: Propilen oksit çok zehirli ve büyük bir dikkatle ele alınmalıdır. Sadece koruyucu eldiven ve duman başlık altında kullanın.
   4. Örnekleri 90 dk (tüm 45 ° c) bir kez ve 2 kez 60 dk sonra reçine değiştirerek % 100 reçine gömün.
   5. Son olarak, örnekleri uygun kalıplara yerleştirin ve 90 ° C'de 3 gündür (şekil 1bütün) polimerize reçine izin.
2. Süsleme ve Sectioning üzerinde bir ultramicrotome.
   1. Taraflar birbirlerini (şekil 1Aiii) uymak için bölümleri için olabildiğince sorunsuz sağlama blok, kırpın.
   2. Üretmek 55 nm Ultra-ince bir seri bölümler (gümüş gri olmalıdır) bir ultramicrotome kullanma. Bir yuvası kılavuzunu kullanın (yuvası genişliği 1 x 2 mm) pioloform (şekil 1AIV) ile kaplı.
3. Counterstain 30 dk ve kurşun sitrat %30 2 uranyl asetat kullanarak yuvası Izgaralar üzerinde Ultra-ince kesitler RT (Bu standart elektron mikroskopi yöntemi¹¹), s.
   Dikkat: Uranyl asetat çok zehirli ve herhangi bir doğrudan temas kaçınılmalıdır. Sadece koruyucu eldivenler ile başa. Kurşun nitrat yuttu veya inhale ve büyük bir dikkatle ele alınmalıdır zehirlidir.

5. başvuru üzerinde karşılık gelen ROIs ve TEM yazılım paketleri ile ilgili bölümlerde arama görüntüleme

1. Oryantasyon ve bölümleri niteliğini değerlendirmek için düşük bir büyütme (bağlı olarak bölümün boyutunu) kullanarak TEM ile kısımlar ızgara üzerinde inceler.
2. Köşe noktaları bölümlerin depolayarak bölümlerin sanal görüntüler oluşturmak için yazılım (bir paket TEM görüntü analiz yazılımı veya TIA, mikroskop ile birlikte) başlatın. Bu yatırım Getirisi her bölümünde ilgili konumlarını bulmak belgili tanımlık bilgisayar yazılımı sağlar.
   1. Bölümüne gidin ve arama ve başvuru bölümü için köşe noktaları eklemek için Ekle seçin. Açılır pencerenin yönergeleri izleyin. Başvuru bölümünde ile başlatın ve arama bölümle devam edin. Puan 1 ve 2 (şekil 1BI) bir sonraki bölüme paralel bölümü kenarlarına girdiğinizden emin olun.
   2. Bölgenin ilgi tanımlamak ve yatırım Getirisi bir taslağını oluşturmak için birden çok köşe noktaları Roi için başvuru bölümünde TIA kullanma mikroskop sahne taşımak için düşük büyütme başvuru bölümünde görselleştirin.
   3. RPS yazılımı kullanılarak elde edilen çokgen koordinatları kaydedin. Bunun için her bir noktada ROI (şekil 1BII) bölümünde anahat için gereklidir ve çokgeni Ekle koordinatları RPS yazılım iletişim kutusunda basın.
   4. Tanımlamak ve örnekleme alanları ve mesafeler için RPS yazılımı içine alanlar arasında uygun bir boyutunu girin (sunulan çalışmada, boyutu örnekleme alanlarının 7 µm ve aralarındaki uzaklığı en az 20 örnekleme alanları içinde sonuçlanan 20 µm ROI). Basın Raster hesaplamak, o zaman belgili tanımlık bilgisayar yazılımı içinde çokgen (şekil 1Bill) test 's pozisyonlar için sistematik bir Tekdüzen rasgele moda örnekleme alanı koordinatları oluşturur.
      Not: daha iyi yönlendirme için Çokgen ve çokgen örnekleme alanları RPS yazılım (şekil 1Biv) tarafından görüntülenebilir.
3. Örnekleme noktaları RPS yazılım ve TEM seri bölümü yazılım kullanarak arama ve başvuru bölümüne saklayın. Montages koordinatlarını bunlar hangi daha sonra¹¹kaydedilir.
   1. RPS yazılım x için mikroskop sahneye taşımak için sonraki konumuna git tuşuna basın / y koordinatları her örnekleme alan başvuru bölümünde. Konumu ve eklemek bu koordinatlara yılında başvuru bölümünde yazılım almak için gidin. Tüm koordinatlar için bu işlemi yineleyin.
   2. Arama bölüme başvuru bölümünde koordinatlarından ayna için bölümüne gidin ve basın bölümüne gidin. Arama bölümüne (genellikle ' 2') iletişim penceresinde girin.
   3. (Sonraki adıma bakın) montages kaydı, daha önce açıklandığı gibi arasında başvuru ve arama bölümüne geçin ve başvuru bölümünde yer ve numarasına gidinkonumunu değiştirmek. Sonraki koordinat iletişim penceresinde seçin.
   4. Her örnekleme, SerialEM nişanları için koordine etmek, dosya gidin ve Yeni montaj aþaðý açýlan menüsünden seçin. Fayans sayıları ve çakışma yüzdesini iletişim penceresinde seçin. Şu an çalışma, 5000 X büyütme altında çalışma ama 2 x 2 fotoğraf montages yapmak gerekli CCD kamera sınırlı görüş alanı sinaptik özellikleri tanımak yeterlidir. Montages ile SerialEM yapılır.
   5. Önce her montaj kayıt, odağı yeniden ayarlayabilirsiniz (veya, eğer mümkünse, kayıt yazılımı otomatik odaklama seçeneği etkinleştirmeniz). Montaj dosyayı kaydedip SerialEM solda montaj alt menüsünde Start basarak montaj kaydı başlatmak için klasör seçin.

6. ImageJ için belge Ultrastructural özellikleri ile TEM görüntüleri analiz.

Not: Bunun için bu başvuru ve arama bölümünden hizalanmış görüntü yığını oluşturmak önemlidir.

1. Görüntü çiftleri ImageJ yığın görüntüleri ile bir yığın dosyasına dönüştürmek ve StackReg (büyük-EPFL mevcut durumda, algoritma Affine yapıldı http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; üzerinden yüklenmesi gerekir görüntülerle Hizala kullanılan). Hücresel yapısal özellikleri sayısal yoğunluğu elde etmek için bir sayım çerçeve boyutu 5,5 x 5.5 µm rasgele rasgele bir açı ile resmin üzerine yerleştirilmesi en özel yapım ImageJ makro Disector oluşturur.
2. Disector makro başlatma ( ImageJ menü konumda kaydedildiği dizini bağlıdır) ve parametreleri (kesimlerinin sayısını sayma çerçevesinin boyutunu) gerekli (şekil 1CII) tanımlayın.
3. Disector kullanarak synapse/µm² saymak. Her synapse başvuru bölümünde görünür, ancak arama bölümünde görünür değil sayma çerçevesi içinde saymak. İki 'satırları yasak' disector; in ile kesiştiği bu sinapsların atlayın Ama sinapslarda terskabul çizgiler'saymak. Bunun için Toolsbar ImageJ (Şekil 2A, Şekil 2B) içinde yer alan Çoklu aracını kullanın.
4. SYNAPSE parametrelerini ölçmek için sadece sinapslarda kesit (başvuru bölümünde; disector için kullanılan aynı görüntü çerçeveleri içinde) odaklı bir sinaptik yarık ile seçin.
   1. Eklenti ObjectJ ImageJ içinde damla aşağı yemek listesi (Şekil 2A) eklentileri ile başlamak için | Analiz. ObjectJ açılan iletişim kutusundan yeni bir proje açın. Bu kullanýcýnýn anahat ve mark yapılarına İşaret aracını (Şekil 2B, kırmızı daire) ile bir pencere açılacaktır. Burada sunulan deneyler için kullanılan sinaptik parametreleri aşağıdaki adımlarda açıklanan.
   2. Presynaptic membran uzunluğu ve postsinaptik yoğunluğu uzunluğu Marker aracı (Şekil 2B, kırmızı daire) kullanarak yapı boyunca bir çizgi çizerek ölçmek.
   3. Sinaptik yarık ortalama genişliği elde etmek hem düz paralel iki taraf ve bir parçalı hat midway, her iki membran için eşit uzaklıkta öncesi ve postsinaptik membran kapsayan bir çokgen çizerek.
   4. Yerleşik veziküller sayısını belirlemek için presynaptic membran bir vezikül çapı veya daha az en büyük bir mesafeden var tüm veziküller saymak.
   5. Yerleşik olmayan veziküller sayısını belirlemek için yerleşik veya diğer yerleşik olmayan veziküller aynı sinaps, üzerinden bir vezikül çapı en fazla bir mesafe ile bu veziküller saymak.

7. yarı ince kesitler için belge makroskopik özellikler için ışık mikroskobu (mevcut durumda cep numarası) içinde aynı YG seçilmiş TEM soruşturma için üreten.

1. Ultra-ince kesitler TEM için hemen kesme sonra iki yarı ince kesitler, 0.5 µm kalınlığında ve hemen birbirine bitişik kesti. Onları leke ve yer bir cam slayt üzerinde % 0.5 toluidin blue solution'ı kullanma. Bir kapak makbuzu hakkındaki kısımları (ile orta montaj, distyrene, Plastifiyan (tricresyl fosfat) ve Ksilen oluşan DPX) yerleştirin. Bu iki bölüm hücre sayıları saymak için kullanılır.
2. Hafif bir mikroskop kullanarak düşük büyütmede yarı ince kesitler fotoğraf.
   Not: Yapıları soruşturma altında görüntüleri olarak tanımlanabilir olmalıdır. Bu da çalışmanın, 20 X büyütme hücre cesetleri tanımlamak için kullanıldı. Gerekirse, birden çok görüntü bir görüntü işleme yazılımı ile birlikte dikişli.
3. İki ardışık yarı ince kesitler çiftlerini bir görüntü işleme yazılımı ile hizalamak (örn., ImageJ).
   Not: Döndürme ve boyutu (parça işlem tarafından tanıtılan sıkıştırma eserler nedeniyle oluşabilir) farklılıkları iki bölümü mükemmel bir bindirme için ayarlanmalıdır.
4. Işık mikroskobu görüntü üzerinde yatırım Getirisi kenarlığını işaretleyin. ROI TEM görüntüleri için kullanılan YG karşılık gelmesi gerekir. Bu amaçla, ImageJ ilgili resimleri yüklemek ve çokgen seçim Toolsbar (Şekil 2A) seçin.
5. ImageJ analiz açarak kullanarak tüm görüntü üzerinde bir kılavuz oluşturmak | Araçlar | Kılavuz ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayın.
6. Alan ve kılavuz-Puan faiz ve bölüm kalınlığının alanı içinde çokgene hacmi hesaplamak (birim N_CS = * _GS * h_ST ; N_CS bölümler sayılan çapraz; = Bir_GS = kılavuz boyutu; h_ST bölüm kalınlığı =).
7. Yalnızca bir bölüm varsa çekirdeği nöronal hücre organları ROI içinde saymak. Toolsbar--dan ImageJ içinde Çok noktaya aracını seçin ve hücreleri işaretlemek. Hücreleri her bölümünde sayım sonra birim başına hücre sayısını hesaplar (; C_yoğunluğu = hücre yoğunluğu; C_sayısı hücre sayısı =).
8. Tüm ölçüleri ObjectJ sonuç penceresinde (Şekil 2C) kaydedin. Verme ve onları daha fazla kullanmak üzere kaydetmek.

8. DigitalMicrograph (DM, yansıma oluşturma filtresi ile sağlanan) ile birlikte beyin örneklerinde elementel analiz en iyi duruma getirmek için SerialEM komut dosyasını kullanarak.

1. Filtre (GIF) görüntüleme ve ayarlama.
   1. Örnek TEM yüklemek ve GIF ayarlama için örnek bir delik için izleme topu ya da mikroskop oyun çubuğu kullanmaya devam.
   2. Enerji TEM filtre için (EFTEM) geçiş DM yazılım/veya DM ve DM içinde CCD kamera seçin.
   3. Elementel analiz için büyütme seçin (büyütmeyi yapısı/alan faiz bağlıdır; mevcut durumda 125 k 76 k büyütmeyi ayarla). Pozlama süresi 0,001 s ve başlangıç görünümüayarlayın.
   4. Kenarları görülebilir ve görüntüdeki kiriş merkezi kadar ışın dikkatle odaklan. Diyafram kenarları görülebilir ve kiriş ve trackball ışın için merkezi kadar C2 / objektif diyafram azaltmak.
   5. Işın bulanıklık (C2 çevresinde %46.2, çekim hızı ayarlamak için 0,05 olmalıdır s) ve posta düğmesine basarak sıfır kaybı tepe (posta) bulabilirsiniz. Ayarlama yordamı tam ayar düğmesine basarak başlatın.
2. Rasgele Puan satın almak.
   1. Geçiş geri modu Imaging TEM ve kamera seçin ve büyütmede 10 k Netlemeyi kontrol (z ekseni ayarlayın ve odak sıfır olarak ayarlayın).
   2. Kamera değil eklediyseniz LM 75 X büyütme ve onay seçin (aksi takdirde SerialEM yazılım tarafından kontrol edilemez).
   3. SerialEM başlatın ve yeni bir proje açın.
   4. Gezgin'i açın. (İçin görünümü ve kayıt) kamera ve komut dosyası kontrolleri kamera ayarlarını kontrol edin ve başlangıç görüntüleyin (kamera otomatik olarak eklenir).
   5. Ultra-ince bölümünü göster, Puan eklemek Gezgini penceresinde seçin bir köşe yapmak.
      1. Köşe noktaları Ultra-ince bir bölümü kenarlarında ayarlayın. Sahne alanı sağ-fare-tuşunu basılı tutarak bir köşe noktasına yaklaştırın. Seçimin bir köşesine geldiğinde sol klik ile bir köşe noktasını ekleyin. 3 daha fazla köşe noktaları eklemek için yordamı yineleyin. Gezgin penceresinde için saklı Puan köşe noktaları için C kutusunu işaretli emin olun.
      2. Köşe montaj (büyütme LM 75 oranında tercih edilir) başlatmak için Navigator SerialEM menü çubuğunda gidin ve Montaging & Izgaralar ve Kurulum köşe montaj aþaðý açýlan menüsünden seçin.
         Not: seçilen kayıt parametreleri için ayarları uygun en iyi görüntülenir. Onları gerekirse değiştirin. Mevcut durumda, sadece örtüşme yüzdesi % 20'si değiştirildi.
   6. Bölüm/ROI montaj görüntü üzerinde anahat. Çokgen eklemek Gezgini penceresinde seçin ve birden çok sağ fare tıklama ile bölüm anahat. Puan Ekle kılavuz navigator aþaðý açýlan menüden seçin ve (deneysel soruda; uzaklık bağlıdır noktaları arasındaki mesafeyi tanımlayın örn., 10 µm, şekil 3).
   7. Komut dosyası komutları izleyin. Kılavuz Puanlar Gezgin'de gösterildiği gibi girin ve edinme noktalarının sayısını girin (örn., 20).
   8. Böylece komut dosyası Kılavuzu barlar aydınlatma eşik ayarlayın. Komut dosyası komutları izleyin ve sahne alanı el ile bir kılavuz çizgiyle bir üç aylık dönemlere göre görüş alanı kapsayacak şekilde hareket ederler. Görüntülenen değere göre (görüntülenen değerden daha yüksek olmalıdır) bir eşik aydınlatma değeri girin.
   9. Toplama noktaları seçilir ve pişirme rutin tamamlandıktan bekleyin.
      Not: Bu uzun bir zaman alır ve olabilir bir gecede; script mikroskop pişirme rutin bitirdikten sonra bekleme moduna gönderir; pişirme rutin elektron ışını bölümlerde stabilize etmek önemlidir.
3. Enerji TEM (EFTEM) elementel analiz filtre
   1. TIA/DM EFTEM modu seçin ve CCD kamera DMseçin.
   2. Işın ortalayın ve sahne her örnekleme koordinatı taşınır komut dosyası komutları izleyin.
      Not: Sahne alanı için sonraki koordinat taşındı Eğer kullanıcı soracaktır.
   3. Sıfır kaybı tepe (posta) hizalayın ve C2 ~ %46.2 için ayarla.
   4. Enerji 60 eV ayarla (Bu durumda, değeri Fe M-kenar algılama için ayarlanır), 0.4 s. Ekle 10 eV ve pozlama zaman yarık yarık ve C2 ~ %43.9 için ayarla.
   5. Başlangıç görüntüleyin ve görüntü odak.
   6. C2 %46.2 için posta hizalamak ve C2 geri % 43.9'e ayarlayın.
   7. Temel harita elemental belirli ayarlarla elde etmek.
      Not: Varsayılan ayarları alma iletişim kutusunda kullanılabilir, ancak bu önceden test etmek için önerilir mümkünse; Filtre örnek görüntüleri şekil 4' te gösterilmiştir.
   8. C2 46.2 %'ye ayarlarsanız ve kalınlığı harita elde etmek.
   9. Tüm kararlı Alım noktaları için (Adım 8.3.2-8.3.12) yineleyin.
   10. Komut dosyası, yönergeleri izleyin ve tek elektron Filmler veya montages edinme noktalarının olsun. Böylece tüm (ultra-) yapısal bilgileri görünür/tanımlanabilir büyütme oranını seçin.
   11. GÜNLÜK dosyası, navigator ve sonuçları penceresinde kaydetmek ve slit kaldırın.
   12. Vanayı kapat, örnek kaldırmak ve kapamak TEM.

Sonuçlar

Burada, alanları TEM için otomatik ve tarafsız bir şekilde seçmek için iş akışını açıklar. Kullanıcı TEM Ultra-ince bir bölümünde içinde ilgi alanı seçer ve alanı içinde 20 örnekleme alanlarına koordinatlarını otomatik olarak hesapladığı RPS yazılım da dahil olmak üzere iş akışı için birkaç yazılım çözümleri kullanır faiz. O zaman, TEM sahne fotoğraf için her örnekleme alanına taşınır. Bu tek bölümleri analiz etmek için ve kesitler, araştırmacı önyargı olmadan görüntüleme için alanları seçerek sağlar, bilinen bir mesafe çift analiz etmek için mümkündür.

Bu iş akışının ne zaman fare beyin bölümleri^4,5' ultrastructural özellikleri belgeleyen değerli olduğunu kanıtladı. Bu çalışmalarda dentat gyrus (DGpl) polimorf hücre tabakası bir ilgi alanı incelenmiştir. Bizim yöntem dorsal DG (Bregma −1.3) Koronal bir bölümünü Ultra-ince bir bölüme uyuyor ve onun ana hatlarıyla kolayca düşük büyütme oranında tanınır çünkü DG incelenmesi için uygun olduğunu kanıtladı. Diğer beyin bölgeleri incelenmesine olsaydı, onların büyüklük ve deneyler planlamadan önce özellikleri ayırt kontrol etmek önemli olacaktır.

Burada açıklanan iş akışı uygulayarak EE konut önemli ölçüde DGpl⁴' deki standart konut koşullarını açısından sinaptik yarık genişliği artar gösterdi. Ayrıca, yoğun çekirdek veziküller sayısı önemli ölçüde nöropeptitler ev değişiklikleri gösteren hayvanlar EE yer alan⁴, azalmış. WT ve NPY nakavt fareler EE koşullar altında tutulur DCV yoğunluğu açısından SE-konut⁵azalmıştır nöronlar/µm³ DGpl içinde sayısı artarken. Buna ek olarak, yedek havuzuna (yerleşik olmayan sinaptik veziküller) koşulları⁵konut bağımsız sinaptik veziküller önemli bir artış NPY nakavt sonuçlandı. EE etkisi sinaptik yarık genişliği EE yer alan WT ve NPY KO fareler⁵arasında anlamlı bir fark sonuçlanan NPY KO grubunda ters. WT ve NPY davranış çalışmaları ile birlikte alınan nakavt hayvanlar bu NPY çok önemli bir rol EE⁵nörobiyolojik etkileri için gösterir konut koşullarını, her iki tür altında düzenlenen.

İnsan beyninin içinde depolanan demir görüntülenmesi için bir komut dosyası için rasgele bir bütün ultrathin bölümünde Alım noktaları bir enerji elde etme amacı ile elektron test bu noktaların her filtre seçmek SerialEM yazılım derlendi . Elektron mikroskobu bölümü yükledikten sonra komut dosyası bölümü istikrar gerçekleştirilen (i.e., 'numune-yemek' rutin) bir gecede. Komut dosyası daha sonra puan bu şekil 3' te bir ızgara işaretli kullanıcı tarafından önceden tanımlanmış bir dizi rasgele seçilmiş. Bir testi test üreten ve onun gri düzeylerini denetleyerek, komut dosyası seçilen noktaları ızgara çubukları üzerinde indi Puan reddetme bölümünde, görünür bir parçası üzerinde bulunan Eğer kontrol ettim. Çoğu iş akışının en az kullanıcı etkileşimi ile komut dosyası tarafından yapılır. Ancak, orada olduğu gibi çok az ışık SerialEM otofokus rutin için otomatik filtre enerji Filmler (Bu Kur) ile kaydetmek mümkün olmadı. Bu nedenle, biz en kısa zamanda komut dosyası sahne her noktasına taşındı odak el ile ayarlanabilir ve demir EFTEM görüntüsünü yapılan DM yazılım için açık. Öldükten sonra insan beyninin bir EFTEM demir resim için bir örnek şekil 4' te gösterilmiştir.

Şekil 1. İllüstrasyon iş akışının. (A) (ok yönünde) numune hazırlama ana adımları gösterilir: vibratome bölümler (ı), kesme yarı ince ve ultra-ince kesitler (III) ve alıcı Ultra-ince bakır Izgaralar (IV) bölümlerinde çift embedding(ii). (B) kayıt siteleri belirlemek örnekleme alanı koordinatları oluşturmak için kullanımı hem mikroskop tedarikçinin yazılım ve özel yapım RPS yazılım. Köşe noktaları bölümlerin mikroskobu yazılımında depolanır ve ROI (yarı ince kesitler yardımı ile tanımlanır) vurgulanana (ı); alanları örnekleme bir kılavuz yatırım Getirisi üzerinde oluşturulur, rasgele ÜSTKRKT (kırmızı ok) x tanıtıldı ve y. Böylece hiçbir vardiyalar, siyah kareler yerine rasgele kaydırılacağı, mavi kareler kayıt siteleri (II); belirlemek için kullanılır (siyah oklar), örnekleme alanlar arasındaki mesafe daha küçük değişikliğidir sadece örnekleme (siyah ve mavi kareler olarak çizilen) YG sınırları içinde kayıt için kullanıldı. Filmler yapılan başvuru bölümünde (siyah kareler) ve ilgili yerlerde arama bölümünde (mavi kareler) (III). (C) bir test yeterli büyütme her örnekleme alanda yapılır; birkaç birleştirilmiş görüntülerini oluşan bir montaj (Bu durumda, 2 x 2 görüntüleri birlikte birleştirilmiş) gerekirse yapılır (ı); bir sayım çerçeve oluşturulur ve görüntüde bir kaplama olarak gösterilen, yapıları zarfında belgili tanımlık çerçevelemek vekabul çizgiler'(kesik çizgili çerçeve çizgileri)-var sayılır, ama değilyasak çizgiler'(kalın Çerçeve çizgileri) (II). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 . Ultra-ince bölümleri tarafsız bir sayım çerçeve ile bir çift ölçüm ultrastructural parametreleri. (A) ImageJ windows sayma ve hücresel yapılar analiz etmek için kullanılan genel bakış. Sol tarafta elektron test sayım çerçeve ile bir bindirme olarak gösterir. Sağ tarafta: damla-aşağı yemek listesi (üst) ve (aşağıda); araç ile ImageJ kullanıcı arayüzü (mavi dikdörtgen) ObjectJ Nesne Düzenleyicisi'ni (yeşil dikdörtgen); ölçme araçları nerede seçilebilir ObjectJ araçları penceresi (turuncu dikdörtgen) ve nerede tüm ölçümler belgelenen ObjectJ sonuçları penceresi (siyah dikdörtgen). (B) işaretli sinapslarda üzerinde elektron test (sinapslarda üzerinde her iki bölümde - oklar; yalnızca arama bölümü-ok başları üzerinde sinaps) görüntülenmesini ayrıntı. Bu çok noktaya aracını kullanarak işaretlenir (kırmızı daire) ImageJ araç çubuğundan. (C) adları ve sinaptik özellikler ölçüm parametreleri ObjectJ araçlarıkullanılarak tanımlanır. Marker-araç ve özellik ilgi seçilir ve resimde sol fare tıklama yapısı boyunca tarafından çizilmiş anahat. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Alanlar bir yatırım Getirisi için filtre enerji iletim elektron mikroskobu içinde elemental eşleme için örnekleme seçilmesi. SerialEM ilgi bir bölge seçmek için ve örnekleme alanlarda normal aralığı (A ve B görüntülerde pembe haç), yüksek bir dizi önermek için kullanılır. Bir komut dosyası sonra rastgele örnekleme alanlarından (önceden tanımlanmış Bu koordinatlar) edinme için seçer. Zavallı aydınlatma ile örnekleme alanlarda 20 de ışıklı örnekleme alanları içinde ROI seçmiş olduğunuz sürede ızgara çubukları ve komut dosyası durur önlemek için reddedilir. (A) mümkün örnekleme alanlarda yüksek bir dizi ile bir çokgen tarafından özetlenen ilgi tüm alanı genel bakış (B) detay örnekleme alanları rasgele seçimden önce gösterilen A X. işaretlenmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Elemental Haritası (EFTEM) edinme örneği. (A) parlak alan TEM test alanı satın alma noktası etrafında. Rasgele seçilen bir alan bir temel harita elde etmek için kullanılan ve siyah bir dikdörtgen tarafından işaretlenir. (B) EFTEM ön pencere resim rastgele seçilen alanda yapılan kenar. (C) EFTEM sonrası aynı bölgede yapılan pencere resim kenar. (D) Elemental demir aynı çevrenin (M-kenar) haritası. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Burada sunulan iş akışı araştırmacı tarafsız bir biçimde ultrastructural özellikleri üzerinde veri almak sağlar. Bu çok daha az zaman alıcı birim soruşturma seri bölümlerden daha var. Bu hedefe ulaşmak için birkaç farklı uygulamaları kullanılır. (Kullanılabilirlik, lütfen iletişim için karşılık gelen yazar) ilk başta bir rasgele sahne-örnekleme alanı koordinatları seçmek için üst karakter tanıtmak için ısmarlama RPS yazılımımız kullanılır. Bu yatırım Getirisi sistematik bir üniforma rastgele örnekleme sağlar. Daha sonra belirli yapıları sayımlarda biz nerede 2 ardışık bölümlerde bilinen mesafe ile karşılaştırılır, biz kullanılan önceki çalışmalar^13,14,15 ' e göre yeni bir yol disector yöntemi adapte bizim özel yapım RPS yazılım sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme için. Bu 3D yeniden inşa seri bölümler tüm birimlerden karşılaştırıldığında zaman kazandırır. Özel yapım RPS yazılım özellikle mikroskop iş akışı çoğaltılması için kısıtlayıcı bir faktör olan bir tür için geliştirilmiştir. Bu özel yazılım bir alternatif komut dosyalarına izin veren ve diğer mikroskop modelleri ile uyumlu bir uygulama olacaktır.

Biz başarıyla kullanılan bu yaklaşım için bizim karşılaştırmalı çalışmalar^4,5. Ultra-ince kesitler nöronal doku, ilgi alanı özetlenen ve görüntüleri bu alanda sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme tarafından alındı. Bu ilgi, dentat gyrus polimorf tabakası alanı olan yaklaşımımız için yararlı olabilir araştırmak için oldukça küçük bir alan olduğunu belirtmek zorunda. Rastgele yerleştirilmiş bir disector içinde DCV sayısı değerlendirildi ve birkaç ultrastructural şekil-in yetişkin fareler DGpl sinapslar SE ve EE yanı sıra yetişkin WT yetişkin NPY nakavt fareler ve fareler yer alır. Yaklaşımımız, toplanan veri değişiklikleri incelenen parametrelerden bazıları gösterdi. Bu bulgular Juvenil hayvanlar²benzer diğer çalışmalarda olanlardan doğruladı.

Bir dezavantajı bu iş akışının deneysel kullanım kullanıcılar (bizim durumumuzda, kullanıcı arabirimi, TEM seri bölüm farklı arayüzü ile rahat olsun gerek bu multi-application-yaklaşım kullanım kolaylığı açısından ideal olmadığını olabilir RPS yazılım ve SerialEM yazılım). Tüm uygulamaları verimli bir şekilde işlemek öğrenme zaman alıcıdır ve dikkate alınmalıdır. Ancak, bu iş akışıyla kullanmak öğrenme zaman yatırım hala seri bölümü TEM ile tüm birimleri çözümlemek için gereken zaman içinde açıkça olumlu. Güvenilir veri¹ bölüm/birim yüksek miktarda araştırmak gerek kalmadan sunmak için yeterli ilgi alanında sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme tarafından yerleştirilen bir disector kullanma yöntemidir.

Doku ve yapıların korunması sadece ilgi alanı belirsizliğe yer bırakmadan tanımlayan için de yapısal özelliklerini değerlendirmek için çok önemli değil gibi çalışmalarımız sonucu en üst düzeye çıkarmak için numune hazırlama sırasında kendine iyi bak hayati oldu. Çok önemli bir faktör ve bu yöntemin belki başka bir dezavantajı olduğunu kaliteli Ultra-ince kesitler çiftlerinin gereklidir: hiçbir delik veya birini kullanarak bölümleri soruşturma altında alanı kapsayacak kırışıklıkları olmalıdır ve bölüm kalınlığı olmalıdır homojen yapılmaktadır. Araştırmacı ultramicrotomy, iyi eğitilmiş olmalı. Bakımı da bu bölümleri elektron ışını zarar duyarlıdır ve kolayca altını üstüne gibi TEM bölümlerde Imaging gerçekleştirilecek var. Ayrıca, doğru numarayı örnekleme alanların yatırım Getirisini seçmek önemlidir. Bağlı olarak deneysel amacı, dikkatli bir şekilde ayarlanması büyütme oranını elektron filmler var. Bizim deneyler için özel olarak, merkezi sinir sistemindeki sinapslar sayma 20 bir bölümünde ilgi 30,25 µm² alana sahip en iyi bölgeleridir. Bu su kuyusu içinde güvenilir sonuçlar elde etmek için (bizim durumda sinapslarda, sinaptik özellikleri ve DCV) söz konusu özellikleri tanıma personel yetiştirmek için tavsiye edilir. Sinapsların tanımlamak için sinaptik veziküller tanımlanabilir olmalıdır ve bu en az 10 çözümlenmesini gerektiren nm. Bunun için 5000 X büyütme en uygun olan ama büyütmeyi kamera konumunu ve türü gibi donanım parametreleri bağlıdır ve diğer mikroskop ve/veya fotoğraf makinesi türleri için adapte etmesi gerekir belirtmek gerekiyor. Ayrıca protokol uygulamaları özel bir TEM için kullanır ve kullanıcıların diğer modelleri ile Kur farklılıkları göz önünde bulundurmanız gerekir kaydetti vardır.

Biz (bir TEM yüksek çözünürlüklü gerektiğinde) araştırma soru sistematik bir üniforma talepleri bizim iş akışı sadece nörolojik ama biyolojik bilim ve malzeme bilimi geniş bir alanda pek çok diğer uygulamalar için adapte edilebilir inanıyorum rastgele örnekleme ve muayene için örnekler miktarını sorar zamanı bir verimli şekilde analiz için. Örneğin, biz şu anda demir depoları insan beyninin yerelleştirme ilgilendi. Bunun için biz son zamanlarda bizim iş akışı, ultra-ince bölümlerinde rasgele seçilmiş bölgelerde elementel analiz etkinleştirmek için adapte edilmiştir. İş akışı için gerekli olan uygulama sayısını en aza indirmek için rasgele bir biçimde seçilebilir noktaları önceden belirtmek üzere sahne alanı taşımak için programlanabilir çünkü yalnızca, SerialEM yazılımı kullanarak geçerli amaçladık. Biz iş akışını tamamen automatizing amacı ile TEM denetlemek için özel komut dosyaları oluşturdu. Bu tatmin edici sonuçlar vermemiştir filtre uygulanmış görüntüleme modunda autofocusing dışında mümkün olmuştur. Böylece DM yazılım odaklanarak ve enerji filtre görüntüleri elde etmek için kullanılır.

Özetle, biz elektron Filmler tarafsız bir şekilde elde etmek yardımcı yazılım çözümleri sunuyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pentobarbital	SigmaAldrich	P3761
Formaldehyde	Merck	1040051000	1kg
Glutardialdehyde	Science Services	E 16210	25%; 100ml; EM grade
cacodylate buffer	Merck	C4945	250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate
Thionine acetate/Ceristain	Merck	861340
acetic acid	Merck	1000631000	1 L
Sodium hydroxide	Merck	1064951000	1 kg, pellets
osmium tetraoxide	Science Services	E 19110	10x1g
TAAB embedding resin	Science Services	TAT001	500g
DMP-30	Science Services	TAD024	100g
DDSA	Science Services	TAD025	500g
Uranyl acetate dihydrate	Plano GmbH	19481	depleted, 25g
Ultrastain 2	Leica	16707235	Lead citrate
Toluidine blue solution	Agar Scientific	AGR1727	10g
Pioloform	Plano GmbH	R1275	10g Powder
Proylenoxide	SigmaAldrich	82320-1L	1L
DPX embedding medium	Plano GmbH	R1320	embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml
Vibratome, Leica VT 1000	Leica Microsystems, Vienna, Austria
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Tecnai G2 20	FEI,Eindhoven, Netherlands
Megaview wide angle camera	Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany
US 1000 digital camera	Gatan, Pleasanton, USA
TEM Imaging Analysis Software	FEI,Eindhoven, Netherlands
FEI Serial Section Software	FEI,Eindhoven, Netherlands
Fiji, ImageJ 1.52e	National Institute of Health, USA
SPSS 20.0	SPSS Inc., Chicago, IL, USA
SerialEM	Regents of the University of Colorado
RPS (random point sampling) software 0.9a	custom-made
Disector v1.0.2 (ImageJ macro)	custom-made
EFTEMSerialEM (SerialEM script)	custom-made