Micronization מכני של Lipoaspirates לטיפול רגנרטיבית

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשיג סטרומה השבר בכלי הדם של רקמת שומן באמצעות סדרה של תהליכים מכניים, הכוללים תחליב centrifugations מרובים.

Abstract

השבר בכלי הדם סטרומה (SVF) הפך להיות כלי משובי עבור מחלות שונות; עם זאת, החקיקה מסדיר בקפדנות היישום הקליני של התא מוצרים באמצעות collagenase. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור תערובת להזרקה של תאים SVF מטריצה חוץ-תאית מקורי מתוך רקמת שומן על ידי תהליך מכאנית בלבד. Lipoaspirates הם הכניסו לתוך צנטריפוגה, ויצא ב x 1,200 g למשך 3 דקות. השכבה האמצעית שנאספו, הפרדתו בשתי שכבות (צפיפות גבוהה שומן בחלק התחתון) ושומן בצפיפות נמוכה בחלק העליון. השכבה העליונה היא ישירות emulsified על ידי העברת intersyringe, בקצב של 20 מ"ל/s עבור x 6 8 x. השומן emulsified הוא centrifuged ב x 2,000 g למשך 3 דקות, ואת החומר דביק מתחת לשכבת הנפט ונשתמש כהגדרתו של מטריצה חוץ-תאית (ECM) / SVF-ג'ל. השמן על השכבה העליונה נאסף. כ- 5 מ ל שמן להוסיף 15 מ"ל של שומן בצפיפות גבוהה, emulsified על ידי העברת intersyringe, בקצב של 20 מ"ל/s עבור x 6 8 x. השומן emulsified הוא centrifuged ב x 2,000 g למשך 3 דקות, והוא החומר הדביק גם ECM/SVF-ג'ל. לאחר ההשתלה של ECM/SVF-הג'ל לתוך עכברים עירום, השתל שנקטפו, מוערך על ידי בדיקה היסטולוגית. התוצאה מראה כי המוצר הזה יש פוטנציאל להתחדש לתוך רקמת שומן רגילה. ההליך זה הליך פשוט, יעיל דיסוציאציה מכני לתמצת את התאים SVF נעוץ ECM תומכת הטבעי שלהם למטרות משובי.

Introduction

תא גזע טיפולים מספקים שינוי פרדיגמה רקמות תיקון והתחדשות כך הם עשויים להציע של משטר טיפולי חלופיים עבור מחלות שונות¹. תאי גזע (למשל, גזע pluripotent המושרה, תאי גזע עובריים) הפוטנציאל הטיפולי נהדר אבל הם מוגבל בשל תא ושיקולים אתיים. שומן-derived mesenchymal סטרומה/תאי גזע (השיקופיים) הם קל להשיג lipoaspirates, שאינם כפופים למגבלות זהות; לכן, זה הפך מסוג תאים אידיאלי עבור רפואה רגנרטיבית מעשי². בנוסף, הם הינם nonimmunogenic וכוללים שפע המשאבים השומן autologous³.

כיום, השיקופיים מתקבלים בעיקר על ידי בתיווך collagenase עיכול של רקמת שומן. השבר בכלי הדם סטרומה (SVF) של רקמת שומן מכיל השיקופיים, תאים ובתאים אנדותל, pericytes של תאים חיסוניים. למרות קבלת צפיפות גבוהה של SVF/השיקופיים enzymatically הראו שיש השפעות מועילות, החקיקה במספר מדינות מסדיר בקפדנות את היישום הקליני של מוצרים מבוססי תאים באמצעות collagenase⁴. לעכל את רקמת שומן עם collagenase למשך 30 דקות כדי 1 h כדי להשיג SVF התאים, מגביר את הסיכון של שני חומרים אקסוגניים הכנה, המתפללים. התרבות חסיד הטיהור של השיקופיים, אשר לוקח ימים עד שבועות, דורשים ציוד מעבדה ספציפי. יתר על כן, רוב המחקרים, SVF תאים, השיקופיים משמשים ההשעיה. בלי ההגנה של מטריצה חוץ-תאית (ECM) או נושא אחר, תאים פנויים פגיעים, לגרום השמירה תא המסכן לאחר ההזרקה, לסכן את התוצאה הטיפולית⁵. מכל הסיבות הללו להגביל יישום נוסף של טיפול בתאי גזע.

להשיג השיקופיים של רקמת שומן ללא עיכול בתיווך collagenase, מספר הליכים עיבוד מכניים, כולל צנטריפוגה, מכני קוצץ, גיזום, pureeing, הא, היה מפותח^{6,7 , 8 , 9}. שיטות אלה נחשבים לדחוס רקמת ו השיקופיים ע י מכנית שיבוש adipocytes בוגרת ושלפוחיות שלהם המכילים שמן. יתר על כן, ההכנות הללו, המכיל ריכוז גבוה של השיקופיים, הראה פוטנציאל טיפולי רב כמו רפואה רגנרטיבית של בעל חיים מודלים^8,9,10.

בשנת 2013, Tonnard. et al. הציג את nanofat הרכבה טכניקה, אשר כרוך בהפקת emulsified lipoaspirates על ידי intersyringe עיבוד¹¹. הטיית הכוח שנוצר על-ידי intersyringe הסטה יכול לשבור באופן סלקטיבי adipocytes בוגרת. בהתבסס על הממצאים שלהם, פיתחנו שיטת עיבוד מכניים גרידא מסירה את רוב השומנים נוזל, lipoaspirates משאיר רק SVF תאים, ECM fractionated, אשר הוא ECM/SVF-ג'ל¹². במסמך זה, אנו מתארים את הפרטים של תהליך מכני של האדם, נגזר רקמת שומן כדי לייצר את ה-ECM/SVF-הג'ל.

Protocol

מחקר זה אושרה על ידי ועדת הבדיקה האתית Nanfang חולים, גואנגג'ואו, סין. רקמת שומן נאסף מתורמים מאוד בריאים שנתן בכתב הסכמה מדעת להשתתף במחקר. כל ניסויים בבעלי חיים היו אושרה על ידי Nanfang החולים טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה וביצע בהתאם לקווים המנחים של בריאות לאומי המועצה למחקר רפואי (סין).

1. הכנה ECM/SVF-ג'ל

1. שמן הקציר.
   1. לבצע שאיבת שומן על אדם עם בצינורית מרובה 3 מ מ, אשר מכילה מספר חורים חד צדדי של 1 מ מ קוטר, ב-0.75 atm של לחץ היניקה.
   2. אוספים 200 מ של lipoaspirates בשקית סטרילית.
2. להכין שמן קולמן.
   1. להעביר את lipoaspirates לתוך צינורות 50 מ ל ארבע ולאפשר את השומן שנקטפו לעמוד עדיין למשך 10 דקות.
   2. לאסוף את השומן על השכבה העליונה לתוך שני צינורות 50 מ ל באמצעות פיפטה רחב-עצה להעביר, למחוק את החלק הנוזלי על השכבה התחתונה.
   3. באמצעות צינורות 50 מ ל, centrifugate על שכבת השומן ב 1,200 x g בטמפרטורת החדר (RT) למשך 3 דקות.
   4. מגדירים השכבה העליונה (כ 80 מ ל) שמן קולמן.
   5. להעביר 2/3 העליון של השומן קולמן צינור בפטרת באמצעות פיפטה רחב-עצה ולהגדיר את החלק הזה כשומן בצפיפות נמוכה.
   6. להעביר 1/3 התחתון של השומן קולמן עוד צינור בפטרת באמצעות פיפטה רחב-עצה ולהגדיר את החלק הזה כשומן בצפיפות גבוהה.
3. לייצר ECM/SVF-ג'ל משומן בצפיפות נמוכה.
   1. באמצעות שני מזרקים 20 מ"ל מחובר על ידי מחבר נעל-סכינים סטריליים נקבה לנקבה (עם קוטר פנימי של 2.4 מ מ) intershift 20 מ של שמן בצפיפות נמוכה.
   2. לשמור על מהירות הסטה יציב (20 מ ל/s) וחזור עבור x 6 8 x.
   3. Centrifugate התערובת על 2,000 x g ב- RT למשך 3 דקות.
   4. לאסוף את החלק שמן על גבי צינור 10 מ"ל, באמצעות פיפטה רחב-טיפ של RT לשימוש נוסף.
   5. לאסוף את החומר הדביק בתוך השכבה האמצעית, המהווה SVF/ECM-ג'ל (איור 1א'), באמצעות פיפטה של wide-עצה, ולמחוק את הנוזל על השכבה התחתונה.
4. לייצר ECM/SVF-ג'ל משומן בצפיפות גבוהה.
   1. הוסף 5 מ ל שמן (שנאספו משלב 1.3.4) 15 מ"ל של שומן בצפיפות גבוהה.
   2. Intershift השומן מעורבים בין מזרקים 6 x 8 x עד flocculate נוצרת בתוך האמולסיה.
   3. Centrifugate התערובת על 2,000 x g ב- RT למשך 3 דקות.
   4. למחוק את החלק שמן על גבי.
   5. לאסוף את החומר הדביק בתוך השכבה האמצעית (ECM/SVF-ג'ל) באמצעות פיפטה רחב-עצה ולמחוק את הנוזל על השכבה התחתונה.
   6. מערבבים ECM/SVF-הג'ל מן השלבים 1.3.5 ו 1.4.5.

2. דגם ה-ECM/SVF-ג'ל שתל עכבר ערום

1. עזים ומתנגד העכברים עירום (8 שבועות הישן, נקבה) עם איזופלוריין (1% - 3%) שאיפת הרדמה בחדר הניתוח בעלי חיים.
2. להעביר את ה-ECM/SVF-הג'ל מזרק 1 מ"ל.
3. לחבר את המזרק 1 מ"ל בצינורית חדירה בוטה.
4. הכנס את הצינורית subcutaneously בכל אגף של העכבר.
5. להזריק mL 0.3 של ECM/SVF-הג'ל.

3. רקמות קציר 3, 15 ו- 90 ימים לאחר ההזרקה ECM/SVF-ג'ל

1. עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין (1% - 3%) שאיפת הרדמה.
2. להקריב את העכברים בשיטת נקע בצוואר הרחם.
3. לעשות חתך בקו האמצע של העור הגבי של העכבר עם מספריים כירורגיים.
4. לנתח ולקצור את השתלים שמן משני הצדדים של העכבר. להטביע את השתלים שמן paraformaldehyde 4% ב RT בן לילה.
5. מייבשים את הרקמה להגדיל את ריכוזי אתנול: 70% אתנול, שני שינויים, 1 h כל; 80% אתנול, שינוי אחד, 1 h; 95% אתנול, שינוי אחד, 1 h; 100% אתנול, שלושה שינויים, 1.5 h כל; קסילן, שלושה שינויים, 1.5 שעות כל אחד.
6. לחדור את הרקמה עם פרפין (58-60 ° C), שני שינויים, 2 h.
7. להטביע את הרקמה לגושי פרפין. לחתוך קטעים-עובי של 4 מיקרומטר ולשים אותם על שקופיות.

4. hematoxylin ואאוזין מכתים

1. Deparaffinize השקופיות בלוק פראפין בהשריה של קסילן אני II, III (10 דקות כל אחד).
2. נתרענן הסעיפים רקמות על ידי הכנסתם הפחתת ריכוז (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) של אתנול אמבטיות למשך 3 דקות.
3. יש לשטוף את המקטעים רקמות במים מזוקקים (5 דקות).
4. כתם בסעיפים רקמות hematoxylin במשך 5 דקות.
5. לשטוף את הסעיפים הרקמה הקשה במים במשך 20 דקות Decolorize זורמים ב 1% אלכוהול חומצה (1% HCl ב-70% אלכוהול) עבור 5 ס' שטיפה במים ברז זורמים עד הסעיפים כחולות שוב.
6. להוסיף 2-3 טיפות של Eosin Y לצבוע ישירות על השקופיות באמצעות פיפטה, והנח את צבען להגדיר עבור 10 דקות.
7. לשטוף את השקופיות במי ברז למשך 1-5 דקות.
8. מייבשים את השקופיות להגדיל את ריכוז (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) אתנול למשך 3 דקות.
9. נקה השקופיות קסילן I ו- II למשך 5 דקות.
10. הר בשקופיות הרכבה מדיה.

5. immunofluorescent מכתים

1. Deparaffinize בסעיפים רקמות קסילן אני II, III (5 דקות כל אחד).
2. נתרענן הסעיפים רקמות על ידי הכנסתם ריכוזים שונים (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) של אמבטיות אלכוהול למשך 3 דקות.
3. דגירה הסעיפים בפתרון₂ O 3% H₂ב- RT. מתנול עבור 10 דקות.
4. לשטוף את השקופיות 2 x עם מים מזוקקים, 5 דקות כל אחד.
5. שחרר את השקופיות סל שקופיות. מוסיפים 300 מ ל 10 מ מ ציטראט מאגר (pH 6.0), דגירה השקופיות ב 95-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
6. מגניב השקופיות RT כעשרים דקות.
7. לשטוף את השקופיות 2 x עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), 5 דקות כל אחד.
8. להוסיף 100 µL של 10% הסרום שור העובר על השקופיות, דגירה בתוך תא humidified ב RT לשעה.
9. דגירה הסעיפים עם נוגדן ראשוני פתרון (שפן אנטי עכבר Perilipin, 1:400) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
10. לשטוף את השקופיות עם PBS 3 x, 5 דקות.
11. דגירה הסעיפים עם פתרון נוגדנים משניים (אג חזיר אנטי-גינאה עז-488) עבור 2 h-RT.
12. לשטוף את השקופיות עם PBS 3 x, 5 דקות.
13. . נגבי את המים סביב הסעיף בנייר טישו נקי.
14. ירידה 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ו- isolectin מצומדת אלקסה עבור חיל הים 488 אל המעגל כדי לכסות את החלק בשקופית.
15. הר על coverslips ולתת להן להתייבש בחושך.
16. לצפות בשקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

לאחר העיבוד השומן קולמן ECM/SVF-ג'ל, הנפח של שמן שהושלכו תופס 80% של הכרך האחרון, רק 20% מכלל רקמת שומן נשמר מתחת לשכבת הנפט נחשב SVF/ECM-ג'ל (איור 1א'). ECM/SVF-ג'ל בעל מרקם נוזלי דמוי חלקה מאפשר לו לעבור דרך מחט בסדר 27 G; אולם, קולמן שומן מורכב מבנה אדיפוז נפרד עם סי...

Discussion

טיפול משובי מבוססי תאי גזע הראה תועלת פוטנציאלית רבה במחלות שונות. השיקופיים הם מועמדים בולטים טיפולית כי הם קלים להשיג ואת יש יכולת התחדשות רקמות הרומן¹⁵ותיקון של רקמות. עם זאת, קיימות מגבלות להרחיב את היישום הקליני שלה, מכיוון שהיא דורשת פרוצדורות מסובכות לבודד תאים, collagenase ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus