Механический микронизации Lipoaspirates для восстановительной терапии

Здесь мы представляем протокол для получения стромальные сосудистой дроби от жировой ткани через ряд механических процессов, которые включают эмульгирования и несколько centrifugations.

Аннотация

Стромальные сосудистой дроби (СФДВ) стал регенеративной инструментом для различных заболеваний; Однако законодательство строго регулирует клинического применения клеточных продуктов с помощью коллагеназы. Здесь мы представляем протокол для создания инъекционные смеси СФДВ клеток и родной внеклеточная матрица из жировой ткани, чисто механического процесса. Lipoaspirates поместить в центрифуге и вращаться на 1200 x g на 3 мин. Средний слой собираются и разделены на два слоя (плотностью внизу) и низкой плотностью жиров на вершине. Верхний слой непосредственно эмульгированных переключив intersyringe, со скоростью 20 мл/сек для 6 x до 8 x. Эмульгированные жиры центрифугируют в 2000 x g на 3 мин, липкое вещество под слоем нефти является сбор и определяется как внеклеточного матрикса (ECM) / SVF-гель. Масло в верхнем слое собирается. Примерно в 5 мл масла добавляется 15 мл высокой плотности жира и эмульгированных переключив intersyringe, со скоростью 20 мл/сек для 6 x до 8 x. Эмульгированные жиры центрифугируют в 2000 x g на 3 мин, и липкое вещество также ECM/SVF-гель. После пересадки ECM/SVF-гель в обнаженной мышей трансплантат собирают и оценены гистологическое обследование. Результат показывает, что этот продукт имеет потенциал, чтобы восстановить в нормальных жировой ткани. Эта процедура не является процедурой простые, эффективные механические диссоциации уплотнить клетки СФДВ, встроенный в их естественной поддержки ECM для восстановительных целей.

Введение

Стволовых клеток лечение обеспечивают парадигмы для восстановления тканей и регенерации, так что они могут предложить альтернативные терапевтический режим для различных заболеваний¹. Стволовые клетки (например, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и эмбриональных стволовых клеток) имеют большой лечебный потенциал, но ограничены из-за регулирования клеток и этических соображений. Жировой производные мезенхимальных стромальных/стволовые клетки (ИСС) легко получить от lipoaspirates и не подлежат тем же ограничениям; Таким образом он стал тип ячейки для практической восстановительной медицины². Кроме того они nonimmunogenic и обильные ресурсы из аутологичной жира³.

В настоящее время ИСС получаются главным образом коллагеназы опосредованной пищеварение жировой ткани. Стромальные сосудистой часть жировой ткани (СФДВ) содержит ИСС, клетки эндотелия прародителю, pericytes и иммунных клеток. Хотя получение высокой плотности СФДВ/ИСС ферментативно было показано иметь благотворное воздействие, в нескольких странах законодательство строго регулирует клиническое применение продуктов на основе клеток с помощью коллагеназы⁴. Переваривания жировой ткани с коллагеназы за 30 мин до 1 ч для получения СФДВ клеток увеличивает риск как экзогенные материал в подготовке и биологического загрязнения. Адгезивная культуры и очистки ИСС, который принимает дней недели, требуют конкретного лабораторного оборудования. Кроме того в большинстве исследований, используются СФДВ клетки и ИСС в суспензии. Без защиты внеклеточного матрикса (ECM) или другой перевозчик свободные ячейки являются уязвимыми, вызвать задержку бедных клеток после инъекции и компромисс лечебный результат⁵. Все эти причины ограничить дальнейшее применение стволовых клеток.

Чтобы получить ИСС из жировой ткани без коллагеназы опосредованной пищеварение, несколько процедур механической обработки, включая центрифугирования, механического измельчения, дробления, пюре и измельчения, были развитые⁶^,⁷ ^, ⁸ ^, ⁹. Предполагается, что эти методы уплотняют ткани и ИСС, механически нарушая Зрелые адипоциты и их везикул, содержащих нефть. Кроме того эти препараты, содержащие высокие концентрации ИСС, показал значительный терапевтический потенциал как регенеративной медицины в животных моделей⁸^,⁹^,¹⁰.

В 2013 году Tonnard et al. представил nanofat, прививки техника, которая включает в себя производство эмульгированные lipoaspirates, intersyringe, обработки¹¹. Усилие сдвига, созданный intersyringe ветра может выборочно перерыв Зрелые адипоцитов. Основываясь на своих выводах, мы разработали метод чисто механической обработки, который удаляет большинство липидов и жидкость в lipoaspirates, оставляя только СФДВ клетки и фракционированный ECM, который ECM/SVF-гель¹². Здесь мы описываем подробности процесса механического человека производные жировой ткани производить ECM/SVF-гель.

протокол

Это исследование был одобрен этические Наблюдательный Совет в больнице Nanfang, Гуанчжоу, Китай. Жировая ткань была собрана из здоровых доноров, которые дал письменное информированное согласие принять участие в исследовании. Все эксперименты на животных были утверждены Nanfang больница институциональных животное уход и использование Комитетом и в соответствии с руководящими принципами национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (Китай).

1. Подготовка ECM/SVF-геля

Урожай жира.
1. Выполнения липосакции на человека с 3-мм многопортовые канюли, которая содержит несколько резкий боковые отверстия 1 мм в диаметре, на -0,75 atm давление всасывания.
2. Собирайте 200 мл lipoaspirates в стерильный пакет.
Подготовьте Колман сало.
1. Перевести lipoaspirates на четыре 50 мл трубки и позволяют заготовленной жира, чтобы стоять еще 10 мин.
2. Собирать жир на верхний слой в два 50 мл трубки с помощью пипетки ширококонечных для передачи и отказаться от части жидкого на нижнем слое.
3. С помощью 50 мл трубки, центрифугировать жирового слоя в 1200 x g при комнатной температуре (RT) 3 мин.
4. Определите верхний слой (примерно 80 мл) как Колман сало.
5. Перенести верхний 2/3 Колман Сало 20 мл с помощью пипетки ширококонечных и определить эту часть как low-density жира.
6. Перенести нижней 1/3 Колман сало еще 20 мл с помощью пипетки ширококонечных и определить эту часть как высокой плотности жира.
Производят ECM/SVF-гель от низкой плотности жира.
1. С помощью двух шприцы 20 мл, женщина женщина разъем Luer-Lock (с внутренним диаметром 2,4 мм) соединен intershift 20 мл low-density жира.
2. Держать конюшню перенося скорость (в 20 мл/с) и повторите для 6 x до 8 x.
3. Центрифугировать смеси на 2000 x g в РТ за 3 мин.
4. Соберите часть нефти на вершине в тубе 10 мл с помощью пипетки ширококонечных RT для дальнейшего использования.
5. Собирать липкое вещество в средний слой, который ECM/SVF-гель (рис. 1A), используя широкий наконечник пипетки и отбросить жидкости в нижнем слое.
Производят ECM/SVF-гель с высокой плотности жира.
1. Добавьте 5 мл масла (сборник из шага 1.3.4) 15 мл высокой плотности жира.
2. Intershift смешанные жира между шприцы 6 x до 8 x до тех пор, пока flocculate наблюдается в пределах эмульсии.
3. Центрифугировать смеси на 2000 x g в РТ за 3 мин.
4. Отменить часть нефти на вершине.
5. Сбор липкое вещество в средний слой (ECM/SVF-гель) с помощью пипетки ширококонечных и утилизируйте жидкость в нижнем слое.
6. Смешайте ECM/SVF-гель от шагов 1.3.5 и 1.4.5.

2. ню мыши модель ECM/SVF-гель трансплантата

Анестезировать обнаженной мышей (8 недель старые, женщина) с изофлюрановая (1% - 3%) Ингаляционная анестезия в комнате животных операции.
Передать ECM/SVF-гель 1 мл шприц.
Подключите 1 мл шприц с тупым инфильтрации канюли.
Вставьте канюлю подкожно в каждом фланге мыши.
Придать 0,3 мл ECM/SVF-геля.

3. ткань уборка на 3, 15 и 90 дней после инъекции ECM/SVF-гель

Анестезировать мышей с изофлюрановая (1% - 3%) Ингаляционная анестезия.
Пожертвуйте мышей методом шейки матки дислокации.
Сделать надрез на срединной мыши спинной кожи с Ножницы хирургические.
Вскрыть и урожай жир имплантатов на обе стороны мыши. Внедрите жир имплантатов в параформальдегида 4% на RT на ночь.
Обезвоживания тканей в повышении концентрации этанола: 70% этанол, два изменения, 1 ч; 80% этанола, одно изменение, 1 ч; 95% этиловом спирте, одно изменение, 1 ч; 100% этанола, три изменения, 1,5 ч ксилол, три изменения, 1,5 ч.
Проникнуть в ткани с парафина (58-60 ° C), два изменения, 2 ч.
Внедрить в блоков парафина ткани. Вырезать секций при толщине около 4 мкм и положить их на слайдах.

4. гематоксилином и эозином

Deparaffinize блок слайды парафин путем замачивания их в ксилоле I, II и III (10 мин).
Увлажняет разделов ткани, передавая их через снижение концентрации (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) этанол ванн на 3 мин.
Промойте разделов ткани в дистиллированной воде (5 мин).
Пятно в разделах ткани в гематоксилином за 5 мин.
Промойте разделов ткани в проточной водопроводной воды за 20 мин Decolorize кислоты спиртовой 1% (1% HCl в 70% спирта) для 5 s. промыть в проточной водопроводной воды до тех пор, пока разделы синий снова.
Добавить две-три капли эозина Y краски непосредственно на слайды, пипетки и пусть красителя набор для 10 мин.
Слайды промойте в проточной воде в течение 1-5 мин.
Обезвоживает слайды в повышении концентрации (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) этанола на 3 мин.
Снимите слайды в ксилоле I и II за 5 мин.
Смонтируйте слайды в монтаж средств массовой информации.

5. immunofluorescent окрашивание

Deparaffinize разделов ткани в ксилоле I, II и III (5 мин).
Увлажняет разделов ткани, передавая их через различные концентрации (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) алкоголь ванн на 3 мин.
Инкубируйте в подразделах 3% H₂O₂ решения в метаноле на RT за 10 мин.
Промойте слайды 2 x с дистиллированной водой, 5 мин.
Падение слайды в корзине слайд. Добавить 300 мл буфера цитрата 10 мм (pH 6.0) и инкубировать слайды при температуре 95-100 ° C на 10 мин.
Прохладный слайды в РТ за 20 мин.
Промойте слайды 2 x с фосфат амортизированное saline (PBS), 5 мин.
100 мкл 10% плода бычьим сывороточным на слайды и инкубировать в камере увлажненный в РТ за 1 час.
Инкубируйте в разделах основное антитело раствором (морская свинка анти мыши Perilipin, 1: 400) при 4 ° C на ночь.
Промойте слайды с PBS 3 x, 5 мин.
Инкубировать секции раствором вторичные антитела (IgG коза анти Гвинея свиньи-488) за 2 ч на RT.
Промойте слайды с PBS 3 x, 5 мин.
Протрите воды вокруг секции с чистой ткани бумаги.
Drop 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и Alexa Fluor 488-конъюгированных isolectin в круг, чтобы охватить раздел на слайде.
Маунт coverslips и дайте им высохнуть в темноте.
Наблюдать за слайды с флуоресцентный Микроскоп.

Результаты

После обработки Колман сало ECM/SVF-гель, объем отбрасываются нефти занимает 80% от окончательного объема, и только 20% объема жировой ткани сохранились в слой нефти рассматривается как ECM/SVF-гель (рис. 1А). ECM/SVF-гель имеет гладкую жидкость как текстуру...

Обсуждение

На основе стволовых клеток регенеративной терапии показал большие потенциальные выгоды в различных заболеваний. ИСС являются выдающиеся лечебные кандидатов, потому что они легко получить и имеют потенциал для восстановления тканей и регенерации тканей Роман¹⁵. Однако су?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальный научный фонд природы Китая (81471881, 81601702, 81671931), фонд естественных наук в провинции Гуандун Китая (2014A030310155), и администратор Nanfang Больница фонда (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus