Micronização mecânica de Lipoaspirates para terapia regenerativa

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a fração vascular do estroma do tecido adiposo através de uma série de processos mecânicos, que incluem emulsificação e múltiplas centrifugações.

Resumo

Fração de vascular do estroma (SVF) tornou-se uma ferramenta regenerativa para várias doenças; no entanto, a legislação estritamente regula a aplicação clínica dos produtos de célula usando a colagenase. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar uma mistura injectável de células SVF e nativo da matriz extracelular do tecido adiposo, por um processo puramente mecânico. Lipoaspirates são colocar em uma centrífuga e girou a 1.200 x g durante 3 min. A camada média é coletada e separada em duas camadas (alta densidade de gordura na parte inferior) e baixa densidade de gordura na parte superior. A camada superior é diretamente emulsionada deslocando-se intersyringe, a uma taxa de 20 mL/s para 6 x 8 x. A gordura emulsionada é centrifugada a 2.000 x g durante 3 min, e a substância pegajosa sob a camada de óleo é coletada e definida como a matriz extracelular (ECM) / SVF-gel. O óleo sobre a camada superior é coletado. Cerca de 5 mL de óleo é adicionado à 15 mL de gordura de alta densidade e emulsionado deslocando-se intersyringe, a uma taxa de 20 mL/s para 6 x 8 x. A gordura emulsionada é centrifugada a 2.000 x g durante 3 min, e a substância pegajosa é também ECM/SVF-gel. Após o transplante do ECM/SVF-gel em camundongos, o enxerto é colhido e avaliado através do exame histológico. O resultado mostra que este produto tem o potencial para se regenerar em tecido adiposo normal. Este procedimento é um procedimento de dissociação mecânica simples, eficaz para condensar as células SVF incorporadas em sua natural apoio ECM para fins regenerativos.

Introdução

Terapias de células-tronco fornecem uma mudança de paradigma para a regeneração e reparação tecidual para que eles possam oferecer um regime terapêutico alternativo para várias doenças¹. Células-tronco (por exemplo, as células-tronco pluripotentes induzidas e células-tronco embrionárias) têm um grande potencial terapêutico, mas são limitadas devido ao regulamento de célula e considerações éticas. Adiposo-derivados mesenquimais estromais/células-tronco (ASCs) são fáceis de obter do lipoaspirates e não sujeitos às mesmas restrições; assim, tornou-se um tipo de célula ideal para medicina regenerativa prática². Além disso, eles são nonimmunogenic e têm recursos abundantes de gordura autóloga³.

Atualmente, ASCs são obtidos principalmente por mediada por colagenase digestão do tecido adiposo. A fração vascular do estroma (SVF) do tecido adiposo contém células progenitoras endoteliais ASCs, pericitos e células do sistema imunológico. Embora a obtenção de uma elevada densidade de SVF/ASCs enzimaticamente foi mostrado para ter efeitos benéficos, a legislação em vários países estritamente regula a aplicação clínica dos produtos à base de célula usando colagenase⁴. Digerir o tecido adiposo com colagenase por 30 min a 1 h para obter as células SVF aumenta o risco de ambos material exógeno na preparação e contaminação biológica. A cultura aderente e a purificação de ASCs, que leva dias para semanas, exigem equipamentos laboratoriais específicos. Além disso, na maioria dos estudos, células SVF e ASCs são usados em suspensão. Sem a proteção da matriz extracelular (ECM) ou outra transportadora, células livres são vulneráveis, causar uma retenção de pobre célula após a injeção e comprometer o resultado terapêutico de⁵. Todas estas razões limitam a aplicação adicional de terapia com células tronco.

Para obter o ASCs do tecido adiposo sem digestão mediada por colagenase, vários procedimentos de processamento mecânico, incluindo a centrifugação, mecânica, picar, ralar, reduzir a puré e picagem, têm sido desenvolvidos^{6,7 , 8 , 9}. esses métodos são pensados para condensar o tecido e ASCs por perturbar mecanicamente adipócitos maduros e suas vesículas contendo óleo. Além disso, estas preparações, contendo altas concentrações de ASCs, mostraram considerável potencial terapêutico como medicina regenerativa em animal modelos^8,9,10.

Em 2013, et al . Tonnard introduziu o nanofat enxertia técnica, que envolve produzindo emulsionado lipoaspirates por intersyringe¹¹de processamento. A força de corte criada por intersyringe deslocando seletivamente pode quebrar adipócitos maduros. Baseado em seus findings, desenvolvemos um método de processamento puramente mecânico que remove a maioria dos lipídios e fluido no lipoaspirates, deixando apenas as células SVF e ECM fracionada, o que é ECM/SVF-gel¹². Aqui, descrevemos os detalhes do processo mecânico de humanos-derivadas de tecido adiposo para produzir o ECM/SVF-gel.

Protocolo

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de revisão ética em Nanfang Hospital, Guangzhou, China. Tecido adiposo foi coletado de saudáveis doadores que deu consentimento informado por escrito para participar no estudo. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de uso e Nanfang Hospital institucional Cuidado Animal e executados de acordo com as diretrizes da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (China).

1. ECM/SVF-gel de preparação

1. Gordura de colheita.
   1. Realizar a lipoaspiração em um ser humano com uma cânula de 3 mm multiporta, que contém vários buracos do lado afiado de 1 mm de diâmetro, -0,75 atm de pressão de sucção.
   2. Recolha 200 mL de lipoaspirates em um saco estéril.
2. Prepare-se gordura de Coleman.
   1. Transferir o lipoaspirates para quatro tubos de 50 mL e permitir que a gordura colhida ficar parado por 10 min.
   2. Coletar a gordura na camada superior em dois tubos de 50 mL, usando uma pipeta de ponta em toda a transferir e descartar a parte líquida na camada inferior.
   3. Usando tubos de 50 mL, centrifugate a camada de gordura a 1.200 x g , à temperatura ambiente (RT) por 3 min.
   4. Defina a camada superior (cerca de 80 mL) como gordura de Coleman.
   5. Transfira o superior 2/3 da gordura Coleman para um tubo de 20 mL, usando uma pipeta de ponta em todo o e definir esta parte como gordura de baixa densidade.
   6. O 1/3 inferior da Coleman gordura e traslado para outro tubo de 20ml usando uma pipeta de ponta em todo o e definir esta parte como gordura de alta densidade.
3. Produzir ECM/SVF-gel de baixa densidade de gordura.
   1. Usando duas seringas de 20 mL, conectadas por um conector de Luer-Lock fêmea-fêmea (com um diâmetro interno de 2,4 mm) para intershift de 20 mL de gordura de baixa densidade.
   2. Manter a velocidade de deslocamento estável (a 20 mL/s) e repita para 6 x 8 x.
   3. Centrifugate a mistura a 2.000 x g em RT por 3 min.
   4. Recolha a porção de óleo na parte superior em um tubo de 10 mL, usando uma pipeta de ponta em todo o no RT para utilização posterior.
   5. Coletar a substância pegajosa na camada média, o que é ECM/SVF-gel (Figura 1A), usando uma pipeta de ponta larga e descarte o líquido na camada inferior.
4. Produzir ECM/SVF-gel de alta densidade de gordura.
   1. Adicione 5 mL de óleo (coletado da etapa 1.3.4) para 15 mL de gordura de alta densidade.
   2. Intershift a gordura mista entre seringas 6 x 8 x até um flocular é observado dentro da emulsão.
   3. Centrifugate a mistura a 2.000 x g em RT por 3 min.
   4. Descarte a porção de óleo na parte superior.
   5. Coletar a substância pegajosa na camada média (ECM/SVF-gel) usando uma pipeta de ponta em todo o e descarte o líquido na camada inferior.
   6. Misture o ECM/SVF-gel da escadaria 1.3.5 e 1.4.5.

2. nu Mouse modelo de enxerto de ECM/SVF-gel

1. Anestesiar os camundongos (8 semanas velho, do sexo feminino) com isoflurano (1-3%) anestesia por inalação em uma sala de operação de animais.
2. Transferi o ECM/SVF-gel para uma seringa de 1 mL.
3. Conecte a seringa de 1 mL com uma cânula romba de infiltração.
4. Inserir a cânula por via subcutânea em cada flanco do mouse.
5. Injete 0,3 mL do ECM/SVF-gel.

3. tecido colheita na 3, 15 e 90 dias após a injeção de ECM/SVF-gel

1. Anestesiar os ratos com isoflurano (1-3%) anestesia por inalação.
2. Sacrifica os ratos pelo método de deslocamento cervical.
3. Fazer uma incisão na linha média da pele dorsal do mouse com uma tesoura cirúrgica.
4. Dissecar e colher os enxertos de gordura em ambos os lados do rato. Incorpore os enxertos de gordura no paraformaldeído 4% em RT durante a noite.
5. Desidratar o tecido em concentrações crescentes de álcool etílico: etanol a 70%, duas alterações, 1 h cada; 80% de etanol, uma mudança, 1 h; etanol a 95%, uma mudança, 1 h; 100% de etanol, três alterações, 1,5 h cada; xileno, três alterações, 1,5 h cada.
6. Infiltre o tecido com cera de parafina (58-60 ° C), duas alterações, 2h cada.
7. Incorpore o tecido em blocos de parafina. Seções de corte em uma espessura de cerca de 4 µm e colocá-los em slides.

4. hematoxilina e eosina coloração

1. Deparaffinize os slides de bloco de parafina mergulhando-os em xilol I, II e III (10 min cada).
2. Hidratar as secções de tecido, passando-os através de diminuir as concentrações (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) de banhos de etanol por 3 min cada.
3. Enxague as seções de tecido em água destilada (5 min).
4. Mancha os cortes histologicos em hematoxilina por 5 min.
5. Enxagúe as seções de tecido em água corrente por 20 min. Decolorize em álcool ácido 1% (1% HCl em álcool a 70%) para 5 s. enxaguar em água corrente, até as seções são azuis novamente.
6. Adicionar duas a três gotas de corante eosina Y diretamente sobre os slides com uma pipeta e deixe a tinta por 10 min.
7. Lave as lâminas em água da torneira por 15 min.
8. Desidratar os slides em aumentar as concentrações (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) de etanol por 3 min cada.
9. Limpe os slides em xilol I e II por 5 min cada.
10. Monte as lâminas em meios de montagem.

5. imunofluorescência coloração

1. Deparaffinize os cortes histologicos em xilol I, II e III (5 min cada).
2. Hidratar as secções de tecido, passando-os através de diferentes concentrações (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) de banhos de álcool para 3 min cada.
3. Incube as secções em solução 3% H₂O₂ em metanol em RT por 10 min.
4. Lave os slides 2 x com água destilada, 5 min cada.
5. Solte os slides em uma cesta de slide. Adicione 300 mL de 10 mM de tampão citrato (pH 6,0) e a incubar em 95-100 ° C por 10 min.
6. Legal os slides em RT por 20 min.
7. Lave os slides 2 x com tampão fosfato salino (PBS), 5 min cada.
8. Adicione 100 µ l de soro bovino fetal de 10% sobre as guias e incubá-los numa câmara umidificada no RT por 1h.
9. Incube as secções com solução de anticorpo primário (cobaia anti-rato Perilipin, 1: 400) a 4 ° C durante a noite.
10. Enxágue as lâminas com PBS 3 x, 5 min cada.
11. Incubar as secções com solução de anticorpo secundário (IgG de cabra anti-Guiné porco-488) por 2 h no RT
12. Enxágue as lâminas com PBS 3 x, 5 min cada.
13. Limpe a água ao redor da seção com papel de tecido limpo.
14. Caem ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e Alexa Fluor 488-conjugado isolectin o círculo para cobrir a seção no slide.
15. Montar as lamelas e deixe-os secar no escuro.
16. Observe os slides com um microscópio fluorescente.

Resultados

Depois de processar a gordura Coleman para ECM/SVF-gel, o volume de óleo descartado ocupa 80% do volume final, e apenas 20% do tecido adiposo, preservado sob a camada de óleo é considerado como ECM/SVF-gel (Figura 1A). ECM/SVF-gel tem uma textura suave do líquido, como que lhe permite passar por uma agulha fina de 27 G; no entanto, Coleman gordura é composta de uma estrutura integral adiposa com grandes fibras e só pode ir através de u...

Discussão

Terapia regenerativa baseada em células-tronco tem mostrado um grande benefício potencial em diferentes doenças. ASCs são excelentes candidatos terapêuticos porque eles são fáceis de obter e ter a capacidade de reparação tecidual e a regeneração de novos tecidos¹⁵. No entanto, existem limitações para expandir sua aplicação clínica, pois requer procedimentos complicados para isolar as células e colagenase para processamento⁶. Assim, é essencial desenvolver ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus