Micronisation mécanique de Lipoaspirates pour la thérapie régénérative

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour obtenir la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux grâce à une série de procédés mécaniques, incluent l’émulsification et plusieurs centrifugations.

Résumé

Stroma vasculaire fraction (SVF) est devenu un outil régénératrice pour diverses maladies ; Cependant, la législation réglemente strictement l’application clinique des produits cellulaires à l’aide de la collagénase. Nous présentons ici un protocole visant à générer un mélange injectable de cellules SVF et native matrice extracellulaire du tissu adipeux par un procédé purement mécanique. Lipoaspirates sont placés dans une centrifugeuse et filés à 1 200 x g pendant 3 min. La couche intermédiaire est recueillie et séparée en deux couches (graisses haute densité en bas) et faible densité sur le dessus. La couche supérieure est directement émulsifiée par transfert intersyringe, à raison de 20 mL/s pour 6 x à 8 x. La graisse émulsionnée est centrifugée à 2 000 x g pendant 3 min, et la substance collante sous la couche d’huile est recueillie et définie comme la matrice extracellulaire (ECM) / SVF-gel. L’huile sur la couche supérieure est recueillie. Environ 5 mL d’huile est ajouté à 15 mL de graisse à haute densité et émulsionnée en décalant intersyringe, à raison de 20 mL/s pour 6 x à 8 x. La graisse émulsionnée est centrifugée à 2 000 x g pendant 3 min, et la substance collante est aussi ECM/SVF-gel. Après la greffe de l’ECM/SVF-gel sur des souris Nudes, le greffon est récolté et évalué par l’examen histologique. Le résultat montre que ce produit a le potentiel pour se régénérer dans le tissu adipeux normal. Cette procédure est une procédure de dissociation mécanique simple et efficace de condenser les cellules SVF incorporés dans leur ECM soutien naturel à des fins de récupération.

Introduction

Cellules souches offrent un changement de paradigme pour la régénération et la réparation des tissus, afin qu’ils puissent offrir un autre schéma thérapeutique pour diverses maladies¹. Les cellules souches (par exemple, les cellules souches pluripotentes induites et les cellules souches embryonnaires) ont un grand potentiel thérapeutique, mais sont limités en raison de la régulation cellulaire et des considérations éthiques. Dérivé d’adipeux mésenchymateuses stromales/cellules souches (ASCs) sont faciles à obtenir de lipoaspirates et pas soumis aux mêmes restrictions ; ainsi, il est devenu un type de cellule idéal pour la pratique de la médecine régénérative,². En outre, ils sont nonimmunogenic et disposent de ressources abondantes de graisse autologue³.

Actuellement, CRA est obtenus principalement par digestion de collagénase médiée par du tissu adipeux. La fraction stroma vasculaire (SVF) du tissu adipeux contient NASC, cellules endothéliales, péricytes et cellules immunitaires. Bien que l’obtention d’une haute densité de SVF/CRA enzymatiquement s’est avéré avoir des effets bénéfiques, la législation de plusieurs pays réglemente strictement l’application clinique des produits à base de cellules à l’aide de collagénase⁴. Digérer le tissu adipeux avec la collagénase pendant 30 min à 1 h pour obtenir les cellules SVF augmente le risque de ces deux matières exogènes dans la préparation et la contamination biologique. La culture adhérente et la purification des CRA, qui prend les jours de semaines, exigent l’équipement de laboratoire spécifiques. En outre, dans la plupart des études, des cellules SVF et CRA est utilisés en suspension. Sans la protection de la matrice extracellulaire (mec) ou un autre transporteur, cellules libres sont vulnérables, provoquer une rétention d’une pauvre cellule après l’injection et compromettre le résultat thérapeutique⁵. Toutes ces raisons limitent l’autre demande de thérapie de cellules souches.

Pour obtenir des CRA du tissu adipeux sans digestion induite par la collagénase, plusieurs procédures de traitement mécanique, y compris de centrifugation, mécanique, hacher, broyer, réduire en purée et hacher, ont été développés^{6,7 , 8 , 9}. ces méthodes sont censés se condensent les tissus et CRA en perturbant mécaniquement les adipocytes matures et leurs vésicules contenant de l’huile. En outre, ces préparations, contenant des concentrations élevées des CRA, a montré un potentiel thérapeutique considérable comme médecine régénérative des animaux modèles^8,9,10.

En 2013, Tonnard et coll. a présenté le nanofat technique, qui consiste à produire lipoaspirates émulsifiée par intersyringe traitement de¹¹de greffage. La force de cisaillement créée par intersyringe déplacement peut briser sélectivement les adipocytes matures. Se fondant sur leurs constatations, nous avons développé une méthode de traitement purement mécanique qui élimine la plupart des lipides et fluide dans les lipoaspirates, laissant seulement les cellules SVF et fractionné ECM, qui est ECM/SVF-gel¹². Ici, les auteurs décrivent les détails du processus mécanique d’origine humaine de tissus adipeux pour produire l’ECM/SVF-gel.

Protocole

Cette recherche a été approuvée par la Commission d’examen éthique dans l’hôpital Nanfang, Guangzhou, Chine. Le tissu adipeux a été prélevé de donneurs sains qui a donné consentement éclairé pour participer à l’étude. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de Nanfang hôpital Institutional Animal Care et effectuées conformément aux lignes directrices de la National Health and Medical Research Council (Chine).

1. ECM/SVF-gel de préparation

1. Graisse de récolte.
   1. Effectuer la liposuccion sur un être humain avec une canule de 3 mm multiport, qui contient plusieurs trous côté pointu de 1 mm de diamètre, à -0,75 atm de pression d’aspiration.
   2. Recueillir 200 mL de lipoaspirates dans un sachet stérile.
2. Préparer la graisse Coleman.
   1. Transférer le lipoaspirates dans quatre tubes de 50 mL et laisser la graisse récoltée reposer encore pendant 10 min.
   2. Recueillir la graisse sur la couche supérieure dans deux tubes de 50 mL à l’aide d’une pipette à embout large pour transférer et jeter la partie liquide à la couche inférieure.
   3. Utilisant des tubes de 50 mL, centrifuger la couche de graisse à 1 200 g à la température ambiante (RT) pendant 3 min.
   4. Définir la couche supérieure (environ 80 mL) sous forme de graisse de Coleman.
   5. Transférer les 2/3 supérieurs de la graisse de Coleman dans un tube de 20 mL à l’aide d’une pipette à embout large et définir cette partie sous forme de graisse faible densitée.
   6. Transférer 1/3 inférieur de la graisse de Coleman dans un autre tube de 20 mL à l’aide d’une pipette à embout large et définir cette partie sous forme de graisse haute densitée.
3. Produire des ECM/SVF-gel provenant des lipides de basse densité.
   1. À l’aide de deux seringues de 20 mL, reliés par un connecteur Luer-Lock de femelle-femelle (d’un diamètre interne de 2,4 mm) pour intershift 20 mL de graisse faible densitée.
   2. Maintenir la stabilité de la vitesse de déplacement (à 20 mL/s) et répéter pour 6 x à 8 x.
   3. Centrifuger le mélange à 2 000 x g RT pendant 3 min.
   4. Recueillir la portion de l’huile sur le dessus dans un tube de 10 mL à l’aide d’une pipette de l’échelle-pointe à ta pour une utilisation ultérieure.
   5. Recueillir la substance collante dans la couche intermédiaire, qui est ECM/SVF-gel (Figure 1A), à l’aide d’une pipette à embout large et jetez le liquide à la couche inférieure.
4. Produire des ECM/SVF-gel provenant des lipides de haute densité.
   1. Ajouter 5 mL d’huile (recueillie à l’étape 1.3.4) à 15 mL de graisse à haute densité.
   2. Intershift la graisse mixte entre seringues 6 x à 8 x jusqu'à ce qu’un floculent est observée au sein de l’émulsion.
   3. Centrifuger le mélange à 2 000 x g RT pendant 3 min.
   4. Jeter la partie de l’huile sur le dessus.
   5. Recueillir la substance collante dans la couche intermédiaire (ECM/SVF-gel) à l’aide d’une pipette à embout large et jeter le liquide à la couche inférieure.
   6. Mélanger l’ECM/SVF-gel des étapes 1.3.5 et 1.4.5.

2. modèle ECM/SVF-gel greffe souris nue

1. Anesthésier les souris Nudes (8 semaines femme) à l’isoflurane (1 % - 3 %) anesthésie par inhalation dans une salle d’exploitation animale.
2. Transférer l’ECM/SVF-gel dans une seringue de 1 mL.
3. Connecter la seringue de 1 mL avec une canule infiltration émoussé.
4. Insérer la canule sous la peau à chaque flanc de la souris.
5. Injecter 0,3 mL de l’ECM/SVF-gel.

3. tissu récolte sur 3, 15 et 90 jours après l’Injection de l’ECM/SVF-gel

1. Anesthésier les souris à l’isoflurane (1 % - 3 %) anesthésie par inhalation.
2. Sacrifier les souris par la méthode de dislocation cervicale.
3. Faites une incision à la ligne médiane de la peau du dos de la souris avec des ciseaux chirurgicaux.
4. Disséquer et récolter les greffes de graisse sur les deux côtés de la souris. Incorporer les greffes de graisse à la paraformaldéhyde à 4 % à la droite du jour au lendemain.
5. Déshydrater le tissu dans l’augmentation des concentrations d’éthanol : éthanol à 70 %, deux changements, 1 h chacun ; l’éthanol à 80 %, un changement, 1 h ; l’éthanol à 95 %, un changement, 1 h ; 100 % éthanol, trois changements, 1,5 h de chacun ; xylène, trois changements, 1,5 h chacune.
6. Infiltrer le tissu avec de la cire de paraffine (58-60 ° C), deux changements, 2 h chaque.
7. Incorporez le tissu dans des blocs de paraffine. Coupes sur une épaisseur d’environ 4 µm et placez-les sur des diapositives.

4. l’hématoxyline et éosine coloration

1. Déparaffiner les diapositives de bloc de paraffine en les trempant dans du xylène, I, II et III (10 min chacun).
2. Réhydrater les coupes de tissus en les passant à travers la baisse des concentrations (100 %, 100 %, 95 %, 80 %, 70 %) des bains d’éthanol pendant 3 min chaque.
3. Rincer les sections de tissu dans l’eau distillée (5 min).
4. Tacher les coupes de tissus à l’hématoxyline pendant 5 min.
5. Rincer les coupes de tissus dans la gestion de l’eau du robinet pendant 20 min. Decolorize à 1 % d’alcool acide (1 % HCl dans l’alcool à 70 %) pour 5 s. rinçage à l’eau courante jusqu'à ce que les sections sont à nouveau en bleues.
6. Ajouter deux ou trois gouttes d’éosine Y colorant directement sur les diapositives de la pipette et laissez le colorant durant 10 min.
7. Laver les lames dans l’eau du robinet pendant 1 à 5 min.
8. Déshydrater les diapositives de l’augmentation des concentrations (70 %, 80 %, 95 %, 100 %, 100 %) d’éthanol pendant 3 min chaque.
9. Désactivez les diapositives dans le xylène I et II de 5 min chacun.
10. Monter des diapositives dans le support de montage.

5. immunofluorescence

1. Déparaffiner les coupes de tissus dans le xylène I, II et III (5 min).
2. Réhydrater les coupes de tissus en les passant à travers différentes concentrations (100 %, 100 %, 95 %, 95 %, 70 %) des bains d’alcool pendant 3 min chaque.
3. Incuber les sections dans une solution de₂ % de 3 H₂O dans le méthanol à RT pendant 10 min.
4. Rincer les lames 2 x avec de l’eau distillée, 5 min chacun.
5. Supprimer les diapositives dans un panier de diapositive. Ajouter 300 mL de tampon citrate de 10 mM (pH 6.0) et incuber les lames à 95-100 ° C pendant 10 min.
6. Cool les diapositives de RT pendant 20 min.
7. Rincer les lames 2 x avec saline tamponnée au phosphate (PBS), 5 min chacun.
8. Ajouter 100 µL de sérum de veau fœtal de 10 % sur les diapositives et les incuber dans une chambre humidifiée à RT pendant 1 h.
9. Incuber les sections avec la solution d’anticorps primaire (cobaye anti-souris Perilipin, 1 : 400) à 4 ° C jusqu’au lendemain.
10. Rincer les lames avec du PBS 3 x, 5 min chaque.
11. Incuber les sections avec la solution d’anticorps secondaire (IgG de chèvre anti-Guinée pig-488) pendant 2 h à température ambiante.
12. Rincer les lames avec du PBS 3 x, 5 min chaque.
13. Essuyez l’eau autour de la section avec le mouchoir en papier propre.
14. Déposez 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et conjugué Alexa Fluor 488 isolectine dans le cercle pour couvrir la section sur la diapositive.
15. Monter les lamelles et les laisser sécher dans l’obscurité.
16. Observer les diapositives avec un microscope à fluorescence.

Résultats

Après le traitement de la graisse de Coleman à ECM/SVF-gel, le volume d’huile mis au rebut reprend 80 % du volume final, et seulement 20 % du tissu adipeux, conservé sous la couche d’huile est considérée comme ECM/SVF-gel (Figure 1A). ECM/SVF-gel a une texture liquide lisse qui lui permet de passer par une fine aiguille 27 G ; Cependant, graisse de Coleman se compose d’une structure adipeuse intégrale avec des fibres de gros et n...

Discussion

Sur les cellules souches de thérapie régénérative a montré un grand bénéfice potentiel dans différentes maladies. CRA est les candidats thérapeutiques exceptionnels parce qu’ils sont faciles à obtenir et ont la capacité de réparation tissulaire et la régénération des tissus nouveaux¹⁵. Cependant, il y a des limites à l’élargissement de son application clinique, car cela nécessite des procédures complexes d’isoler les cellules et collagénase de traitement^...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus