재생 치료를 위한 Lipoaspirates의 기계 Micronization

요약

여기, 우리는 일련의 유화 및 여러 centrifugations를 포함 하는 기계적인 프로세스를 통해 지방 조직에서 stromal 혈관 분수를 얻기 위해 프로토콜 제시.

초록

Stromal 혈관 분수 (SVF); 다양 한 질병에 대 한 재생 도구가 되고있다 그러나, 입법 콜라를 사용 하 여 셀 제품의 임상 적용을 엄격 하 게 통제 한다. 여기, 우리는 순전히 기계적 과정에 의해 지방 조직에서 SVF 셀 및 기본 세포 외 매트릭스의 주사 혼합물을 생성 하는 프로토콜을 제시. Lipoaspirates는 원심 분리기에 투입 되며 1200 x g 3 분에 합니다. 중간 계층은 수집 하 고 (고밀도 하단) 지방과 저밀도 지방 상단에 2 개의 층으로 분리. 상위 계층은 직접 intersyringe를 이동 하 여, 8 x 6 x 20 mL/s의 속도로 유화 됩니다. 유화 지방 2000 x g 3 분,에서 centrifuged 그리고 기름 층 아래 끈적끈적한 물질을 수집 하 고는 세포 외 기질 (ECM)으로 정의 / SVF 젤. 꼭대기 층에 오일 수집 됩니다. 오일의 약 5 mL는 고밀도 지방 15 mL에 추가 하 고 intersyringe를 이동 하 여, 8 x 6 x 20 mL/s의 속도로 유화. 유화 지방 2000 x g 3 분에 centrifuged 그리고 끈적끈적한 물질은 또한 ECM/SVF-젤. 누드 마우스에 ECM/SVF-젤의 이식 후에 이식 수확 이며 더 시험에 의해 평가. 결과이 제품에는 정상적인 지방 조직으로 재생성을 보여줍니다. 이 절차는 간단 하 고 효과적인 기계적 분리 절차 SVF 세포 재생 목적을 위해 그들의 자연적인 지원 ECM에 포함 된 응축입니다.

서문

그들은 다양 한 질병¹에 대 한 대체 치료 처방을 제공할 수 있도록 줄기 세포 치료 조직 수리 및 재생에 대 한 패러다임의 변화를 제공 합니다. 줄기 세포 (예를 들면, 유도 만능 줄기 세포와 배아 줄기 세포) 큰 치료 잠재력을가지고 하지만 셀 레 귤 레이 션 및 윤리적인 고려 사항으로 인해 제한 됩니다. 지방 유래 중간 엽 기질/줄기 세포 (ASCs)는 쉽게 lipoaspirates에서와 같은 제한; 적용 되지 않습니다 얻을 따라서, 그것은 실용적인 재생 의학²에 대 한 이상적인 셀 유형이 되고있다. 또한, 그들은 nonimmunogenic 이며 헌 지방³에서 풍부한 자원을.

현재, ASCs 주로 지방이 많은 직물의 콜라 중재 소화에 의해 얻을 수 있습니다. 지방이 많은 직물의 실질 혈관 분수 (SVF) ASCs, 내 피 뿌리 세포, pericytes, 및 면역 세포에 포함 되어 있습니다. 효소 고밀도 SVF/ASCs를 얻는 유익한 효과를 표시 했다, 비록 여러 국가에서 입법은 엄격 하 게 콜라⁴를 사용 하 여 셀 기반 제품의 임상 적용을 규제 합니다. SVF 세포를 얻기 위해 1 시간 30 분 콜라와 함께 지방 조직 소화 준비와 생물 학적 오염 두 외 인 물질의 위험을 증가. 부착 문화와 일 주 소요, ASCs, 정화 특정 실험실 장비가 필요 합니다. 또한, 대부분의 연구에서 SVF 전지와 ASCs 서 스 펜 션에 사용 됩니다. 세포 외 기질 (ECM) 또는 다른 항공사의 보호 없이 프리셀은 취약 하 고 주입 후 가난한 셀 유지가 발생할 손상 치료 결과⁵. 이러한 이유로 모두 줄기 세포 치료의 추가 응용 프로그램을 제한합니다.

콜라-중재 소화 하지 않고 지방 조직에서 ASCs를, 원심 분리, 자르고, 분쇄, pureeing, 고 닦지, 기계 등 여러 기계적 처리 절차, 개발된^6,7 되었습니다. ^{, 8 , 9}. 이러한 방법은 기계적으로 성숙한 adipocytes 및 그들의 석유를 포함 하는 소포를 방해 하 여 조직과 ASCs를 응축 하 생각 된다. 또한, ASCs의 높은 농도 포함 하는 이러한 준비 동물에서 재생 의학 모델^8,,910로 상당한 치료 잠재력을 보여주었다.

2013 년에 Tonnard 외. 유화 lipoaspirates intersyringe¹¹처리 하 여 생산 관련 기술을 접목 하는 nanofat를 소개 했다. 이동 하는 intersyringe에 의해 만들어진 전단 힘 선택적으로 성숙한 adipocytes를 끊을 수 있다. 우리 SVF 세포와 ECM/SVF-젤¹²분류 한 ECM 떠나 lipoaspirates에서 대부분의 지질 및 액체를 제거 하는 순전히 기계적 처리 방법 개발 그들의 결과에 따라. 여기, 우리 인간 파생 된 지방 조직 ECM/SVF-젤 생산의 기계적 프로세스의 세부 사항을 설명 합니다.

프로토콜

이 연구 윤리 검토 보드 Nanfang 병원, 광저우, 중국에에서 의해 승인 되었다. 지방 조직 건강 한 기증자 했다 서 면 통지 해준 동의 연구에 참여 하에서 수집 되었다. 모든 동물 실험 Nanfang 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하 고 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (중국)의 지침에 따라 수행 했다.

1. ECM/SVF-젤 준비

1. 베스트 지방입니다.
   1. 정 맥과 3 mm 멀티 포트-0.75에 직경에서 1 m m의 여러 날카로운 측면 구멍을 포함 하는 인간에서 지방 흡입을 수행 흡입 압력의 atm.
   2. 멸 균 가방에 lipoaspirates의 200 mL를 수집 합니다.
2. 콜맨 지방 준비.
   1. 4 50 mL 튜브에는 lipoaspirates를 전송 하 고 여전히 10 분 동안 서 서가 걷이 지방 수 있도록.
   2. 전송, 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 두 50 mL 튜브에 꼭대기 층에 지방을 수집 하 고 하단 계층에서 액체 부분 삭제.
   3. 사용 하 여 50 mL 튜브, centrifugate 뚱뚱한 층 1200 x g 실 온 (RT)에서 3 분.
   4. 콜맨 지방으로 상위 레이어 (약 80 mL)를 정의 합니다.
   5. 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 20 mL 튜브에 콜맨 지방의 상단 2/3를 전송 하 고 저밀도 지방으로이 부분을 정의 합니다.
   6. 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 다른 20 mL 튜브에 콜맨 지방의 더 낮은 1/3를 전송 하 고 고밀도 지방으로이 부분을 정의 합니다.
3. 저밀도 지방에서 ECM/SVF-젤을 생성 합니다.
   1. 저밀도 지방 20 mL intershift에 여성에 게 여성 Luer 잠금 커넥터 (2.4 m m의 내부 직경)에 의해 연결 된 2 개의 20 mL 주사기를 사용 하 여.
   2. (20 mL/s)에서 안정적인 변화 속도 유지 하 고 8 x 6 x 반복.
   3. Centrifugate 2000 x g RT에서 3 분 대에서 혼합물.
   4. 추가 사용에 대 한 실시간에 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 10 mL 튜브에서 위에 기름 부분을 수집 합니다.
   5. ECM/SVF-젤 (그림 1A), 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여, 중간 계층에서 끈적끈적한 물질을 수집 하 고 아래 계층에 액체를 폐기.
4. 고밀도 지방에서 ECM/SVF-젤을 생성 합니다.
   1. 고밀도 지방 15 ml (단계 1.3.4에서에서 수집) 오일의 5 mL를 추가 합니다.
   2. 주사기 6 사이 혼합된 지방 intershift x 8 x는 있어 유제 내에서 관찰 될 때까지.
   3. Centrifugate 2000 x g RT에서 3 분 대에서 혼합물.
   4. 위에 기름 부분을 삭제 합니다.
   5. 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 중간 계층 (ECM/SVF-젤)에 끈적끈적한 물질을 수집 하 고 아래 계층에 액체를 폐기.
   6. 1.3.5-1.4.5 단계에서 ECM/SVF 젤을 믹스.

2. 누드 마우스 ECM/SVF-젤 이식 모델

1. 누드 마우스 anesthetize (8 주 오래 된, 여성)와 isoflurane (1%-3%) 흡입 마 취는 동물 작업 룸입니다.
2. 전송 ECM/SVF-젤 1 mL 주사기.
3. 무딘 침투 정으로 1 mL 주사기를 연결 합니다.
4. 마우스의 각 측면에 피하는 캐 뉼 러를 삽입 합니다.
5. ECM/SVF-젤의 0.3 mL를 주사.

3. 조직 ECM/SVF-젤 주입 후 3, 15, 및 90 일에 수확

1. Anesthetize isoflurane (1%-3%)와 쥐 흡입 마 취입니다.
2. 자 궁 경부 전위 방법으로 쥐를 희생.
3. 수술가 위로 중간 마우스의 등 쪽 피부에 절 개를 확인 합니다.
4. 부 고는 마우스의 양쪽에 지방 이식 수확. 밤새 RT에서 4 %paraformaldehyde 지방 이식 포함 합니다.
5. 에탄올의 농도 증가에 직물을 탈수: 70% 에탄올, 변화 2, 1 시간 각각; 80% 에탄올, 하나의 변경, 1 h; 95% 에탄올, 하나의 변경, 1 h; 100% 에탄올, 3 변화, 1.5 h 각; 크 실 렌, 3 변화, 1.5 h
6. 파라핀 왁 스 (58-60 ° C), 변화, 2 h 2로 조직 침투
7. 파라핀 블록으로 조직을 포함 합니다. 약 4 µ m의 두께에서 섹션을 잘라내어 슬라이드에 넣어.

4. hematoxylin와 오신 얼룩

1. I, II, 및 III (각 10 분) 크 실 렌에서 그들을 몸을 담글 하 여 파라핀 블록 슬라이드를 deparaffinize.
2. 감소 하는 농도 (100%, 100%, 95%, 80%, 70%)을 통해 전달 하 여 조직 단면도 rehydrate 3 분의 에탄올 목욕.
3. 증류수 (5 분)에서 조직 섹션 린스.
4. 되며 5 분 동안에 직물 단면도 착 색.
5. 1% 산 알코올에 20 분 Decolorize의 수돗물을 실행 조직 섹션 린스 (1% 70% 알코올에 HCl) 5 미 린스 섹션은 다시 파란색까지 수돗물을 실행에 대 한.
6. 피 펫, 하 여 슬라이드에 직접 오신 Y 염료의 2 ~ 3 방울을 추가 하 고 10 분 동안 설정 하는 염료.
7. 슬라이드 1-5 분 동안 수돗물에 씻어.
8. 증가 농도 (70%, 80%, 95%, 100%, 100%)에서 슬라이드를 탈수 3 분의 에탄올의
9. 5 분 동안 크 실 렌에서 슬라이드 I 및 II를 선택을 취소 합니다.
10. 설치 미디어에서 슬라이드 탑재 합니다.

5. immunofluorescent 얼룩

1. Deparaffinize 크 실 렌의 조직 단면도 I, II, 및 III (각 5 분).
2. 다양 한 농도 (100%, 100%, 95%, 95%, 70%)을 통해 전달 하 여 조직 단면도 rehydrate 3 분에 대 한 알코올 목욕.
3. 10 분에 대 한 실시간에 메탄올에 3% H₂O₂ 솔루션에서 섹션을 품 어.
4. 슬라이드 2 린스 증류수, 5 분 x.
5. 슬라이드 슬라이드 바구니에 드롭. 10 m m 구 연산 염 버퍼 (pH 6.0)의 300 mL를 추가 하 고 10 분 동안 95-100 ° C에서 슬라이드를 품 어.
6. 멋진 20 분에 대 한 실시간에 슬라이드.
7. 슬라이드 2 린스 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 5 분 x.
8. 슬라이드에 10% 태아 둔감 한 혈 청의 100 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 실시간에 습도 챔버에 품 어.
9. 4 ° C에서 1 차적인 항 체 용액 (기니 피그 반대로 마우스 Perilipin, 1:400)와 섹션을 밤새 품 어.
10. PBS 3 가진 슬라이드 린스 x, 5 분.
11. 이차 항 체 솔루션 섹션을 품 어 (염소 항 기니 돼지-488 IgG) 실시간에서 2 h
12. PBS 3 가진 슬라이드 린스 x, 5 분.
13. 깨끗 한 티슈로 섹션 주위 물 닦으.
14. 슬라이드에 대 한 섹션을 충당 하기 위해 원에 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 isolectin를 드롭.
15. coverslips를 탑재 하 고 어둠 속에서 말리.
16. 형광 현미경 슬라이드를 관찰 합니다.

결과

ECM/SVF-젤 콜맨 지방을 처리 한 후 폐기 기름의 볼륨 최종 볼륨의 80%를 차지 하 고 지방 조직 기름 층 아래 보존의 20%만 ECM/SVF-젤 (그림 1A)로 간주 됩니다. ECM/SVF-젤은 27 G 정밀한 바늘;을 통해 갈 수 있도록 하는 부드러운 액체 같은 질감 그러나, 콜맨 지방 그리고 큰 섬유와 필수 지방 구조의 구성 18 G 정 (그림 1B<...

토론

줄기 세포 기반 재생 치료는 다른 질병에서 큰 잠재적인 혜택을 보이고 있다. ASCs는 뛰어난 치료 후보 조직 복구 및 소설 조직¹⁵의 재생 능력을가지고 하 쉽기 때문에. 그러나, 그것의 임상 응용 프로그램을 확장 하는 셀과 콜라⁶처리에 대 한 격리를 복잡 한 절차 때문에 한계가 있다. 따라서, 콜라의 사용 없이 줄기 세포를 얻기 위해 간단한 기술을 개발 하기 위?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus