Mechanische Mikronisierung von Lipoaspirate für Regenerative Therapie

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Stromazellen vaskulären Bruchteil aus Fettgewebe durch eine Reihe von mechanischen Verfahren erhalten die Emulgierung und mehrere Centrifugations enthalten.

Zusammenfassung

Stromale vaskulären Bruch (SVF) ist eine regenerative Werkzeug für verschiedene Krankheiten geworden; Allerdings regelt die Gesetzgebung streng die klinische Anwendung der Zelle Produkte mit Kollagenase. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine injizierbare Mischung aus SVF Zellen und native extrazelluläre Matrix aus Fettgewebe durch ein rein mechanisches Verfahren zu generieren. Lipoaspirate werden in einer Zentrifuge und bei 1.200 X g für 3 min gesponnen. Die mittlere Schicht ist gesammelt und getrennt in zwei Schichten (High-Density Fett unten) und Low-Density Fett auf der Oberseite. Die obere Schicht wird direkt durch das intersyringe verschieben, mit einer Rate von 20 mL/s für 6 X bis 8 X emulgiert. Das emulgierte Fett wird bei 2.000 X g für 3 min zentrifugiert, und die klebrige Substanz unter die Ölschicht gesammelt und definiert als die extrazelluläre Matrix (ECM) / SVF-Gel. Das Öl auf die oberste Schicht wird gesammelt. Ca. 5 mL Öl 15 mL von High-Density Fett hinzugefügt und emulgiert durch intersyringe verschieben, mit einer Rate von 20 mL/s für 6 X bis 8 X. Das emulgierte Fett wird bei 2.000 X g für 3 min zentrifugiert, und die klebrige Substanz ist auch ECM/SVF-Gel. Nach der Transplantation des ECM/SVF-Gels in nude Mäuse ist das Transplantat geerntet und von histologischen Untersuchung bewertet. Das Ergebnis zeigt, dass dieses Produkt das Potenzial hat, in normalen Fettgewebe zu regenerieren. Dieses Verfahren ist eine einfache, effektive mechanische Dissoziation Verfahren die SVF-Zellen eingebettet in ihre natürliche unterstützende ECM für regenerative Zwecke zu kondensieren.

Einleitung

Stammzelltherapien bieten einen Paradigmenwechsel für Gewebereparatur und Regeneration, so dass sie eine alternative therapeutische Regime für verschiedene Krankheiten¹anbieten können. Stammzellen (z.B., induzierte pluripotente Stammzellen und embryonale Stammzellen) haben ein großes therapeutisches Potenzial sind aber beschränkt durch Zellregulation und ethische Erwägungen. Adipose abgeleitet mesenchymaler Stromazellen/Stammzellen (ASC) sind leicht zu beschaffen von Lipoaspirate und nicht den gleichen Beschränkungen; so ist es eine ideale Zelltyp für praktische regenerative Medizin²geworden. Darüber hinaus sie sind nonimmunogenic und haben reichlich vorhandenen Ressourcen aus körpereigenem Fett³.

ASC sind derzeit vor allem durch Kollagenase-vermittelten Verdauung des Fettgewebes gewonnen. Die stromale vaskuläre Bruchteil (SVF) von Fettgewebe enthält ASCs, endothelial Progenitor Cell, Perizyten und Immunzellen. Zwar erhalten eine hohe Dichte an SVF/ASC enzymatisch gezeigt wurde, um positive Auswirkungen haben, regelt die Gesetzgebung in verschiedenen Ländern streng die klinische Anwendung der Zell-basierte Produkte, die mit Hilfe von Kollagenase⁴. Verdauen das Fettgewebe mit Kollagenase für 30 min bis 1 h, SVF Zellen zu erhalten, erhöht das Risiko für beide exogene Material bei der Vorbereitung und biologische Kontamination. Die anhaftende Kultur und die Reinigung des ASC, die Tage bis Wochen dauert, erfordern spezielle Laborgeräte. Darüber hinaus werden in den meisten Studien SVF Zellen und ASC in der Schwebe verwendet. Ohne den Schutz der extrazellulären Matrix (ECM) oder einen anderen Träger freie Zellen sind anfällig, verursachen eine schlechte Zelle Aufbewahrung nach der Injektion und gefährden das therapeutische Ergebnis⁵. All diese Gründe beschränken die weitere Anwendung der Stammzell-Therapie.

Um ASC aus Fettgewebe ohne Kollagenase-vermittelten Verdauung zu erhalten, wurden verschiedene mechanische Bearbeitung-Verfahren, einschließlich der Zentrifugation, mechanische, hacken, Zerkleinern, pürieren und Zerkleinern, entwickelten^{6,7 , 8 , 9}. diese Methoden werden gedacht, um Gewebe und ASC kondensieren von mechanisch stören Reifen Adipozyten und ihre Öl-haltige Vesikel. Darüber hinaus zeigten diese Zubereitungen, die hohe Konzentrationen von ASC, therapeutische Potenzial als regenerativer Medizin in Tier^8,9,10Modelle.

Im Jahr 2013 eingeführt Tonnard Et Al. der Nanofat Technik, die beinhaltet, Herstellung von emulgierten Lipoaspirate durch Intersyringe Verarbeitung¹¹Pfropfen. Erstellt von Intersyringe, die Verlagerung Querkräfte kann selektiv Reifen Adipozyten brechen. Auf der Grundlage ihrer Erkenntnisse entwickelten wir eine rein mechanische Bearbeitung-Methode, die entfernt die meisten Lipid und Flüssigkeit in den Lipoaspirate verlassen nur SVF Zellen und fraktionierte ECM, die ECM/SVF-Gel¹²ist. Hier beschreiben wir die Details des mechanischen Prozesses der menschlichen abgeleitet Fettgewebe, das ECM/SVF-Gel zu produzieren.

Protokoll

Diese Forschung wurde von der ethischen Review Board im Nanfang Krankenhaus, Guangzhou, China genehmigt. Fettgewebe wurde gesammelt, von gesunden Spendern, gab schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der Studie. Alle Tierversuche wurden durch die Nanfang Krankenhaus institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt und durchgeführt nach den Richtlinien des National Health and Medical Research Council (China).

1. ECM/SVF-Gel-Vorbereitung

1. Ernten Sie Fett.
   1. Führen Sie Fettabsaugung auf einen Menschen mit einer 3 mm multiport-Kanüle, enthält mehrere scharfen seitlichen Löcher von 1 mm im Durchmesser, am-0.75 atm der Saugdruck.
   2. 200 mL Lipoaspirate in einem sterilen Beutel zu sammeln.
2. Bereiten Sie Coleman Fett.
   1. Die Lipoaspirate in vier 50 mL Röhrchen und die geerntete Fett für 10 min stillzustehen.
   2. Sammeln Sie das Fett auf die oberste Schicht in zwei 50 mL Röhrchen mithilfe einer Wide-Tip-Pipette übertragen, und entsorgen Sie den flüssigen Teil auf der unteren Ebene.
   3. Mit 50 mL Röhrchen, entmischen der Fettschicht am 1.200 X g bei Raumtemperatur (RT) für 3 min.
   4. Definieren Sie die obere Schicht (ca. 80 mL) als Coleman Fett.
   5. Übertragen Sie die oberen 2/3 des Fettes Coleman auf eine 20 mL-Tube mithilfe einer Pipette Wide-Tip, und definieren Sie diesen Teil als Low-Density Fett.
   6. Übertragen Sie der unteren 1/3 des Fettes Coleman, ein weiteres 20 mL-Tube mit Hilfe einer Pipette Wide-Tip und definieren Sie diesen Teil als High-Density-Fett.
3. ECM/SVF-Gel von geringer Dichte Fett zu produzieren.
   1. Verwenden zwei 20 mL Spritzen, 20 mL von geringer Dichte Fett intershift durch eine Buchse auf Buchse Luer-Lock-Anschluss (mit einem Innendurchmesser von 2,4 mm) verbunden.
   2. Halten Sie die Schaltgeschwindigkeit stabil zu (bei 20 mL/s) und für 6 X bis 8 X wiederholen.
   3. Die Mischung bei 2.000 X g bei RT 3 min entmischen.
   4. Sammeln Sie den Öl-Anteil auf der Oberseite in ein 10 mL-Tube mithilfe einer Pipette Wide-Tip bei RT für die weitere Verwendung.
   5. Sammeln Sie die klebrige Substanz in der mittleren Schicht, die ECM/SVF-Gel (Abb. 1A), ist durch die Verwendung einer Wide-Tip-Pipette, und entsorgen Sie die Flüssigkeit auf der unteren Ebene.
4. ECM/SVF-Gel aus High-Density-Fett zu produzieren.
   1. 15 mL von High-Density Fett fügen Sie 5 mL Öl (gesammelt von Schritt 1.3.4 hinzu).
   2. Intershift gemischte Fett zwischen Spritzen 6 X bis 8 X bis ein Kraftstofffilter innerhalb der Emulsion beobachtet wird.
   3. Die Mischung bei 2.000 X g bei RT 3 min entmischen.
   4. Verwerfen Sie den Öl-Teil auf der Oberseite.
   5. Sammeln Sie die klebrige Substanz in der mittleren Schicht (ECM/SVF-Gel) mithilfe einer Pipette Wide-Tip und entsorgen Sie die Flüssigkeit auf der unteren Ebene.
   6. Mischen Sie das ECM/SVF-Gel von Schritten 1.3.5 und 1.4.5.

2. Akt Mausmodell ECM/SVF-Gel Graft

1. Die nackte Mäuse zu betäuben (8 Wochen alt, weiblich) mit Isofluran (1-3 %) Inhalation Anästhesie in ein Tier OP-Saal.
2. Übertragen Sie das ECM/SVF-Gel auf eine 1 mL Spritze.
3. Verbinden Sie 1 mL Spritze mit einer stumpfen Infiltration Kanüle.
4. Stecken Sie die Kanüle subkutan in jeder Flanke der Maus.
5. 0,3 mL des ECM/SVF-Gels zu injizieren.

(3) Gewebe Ernte auf 3, 15 und 90 Tage nach der ECM/SVF-Gel-Injektion

1. Die Mäuse mit Isofluran (1-3 %) zu betäuben Inhalation-Anästhesie.
2. Die Mäuse durch zervikale Dislokation Methode zu opfern.
3. Machen Sie einen Schnitt an der Mittellinie von der Maus Rückenhaut mit Chirurgische Scheren.
4. Sezieren Sie und ernten Sie die Fett Transplantate auf beiden Seiten der Maus. Betten Sie die Fett Transplantate in 4 % Paraformaldehyd bei RT über Nacht.
5. Austrocknen des Gewebes in steigenden Konzentrationen von Ethanol: 70 % Ethanol, zwei Änderungen, 1 h; 80 % Ethanol, eine Änderung, 1 h; 95 % Ethanol, eine Änderung, 1 h; 100 % Ethanol, drei Änderungen, 1,5 h; Xylol, drei Änderungen, 1,5 h.
6. Infiltrieren Sie das Gewebe mit Paraffinwachs (58-60 ° C), zwei Änderungen, 2 h.
7. Einbetten des Gewebes in Paraffin-Blöcke. Schneiden Abschnitte bei einer Dicke von ca. 4 µm und legte sie auf den Folien.

4. Hämatoxylin und Eosin Färbung

1. Deparaffinize Paraffin Block Folien durch Einweichen in Xylol, I, II und III (10 min).
2. Rehydrieren Sie die Gewebeschnitte, indem man sie durch abnehmende Konzentrationen (100 %, 100 %, 95 %, 80 %, 70 %) der Ethanol-Bäder für 3 min.
3. Spülen Sie die Gewebeschnitte in destilliertem Wasser (5 min).
4. Führen Sie die Gewebeschnitte in Hämatoxylin für 5 min zu Flecken.
5. Spülen Sie die Gewebeschnitte in fließendem Leitungswasser für 20 min. Decolorize in saurem Alkohol von 1 % (1 % HCl in 70 % Alkohol) für 5 S. Spülen unter fließendem Leitungswasser bis in den Abschnitten wieder blau angezeigt werden.
6. Fügen Sie zwei bis drei Tropfen Farbstoff Eosin Y direkt auf den Folien mit Pipette, und lassen Sie den Farbstoff für 10 min eingestellt.
7. Waschen Sie die Folien in Leitungswasser für 1-5 min.
8. Pausiert die Folien in steigenden Konzentrationen (70 %, 80 %, 95 %, 100 %, 100 %) von Ethanol für 3 min.
9. Deaktivieren Sie den Folien in Xylol I und II für 5 min.
10. Montieren Sie die Folien in der Montage von Medien.

5. immunofluorescent Färbung

1. Deparaffinize Sie die Gewebeschnitte in Xylol, I, II und III (5 min).
2. Rehydrieren Sie die Gewebeschnitte, indem man sie durch verschiedene Konzentrationen (100 %, 100 %, 95 %, 95 %, 70 %) der Alkohol-Bäder für 3 min.
3. Inkubieren Sie die Abschnitte in einer 3 % H₂O₂ Lösung in Methanol bei RT für 10 min.
4. Spülen Sie die Folien 2 X mit destilliertem Wasser, 5 min.
5. Legen Sie die Folien in einem Dia-Korb. 300 mL 10 mM Citrat-Puffer (pH 6.0) zugeben und die Folien bei 95-100 ° C für 10 min inkubieren.
6. Kühlen Sie die Folien in RT für 20 min.
7. Spülen Sie die Folien 2 X mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 5 min.
8. 100 µL der fötalen Rinderserum 10 % auf den Folien hinzufügen und in eine feuchte Kammer bei RT für 1 h inkubieren.
9. Über Nacht inkubieren Sie in den Abschnitten mit Primärantikörper Lösung (Meerschweinchen Anti-Maus Perilipin, 1: 400) bei 4 ° C.
10. Spülen Sie die Folien mit PBS 3 X, 5 min.
11. Inkubieren Sie die Abschnitte mit Sekundärantikörper Lösung (Ziege Anti-Guinea Pig-488-IgG) für 2 h bei RT
12. Spülen Sie die Folien mit PBS 3 X, 5 min.
13. Das Wasser rund um den Bereich mit sauberen Papiertuch abwischen.
14. Drop-4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und Alexa Fluor 488 konjugiert Isolectin in den Kreis den Abschnitt auf der Folie abdecken.
15. Montieren Sie die Deckgläsern und im Dunkeln trocknen lassen.
16. Beobachten Sie die Folien mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.

Ergebnisse

Nach der Verarbeitung der Coleman Fett zu ECM/SVF-Gel, das Volumen der ausrangierten Öl nimmt 80 % des letzten Bandes, und nur 20 % des Fettgewebes unter die Ölschicht erhalten gilt als ECM/SVF-Gel (Abb. 1A). ECM/SVF-Gel hat eine glatte Flüssigkeit-wie Struktur, die es ermöglicht, durch eine feine Nadel 27 G gehen; jedoch Coleman Fett besteht aus einer integralen adipösen Aufbau mit großen Fasern und kann nur durch eine 18 G-Kanüle (

Diskussion

Stammzellbasierte regenerative Therapie hat einen großen potenziellen Nutzen bei verschiedenen Krankheiten gezeigt. ASC sind hervorragende therapeutische Kandidaten, denn sie einfach sind zu erhalten und haben die Kapazität für die Reparatur von Gewebe und die Regeneration der neuartige Gewebe¹⁵. Allerdings gibt es Einschränkungen für den Ausbau ihrer klinischen Anwendung, da es komplizierte Verfahren zum Isolieren von Zellen und Kollagenase erfordert für die Verarbeitung von

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus