ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לפקח על הישרדות על בסיס תא בודד ולזהות משתנים באופן משמעותי לחזות מוות של תאים.

Abstract

מבחני סטנדרט cytotoxicity, אשר דורשים את האוסף של lysates או תאים קבוע בנקודות זמן מרובים, מוגבלת הרגישות ויכולת להעריך גורמים המשפיעים על גורל עצביים. מבחני אלה דורשים התצפית של אוכלוסיות נפרדות של תאים בנקודות זמן בדידים. כתוצאה מכך, תאים בודדים לא יכול להיות במעקב פרוספקטיבי לאורך זמן, מגבילה מאוד את היכולת להבחין בין אם אירועים subcellular, כגון היווצרות puncta או חלבון mislocalization, הם פתוגניים הנהגים של המחלה, תגובות homeostatic, . או תופעות רק צירוף מקרים... מיקרוסקופ האורך תא בודד מתגבר על מגבלות אלו, ומאפשר החוקר לקבוע הבדלים הישרדות בין אוכלוסיות וצייר סיבתי קשרי גומלין עם רגישות משופרת. מדריך וידאו זה מתאר עבודה נציג לניסויים מדידה תא בודד ההישרדות של החולדה הנוירונים קורטיקלית הראשית המבטאת סמן חלבון פלואורסצנטי. הצופה למד כיצד להשיג יעילות גבוהה transfections, לאסוף, לעבד תמונות המאפשר איתור פוטנציאליים של תאים בודדים, ולהשוות את ההישרדות היחסי של אוכלוסיות עצביים באמצעות ניתוח סיכונים ביחס קוקס.

Introduction

מוות של תאים חריגים מהווה גורם המניע במחלות רבות, כולל סרטן, הקשורים ניוון מוחיים של קו¹. מבחני רגישות ועמיד עבור מוות תאים חיוניים האפיון של הפרעות אלה, כמו גם הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות תוך הרחבה או צמצום הישרדות הסלולר. כיום יש עשרות טכניקות למדידת מוות של תאים, באופן ישיר או באמצעות פונדקאית סמני². לדוגמה, מוות של תאים יכולים להידרש באופן חזותי עם העזרה של המשתמשות באופן סלקטיבי כתם תאים מתים או חיים³צבעים חיוני, או על-ידי ניטור את המראה של פוספוליפידים מסוימים קרום פלזמה^4,5,6 . מדידות של רכיבים תאיים או הסלולר מטבוליטים שוחרר לתוך כלי התקשורת שנפרעו הסלולר יכול גם לשמש כאל שליחים לתא המוות^7,8. לחלופין, הכדאיות הסלולר ניתן לקרב את ערכיהן על-ידי הערכת פעילות חילוף החומרים^9,10. למרות ששיטות אלה מספקים אמצעי מהיר הערכת את הישרדות cell, הם לא בלי אזהרות. כל טכניקה מתבונן התרבות כאוכלוסייה אחת, טיוח זה בלתי. אפשרי להבחין בין תאים בודדים שלהם המחירים ייחודי של הישרדות. יתר על כן, מבחני מבוסס-אוכלוסייה כזו אינם יכולים למדוד גורמים שעשויים להיות חשוב עבור מוות של תאים, כולל מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה. במקרים רבים, מבחני אלה הן מוגבל לנקודות זמן בדידים, אינם מאפשרים את התצפית רציף של תאים לאורך זמן.

לעומת זאת, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך היא מתודולוגיה גמיש במיוחד ישירות ובאופן רצוף מפקח על הסיכון למוות תא בודד בסיס¹¹. בקצרה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך מאפשר אלפי תאים בודדים כדי לאתר במרווחי זמן קבועים לתקופות ממושכות של זמן, ומאפשר האישושים מדויק של מוות של תאים, את הגורמים לשפר או לדכא את מות תאים. בבסיסו, השיטה כוללת של תרביות תאים ארעי או התמרה חושית של תאים עם וקטורים קידוד חלבונים פלורסנט. להחזרי ייחודי אז נוסדה, המיקום של כל תא transfected ביחס ציון זה מאפשר למשתמש תמונה ולעקוב אחר תאים בודדים במשך שעות, ימים או שבועות. כאשר תמונות אלה מוצגים ברצף, מוות של תאים מסומן על ידי שינויים אופייניים פלורסצנטיות, מורפולוגיה, פיצול בגוף התא, המאפשר את ההקצאה של שעת המוות עבור כל תא. הקצב מחושב של מוות, נקבעים על-ידי הפונקציה הזארד, שניתן לאחר מכן באופן כמותי בהשוואה בין תנאי או הקשורים בחר מאפיינים הסלולר באמצעות univariate או רב משתנית קוקס מפגעים פרופורציונלי ניתוח¹². יחד, גישות אלה מאפשרים את האפליה מדויק ואובייקטיבי של שערי מוות תאי בקרב אוכלוסיות הסלולר, וזיהוי של משתנים באופן משמעותי לחזות מוות תאי ו/או הישרדות (איור 1).

אמנם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר הישרדות בכל סוג התא הפוסט-mitotic במגוון של תבניות ציפוי, פרוטוקול זה יתאר תנאים transfecting, הדמיה החולדה הנוירונים קורטיקלית תרבותי בצלחת 96-ובכן.

Protocol

כל העבודה בעלי חוליות אושרה על ידי הוועדה על שימוש ו טיפול חיות ב אוניברסיטת מישיגן (פרוטוקול # PRO00007096). ניסויים מתוכננים בקפידה כדי למזער את מספר החיות הקריב. בהריון הנשי פראי-סוג (WT), אוונס ארוך שאינו הטרנסגניים חולדות (Rattus norvegicus) שוכנות ביחידים צ'יימברס מצויד עם העשרה סביבתית, המטופלים על ידי היחידה עבור רפואה חיות מעבדה (אולם) ב אוניברסיטת מישיגן, ב בהתאם המדריך הנתמכות על-ידי NIH על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. כל העכברושים הוחזקו בשגרת דיור כמו זמן קצר ככל האפשר לפני המתת חסד, בקנה אחד עם ההמלצות של המנחים על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת מישיגן שיטות של המתת חסד על-ידי הנחיות מינים.

1. הכנה גשמי

1. לנתח נוירונים בקליפת המוח מיום מתחלקים שהגורים עכברוש ותרבות 19 – 20 עכברוש נוירונים בקליפת המוח ב- 0.5 x 10⁶ תאים למיליליטר על צלחות מצופה פולי-D-ליזין עבור 4 ימים במבחנה, כפי שתואר לעיל^{13,14, 15,16,17,18,19}.
2. להכין את פלסמיד-DNA של ריבית בהתאם לשלבים המפורטים על ידי בידוד של דנ א פלסמיד נטולת אנדוטוקסין קיט (ראה טבלה של חומרים). לכמת את תוצאות הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים.
3. ביום במבחנה 4 (DIV4), aliquot, לעקר ומסנן דגירה המדיה הבאים ב- 37 ° c: 6 מ ל מופחת סרום מדיה (RSM; למשל., OptiMEM), 25 מ ל עצביים הבזליים מדיה (NBM), 40 מ"ל NBKY (NBM + חומצה kynurenic 1 מ מ + 10 מ מ MgCl₂, יש להתאים ל- pH של 7. 4), 10 מ ל NBC (NBM + עצביים 1 x תא תרבות + 1 x תוספת-גלוטמין + 1 x עט דלקת).
   הערה: אמצעי אחסון המפורטים מספיקים לצלחת 96-ובכן אחד transfecting. עיין בטבלה של חומרים עבור ריאגנטים ספציפיים.

2. תקנים של החולדה הנוירונים בקליפת המוח

1. לשנות את סיפקה דוגמה תרביות תאים בגיליון (ראה 1 קובץ משלים) על-ידי התאמת סוג צלחת, צלחת מפה, מספר DNAs, ריכוז ה-DNA, ומספר של וולס (תיבות ירוק).
   הערה: ה-DNA הכולל סיכום כדי µg 0.2 לכל טוב, ללא קשר אם אחד (למשל., דנ א) או מרובות (לדוגמה, ה-DNA B ו- C) DNA מבנים נוספים כדי מכל קידוח.
2. עובד מהגיליון, לשלב את הכמות המתאימה של RSM ו- DNA בצינור אחד. לשלב את הכמות המתאימה של RSM, תרביות תאים ריאגנט (למשל, Lipofectamine) בצינור נפרדים.
3. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
4. לשלב תערובות RSM ריאגנט DNA ו תרביות תאים, דגירה-RT כעשרים דקות.
5. במהלך שלב הדגירה, להשתמש פיפטה רב-ערוצי, שקתות פלסטיק סטרילית לשטוף תאים x 2 עם µL 100 לכל טוב של NBM. שמורת התקשורת ממוזגים (ס מ) ולאחסן ב 37 º C. על כך ועל ביצוע השלבים, לטפל כדי למזער את כמות הזמן הנוירונים חשופים לאוויר.
6. מסיר את המדיה NBM והחלף µL 100 לכל טוב של NBKY.
7. לאחר 20 דקות עברו, להוסיף 50 µL של תערובת מגיב/ה-DNA תרביות תאים dropwise כל טוב.
8. דגירה תאים עם מתחמי מגיב/ה-DNA של תרביות תאים עבור 20 דקות ב 37 º C.
9. לשטוף 2 x עם NBKY והחלף µL 100 ס מ ו- µL 100 של NBC לכל טוב.
10. בהצלחה transfected תאים צריך להיות גלוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ בתוך 16-24 h של תרביות תאים. למדוד יעילות, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק תרביות של תאים לאחר דגירה לילה ב 37 º C.
    הערה: טכניקה זו תוצאות יעילות תרביות תאים הכולל של 5-10%.

3. הדמיה

1. מניחים את הצלחת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם שלב ממונע, ולהקים להחזרי (למשל, סימן על החלק התחתון של הצלחת) אשר יאפשרו למשתמש ליישר את הצלחת בכל פעם שזה הוא עם תמונה. לשמור תמונה של נאמנות זה לעיון.
2. נווט אל שדה עניין ורשום הקואורדינטות x-y יחסית אפוטרופסות.
3. מתמקדים transfected תאים המבטאים תווית פלורסנט.
4. לקחת תמונות פלורסנט הערוץ המתאים או ערוצים (למשל, חלבון פלואורסצנטי חלבון פלואורסצנטי אדום [RFP], ירוק [GFP], 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [דאפי]), באופן ידני או באופן אוטומטי. על ידי לקיחת מספר תמונות במרווחי זמן שווים באופן קבוע, מצרף של הבאר יכול להיות התאספו במהלך עיבוד תמונה (ראה שלב 4).
   הערה: המרווח תלויה במספר גורמים, כולל הגדלה, את המערכת האופטית של המיקרוסקופ, ואת גודל גלאי. באופן כללי, המרווח אופטי בין התמונות יהיה בין 90 עד 95 אחוז מגודלו של כל תמונה בנפרד, כדי לאפשר מידה קטן של התמונה חפיפה וכוללים יישור.
5. חזור על תהליך זה לעיתים קרובות ככל הנדרש, ושילוב כדי להחזרי המקורי בכל פעם. לצורך ניתוח הישרדות, הדמיה מתקיים כל 6 – 24 h, בהתאם לסוג התא ואת מטרת הניסוי.

4. עיבוד תמונה

הערה: בעקבות רכישת התמונה, סדרה של צעדים עיבוד נדרשים לפני ניתוח תמונות. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, תפרים, סידור בערימה ואת הרקע חיסור (איור 1). מטרת השלבים היא לייצר של אוסף תמונות, או סדרת הזמן, שבו תאים הם בבירור ניכר מהרקע שלהם וקלים למעקב על נקודות זמן מרובות. מאקרו פיג'י ייעודי (Image_Processing.ijm, ראו 2 קובץ משלים), מבצעת תפירה בסיסי, בערימה, ועל רקע חיסור. הסבר על כל שלב ואת הפרמטרים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע עיבוד תמונה מסופק במקטע דיון.

1. להתאים את הנתונים הגולמיים או מדריך קלט כדי להתאים את העיצוב באיור 2.
2. אם נקודות זמן אינם רציפים (קרי, T1, T2, T3), לשנות תיקיות אלה כך שיהיו. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי המאקרו Image_Processing אינה מוחצת במהלך סידור בערימה.
3. לחץ פעמיים על הסמל כדי לפתוח את התוכנית, ולאחר מכן לחץ וגרור את המאקרו Image_Processing הבר פיג'י פיג'י. פעולה זו תפתח את המאקרו בתוך פיג'י.
4. להתאים שורות 2-7 של המאקרו Image_Processing כדי לציין קלט הספריה המכילה תמונות, את ספריית הפלט הרצוי עבור תמונות התפר ומוערם, מספר timepoints הדמיה, מספר ערוצים פלורסנט ותבנית צלחת.
5. לקבוע את הסדר שבו נרכשו התמונות. כדי לבדוק את זה, לתפור ידנית מצרף תמונות בפיג'י על ידי תמרונים כדי תוספים הנפתחת | תפרים | רשת/אוסף סיכות. התאם את ההגדרות בתוך התפריטים הנפתחת סוג ואת הסדר עד תמונה תפור במדויק מופק.
6. התאם את המשתנים GRID_TYPE ו- STITCH_ORDER שורות 8 ו-9 של המאקרו Image_Processing כדי להתאים בחירות אלה.
7. ציין את מספר תמונות לכל טוב על-ידי התאמת קו 10 במאקרו Image_Processing .
   הערה: עבור 2 x 2 מצרף תמונות, הקו הזה יקרא DIM = 2.
8. אם נדרש רקע חיסור, התאמת קו 14 במאקרו Image_Processing bgsub ב = true.
9. הגדר את רדיוס הכדור מתגלגל על-ידי התאמת קו 15 במאקרו Image_Processing .
   הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, הגדר את הרדיוס לפחות בקוטר של הקידמה הגדולה ביותר בתמונה.
10. לחץ על הפעל כדי להפעיל את המאקרו Image_Processing . מרגע שהתחלנו, Image_Processing יתקדמו באופן אוטומטי באמצעות תפרים בערימה, רקע חיסור.

5. הניקוד מוות תאי

הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת מידע נוסף על הניקוד מוות של תאים ונתונים הצנזורה.

1. אתר את אוספי תמונות המופק באמצעות Image_Processing script. פתח את אלה בפיג'י.
2. לתייג כל תא בנפרד עם מספר לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט של הצבע כלי בתוך פיג'י. הקשה על t אחרי כל נקודה יוסיף את מזהה תא למנהל (אזור-של-ריבית) של רועי.
   הערה: ניתן לאבחן את מזהי בלחיצה על תוויות , הצג את כל תיבות הסימון במנהל ROI.
3. ההתקדמות timepoints כל אוסף תמונות, שיא timepoint, כאשר כל תא מת או צריך להיות צנזורה בקובץ ה- Survival_spreadsheet.csv (ראה קובץ משלים 3).
   1. כל תא תופסת שורה בודדת בגיליון האלקטרוני, היכן מזהה ייחודי (ID) עבור כל תא מורכב המתאים טוב שלה ואת מספר רועי בתוך הבאר. tp_death הוא נקודת הזמן האחרון שתא נצפית בחיים, בעוד time_death מייצג את הזמן הממשי של מוות תוך שעות. עבור כל תא, קלט נתונים אלה. זה חיוני כדי לשמור על מבנה זה לצורך ניתוח מאוחר יותר באמצעות הישרדות . R (ראה 4 קובץ משלים).
      הערה: הקריטריונים לקביעת מוות תאי מכריעים והם עשויים להשתנות בהתאם לסוג התא. שלושה קריטריונים עיקריים משמשים הזיהוי של נוירונים מתים^11,20 (איור 3): איבוד עוצמת קרינה פלואורסצנטית (למשל, תא עצב 1-69 h), עיגול של הגוף תאים (למשל, תא עצב 2 ב 188 h), האובדן של neurite שלמות או blebbing (למשל, תא עצב 2 ב 188 h).
4. לתעד את מצב הצנזור של התא בעמודה האחרונה.
   הערה: כאן, בשל הדרך המיוחדת לצנזר את מטופלת על ידי R, תאים מצונזרים שסומנו על-ידי 0, בעוד לא מצונזר תאים מסומנים ב- 1. שים לב כי כל התאים שחיים האחרון נקודת זמן צונזר, לכן מסומן כ- 0.

6. ביצוע קוקס פרופורציונלי ובטיחותיים ניתוח ותוצאות להמחיש

1. במידת הצורך, הורד סטודיו R ב- https://cran.r-project.org/mirrors.html.
2. לפתוח סטודיו R ולחץ פעמיים על הסמל של הישרדות . R סקריפט.
3. מקם את הסמן על קו 2 של הישרדות . R , ולחץ על הלחצן הפעל בחלון הראשי של סטודיו R כדי לטעון את ספריית הישרדות.
4. שינוי קו 5 של הישרדות . R סקריפט כדי להתאים את המיקום של קובץ ה- Survival_spreadsheet.csv. לחץ על הפעל כדי לטעון את נתוני הישרדות כמו dataframe.
5. להאיר את שורות 8 ו-9, לחץ על לחצן הפעל בחלון המסוף סטודיו R על מנת לבצע ניתוח סיכונים ביחס קוקס. תוצאות וסטטיסטיקות פלט מופיעים בחלון המסוף של סטודיו R.
6. הדגש שורות 12-16 של הישרדות . R וללחוץ על הכפתור הפעל כדי לייצר סיכון מצטבר של מוות מגרש, אשר תופיע בכרטיסיה ' חלקות ' בסטודיו R. ניתן לשמור את הקובץ על ידי לחיצה על הלחצן ' ייצוא ' שמעל העלילה.
7. אם זה רצוי להתוות את הנתונים הישרדות כמו עיקול קפלן-מאייר, הדגש שורות 19-24 של הישרדות . R וללחוץ על הכפתור הפעל .

תוצאות

DIV4 החולדה הנוירונים בקליפת המוח באמצעות ההליך תרביות תאים המתואר כאן, היו transfected עם פלסמיד קידוד מאפל את חלבון פלואורסצנטי. החל 24 שעות שלאחר תרביות תאים, התאים היו עם תמונה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כל 24 שעות למשך 10 ימים רצופים. הדימויים הנובעת היו מאורגנים כמצו...

Discussion

כאן מוצגת מתודולוגיה לעקוב ישירות אחר הישרדות העצבית על בסיס תא בודד. בניגוד מבחני מסורתי על מות תאים הנמצאים מוגבל זמן בדידים נקודות ועל אוכלוסיות שלמות של תאים, שיטה זו מאפשרת להערכה מתמשכת של מגוון גורמים כגון מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה, ו ניתן לקבוע כיצד כל גורם משפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12863
Magnesium chloride Hexahydrate	Sigma	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
Poly D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 supplement	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
96 well plates	TPP	0876