Suivi de la survie des neurones par l’intermédiaire de la microscopie en Fluorescence longitudinale

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à surveiller la survie sur une base unicellulaires et identifier les variables qui permettent de prédire significativement la mort cellulaire.

Résumé

Les analyses de cytotoxicité standard, qui nécessitent la collecte de lysats ou des cellules fixées à plusieurs moments, ont limité la sensibilité et la capacité d’évaluer les facteurs qui influencent le destin neuronale. Ces tests requièrent l’observation des populations distinctes de cellules à des moments distincts. Ainsi, des cellules individuelles ne peuvent pas être suivies prospectivement au fil du temps, limitant sévèrement la capacité de distinguer que des événements subcellulaires, comme examen formation ou niveau de protéine, sont pilotes pathogènes de la maladie, les réponses homéostatiques, ou des phénomènes purement fortuits. Unicellulaire microscopie longitudinale permet de surmonter ces limitations, ce qui permet au chercheur de déterminer les différences de survie entre les populations et dessiner des relations causales avec une sensibilité accrue. Ce guide vidéo exposera un flux de travail représentatif pour expériences mesurant unicellulaires survie des neurones du cortex primaire rat exprimant un marqueur de la protéine fluorescente. Le spectateur va apprendre à atteindre la haute efficacité transfections, de collecter et de traiter des images permettant le suivi prospectif des cellules individuelles et comparer la survie relative des populations de neurones en utilisant l’analyse de risques proportionnels de Cox.

Introduction

La mort des cellules anormales est un facteur déterminant dans de nombreuses maladies, y compris le cancer, neurodégénérescence et course¹. Les dosages robustes et sensibles pour la mort des cellules sont essentielles pour la caractérisation de ces troubles, ainsi que le développement de stratégies thérapeutiques pour étendre ou réduire la survie cellulaire. Il y a actuellement des dizaines de techniques pour mesurer la mort cellulaire, soit directement, soit par le biais de substitution des marqueurs². Par exemple, la mort cellulaire peut être évaluée visuellement à l’aide de colorants vitaux qui tachent sélectivement les cellules mortes ou vivantes,³, ou en surveillant l’apparition des phospholipides spécifiques sur la membrane plasmique^4,,^5,6 . Mesures des composants intracellulaires ou des métabolites cellulaires rejetés dans les médias à la dissolution cellulaire peuvent également servir de proxies pour cellule mort^7,8. Alternativement, la viabilité cellulaire peut être approchée en évaluant l’activité métabolique^9,10. Bien que ces méthodes fournissent des moyens rapides d’évaluation de la survie cellulaire, ils ne sont pas sans réserves. Chaque technique relève de la culture comme une seule population, rendant impossible de distinguer les cellules individuelles et leurs tarifs uniques de survie. En outre, ces tests sur la population sont incapables de mesurer les facteurs qui peuvent être importants pour la mort de cellules, y compris la morphologie cellulaire, expression de la protéine ou la localisation. Dans de nombreux cas, ces tests sont limitées aux points de temps discret et ne permettent pas l’observation continue des cellules au fil du temps.

En revanche, microscopie de fluorescence longitudinale est une méthodologie très flexible qui directement et en permanence surveille le risque de décès sur une seule cellule base¹¹. En bref, microscopie de fluorescence longitudinale permet à des milliers de cellules individuelles pour être suivis à intervalles réguliers pendant de longues périodes de temps, permettant à des déterminations précises de mort cellulaire et les facteurs qui favorisent ou suppriment la mort cellulaire. À sa base, la méthode implique la transfection transitoire ou la transduction des cellules avec des vecteurs codant des protéines fluorescentes. Un fiduciaire unique est alors établi, et la position de chaque cellules transfectées par rapport à ce point de repère permet à l’utilisateur de l’image et de suivre les cellules individuelles au cours des heures, jours ou semaines. Lorsque ces images sont affichés dans l’ordre, la mort cellulaire est marquée par des modifications caractéristiques en fluorescence, la morphologie et la fragmentation du corps cellulaire, permettant l’attribution d’un temps mort pour chaque cellule. Le taux calculé de la mort, déterminé par la fonction de risque, peut ensuite être quantitativement comparé entre les conditions, ou associé à sélectionner des caractéristiques cellulaires utilisant univariée ou multivariée Cox hasards proportionnels analyse¹². Ensemble, ces approches permettent la discrimination précise et objective du taux de mort cellulaire chez les populations cellulaires et l’identification des variables qui permettent de prédire significativement la mort cellulaire et/ou de survie (Figure 1).

Bien que cette méthode peut être utilisée pour surveiller la survie dans n’importe quel type de cellules post-mitotiques dans une variété de formats de placage, ce protocole décrira les conditions pour transfectants et l’imagerie des neurones corticaux rat cultivées dans une plaque à 96 puits.

Protocole

Tous les travaux d’animaux vertébré a été approuvé par le Comité sur l’utilisation et l’entretien des animaux à l’Université du Michigan (protocole # PRO00007096). Des expériences sont soigneusement planifiés afin de minimiser le nombre d’animaux sacrifiés. Enceinte femme sauvage (WT), rats Long Evans non transgéniques (Rattus norvegicus) sont logés séparément dans des chambres équipées avec enrichissement environnemental et pris en charge par l’unité de laboratoire Animal médecine (ULAM) à l’Université du Michigan, dans conformité avec le Guide de NIH-prise en charge pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Tous les rats ont été conservés dans la routine de logement pour moins de temps que possible avant l’euthanasie, conforme aux recommandations des lignes directrices sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association et l’Université du Michigan, méthodes d’euthanasie par Directives de l’espèce.

1. matérielle préparation

1. Disséquer les neurones corticaux d’embryonnaire jour que 19 – 20 ratons et culture rat des neurones corticaux à 0,5 x 10⁶ cellules par millilitre sur plaques revêtus de poly-D-lysine pour 4 jours in vitro, comme décrit plus haut^{13,14, 15,16,17,18,19}.
2. Préparer le plasmide d’ADN d’intérêt suivant les étapes décrites par un isolement d’ADN de plasmide exempte d’endotoxine nécessaire (voir la Table des matières). Quantifier l’ADN qui en résultent, à l’aide d’un spectrophotomètre.
3. In vitro jour 4 (DIV4), filtre aliquote, stériliser et incuber les supports suivants à 37 ° c : 6 mL réduit médias de sérum (RSM ; par exemple., OptiMEM), neuronale 25 mL de milieu de base (NBM), 40 mL NBKY (NBM + acide kynurénique 1 mM + 10 mM MgCl₂, ajustée à un pH de 7. (4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronale de cellules supplément culture + 1 x supplément de L-glutamine + 1 x Pen Strep).
   Remarque : Volumes indiqués sont suffisants pour la transfection une plaque à 96 puits. Se référer à la Table des matières des réactifs spécifiques.

2. la transfection des neurones corticaux de Rat

1. Modifier la fournis feuille de transfection d’exemple (voir 1 de fichier supplémentaire) en ajustant le type de plaque, la carte de la plaque, le nombre de DNAs, concentration d’ADN et le nombre de puits (cases vertes).
   Remarque : L’ADN total des sommes à 0,2 µg / puits, peu importe qu’on (par exemple,., A de l’ADN) ou multiples (par exemple, ADN B et C) constructions d’ADN sont ajoutées à chaque puits.
2. Travail de la feuille de calcul, combiner la quantité appropriée de RSM et ADN dans un tube. Mélanger la quantité appropriée de RSM et transfection réactif (par exemple, Lipofectamine) dans une éprouvette.
3. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min.
4. Mélanger l’ADN et transfection des préparations réactif RSM et incuber 20 min à RT.
5. Au cours de cette étape d’incubation, utiliser une pipette multicanaux et stérile en plastique creux pour laver les cellules 2 x 100 µL / puits de la Banque nationale. Réserver les milieux conditionnés (CM) et stocker à 37 ° C. Pour cela et en suivant les étapes, prendre soin de réduire la quantité de temps que les neurones sont exposés à l’air.
6. Retirez le support NBM et remplacer par 100 µL / puits de NBKY.
7. Après 20 minutes se sont écoulées, ajouter 50 µL du mélange réactif/ADN transfection goutte à chaque puits.
8. Incuber les cellules avec les complexes de réactif/ADN de transfection pendant 20 min à 37 ° C.
9. Rincer 2 x avec NBKY et remplacez par 100 µL de CM et 100 µL de NBC / puits.
10. Les cellules transfectées avec succès doivent être visibles en microscopie de fluorescence moins 16 – 24 h après transfection. Pour mesurer l’efficacité, utiliser un microscope à fluorescence pour vérifier la transfection après une nuit d’incubation à 37 ° C.
    Remarque : Cette technique se traduit par un rendement global de transfection de 5 à 10 %.

3. imagerie

1. Placer la plaque sur un microscope à fluorescence avec une platine motorisée et d’établir sa qualité de fiduciaire (par exemple, une marque sur le bas de la plaque) qui permet à l’utilisateur d’aligner la plaque chaque fois que c’est imagé. Enregistrer une image de ce fiduciaire pour référence.
2. Accédez à un champ d’intérêt et notez les coordonnées XY par rapport à la qualité de fiduciaire.
3. Se concentrer sur des cellules transfectées exprimant une étiquette fluorescente.
4. Prendre les images fluorescentes dans le canal approprié ou canaux (protéine fluorescente protéine fluorescente rouge [DP], vert [GFP], 4′, 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), soit manuellement, soit de façon automatisée. En prenant plusieurs images à intervalles espacés régulièrement, un montage du puits peut être assemblé au cours du traitement de l’image (voir étape 4).
   Remarque : L’espacement dépend de plusieurs facteurs, y compris le grossissement, l’optique du microscope et la taille du détecteur. En général, l’espacement optique entre les images adjacentes se situera entre 90 à 95 % de la taille de chaque image, pour permettre un faible degré de chevauchement de l’image et l’alignement en vedette.
5. Répétez cette procédure aussi souvent que nécessaire, alignement au fiduciaire original chaque fois. Pour l’analyse de survie, d’imagerie a lieu toutes les 6 à 24 h, selon le type de cellule et le but de l’expérience.

4. traitement de l’image

Remarque : Après l’acquisition d’images, une série d’étapes de traitement sont nécessaires avant l’analyse de l’image. Ceux-ci incluent, mais ne se limitent pas aux coutures, empilage et soustraction de fond (Figure 1). L’objectif de ces mesures est de produire une pile d’images, ou des séries chronologiques, dans lequel les cellules sont clairement reconnaissables de leur fond et facile à suivre sur plusieurs points dans le temps. Une macro dédié de Fidji (Image_Processing.ijm, voir 2 fichier supplémentaire), effectue la base piquée, empiler et soustraction d’arrière-plan. Une explication de chaque étape et les paramètres à considérer lors de l’exécution de traitement d’image est fournie dans la section discussion.

1. Réglez les données brutes ou le répertoire d’entrée pour correspondre à la mise en forme illustré à la Figure 2.
2. Si les points dans le temps ne sont pas contiguës (T1, T2, T3), renommer ces dossiers afin qu’ils soient. Cette étape est essentielle pour assurer que la macro Image_Processing tombe pas en panne au cours de l’empilement.
3. Double-cliquez sur l’icône de Fidji pour ouvrir le programme, puis cliquez sur la macro Image_Processing faites glisser la barre de Fidji. Cela va ouvrir la macro dans les Fidji.
4. Ajuster les lignes 2-7 de la macro Image_Processing pour spécifier le répertoire contenant les images, le répertoire de sortie souhaitée pour des images piquées et empilés, le nombre de points d’imagerie, nombre de canaux fluorescent et format de plaque.
5. Déterminer l’ordre dans lequel les images ont été acquises. Pour tester ceci, manuellement piquer un montage d’images à Fidji de manœuvres à la liste de Plugins déroulante | Coutures | Grille/Collection couture. Ajustez les paramètres dans les menus déroulants Type et l’ordre jusqu'à ce qu’une image avec précision cousue est produite.
6. Ajuster les variables GRID_TYPE et STITCH_ORDER dans les lignes 8 et 9 de la macro Image_Processing pour correspondre à ces sélections.
7. Spécifiez le nombre d’images par puits en ajustant la ligne 10 dans la macro Image_Processing .
   Remarque : Pour un montage de 2 x 2 d’images, cette ligne se lirait DIM = 2.
8. Si soustraction de fond est nécessaire, ajuster la ligne 14 dans la macro Image_Processing pour BGSUB = true.
9. Réglez le rayon de roulement bille en ajustant la ligne 15 dans la macro Image_Processing .
   Remarque : Pour des résultats optimaux, la valeur du rayon au moins le diamètre le plus grand objet de premier plan dans l’image.
10. Cliquez sur exécuter pour démarrer la macro Image_Processing . Une fois démarré, Image_Processing avance automatiquement à travers les coutures, empilage et soustraction de l’arrière-plan.

5. marquant la mort cellulaire

Remarque : Voir la section « Discussion » pour plus d’informations sur marquant la mort cellulaire et données censuration.

1. Localiser les empilements d’images produites par le script Image_Processing . Ouvrir ces aux Fidji.
2. Utilisez l' outil de point dans la zone Fidji d’étiqueter individuellement chaque cellule avec un certain nombre. En appuyant sur t après que chaque point va ajouter l’identificateur de la cellule au gestionnaire de ROI (région d’intérêt).
   Remarque : Les identificateurs peuvent être visualisées en cliquant sur les cases à cocher étiquettes et Afficher tous dans le gestionnaire de ROI.
3. Progression dans les intervalles de chaque pile d’image et enregistrement le validant lors de chaque cellule meurt ou besoins d’être censuré dans le fichier Survival_spreadsheet.csv (voir fiche complémentaire 3).
   1. Chaque cellule occupe une seule ligne dans la feuille de calcul, où un identificateur unique (ID) de chaque cellule se compose de son correspondant bien et le nombre ROI dans ce puits. tp_death est le dernier point de temps, qu'on observe une cellule d’être en vie, tandis que time_death représente le temps réel de la mort en heures. Pour chaque cellule, intégrer ces données. Il est essentiel de maintenir cette structure pour une analyse ultérieure à l’aide de survie . R (voir 4 de fichier supplémentaire).
      Remarque : Les critères pour déterminer la mort cellulaire sont cruciales et peuvent varier selon le type de cellule. Trois critères principaux sont utilisés pour l’identification des neurones morts^11,20 (Figure 3) : perte de l’intensité de fluorescence (p. ex., neurone 1 à 69 h), arrondi du corps cellulaire (p. ex., neurone 2 h 188) et la perte des neurites l’intégrité ou blebbing (p. ex., neurone 2 h 188).
4. Enregistrer l’état de la censure de la cellule dans la dernière colonne.
   Remarque : Ici, en raison de la manière particulière censurer est géré par R, censuré les cellules sont marquées par 0, tandis que les cellules non censurées sont marquées par 1. Notez que toutes les cellules qui vivent au dernier moment sont censurés et donc le symbole 0.

6. effectuer la Cox proportionnelle des dangers analyse et visualisation des résultats

1. Si nécessaire, téléchargez R-studio à https://cran.r-project.org/mirrors.html.
2. Ouvrez studio R et double-cliquez sur l’icône pour la survie de le . R script.
3. Placez le curseur sur la ligne 2 de survie . R et cliquez sur le bouton exécuter dans la fenêtre principale du studio R afin de charger la bibliothèque de survie.
4. Modifiez la ligne 5 de la survie . R script pour correspondre à l’emplacement du fichier Survival_spreadsheet.csv. Cliquez sur exécuter pour charger les données de survie comme un dataframe.
5. Mettre en évidence les lignes 8 et 9, puis cliquez sur le bouton exécuter dans la fenêtre de console de studio R afin d’effectuer une analyse de risques proportionnels de Cox. Résultats et statistiques de sortie apparaissent dans la fenêtre de console de studio R.
6. Mettre en évidence les lignes 12 à 16 de survie . R et appuyez sur le bouton exécuter afin de produire un risque cumulatif de l’intrigue de la mort, ce qui apparaîtra dans l’onglet emplacements dans studio R. Ce fichier peut être enregistré en cliquant sur le bouton exporter au-dessus de l’intrigue.
7. Si c’est souhaitable pour tracer les données de survie comme une courbe de Kaplan-Meier, mettre les lignes 19 à 24 de survie . R et appuyez sur le bouton exécuter .

Résultats

Selon la méthode de transfection décrite ici, DIV4 neurones corticaux de rat ont été transfectées avec un plasmide codant la protéine fluorescente mApple. À partir de transfection après 24h, cellules ont été photographiés par microscopie de fluorescence toutes les 24 h pendant 10 jours consécutifs. Les images qui en résultent ont été organisés comme indiqué dans la Figure 2, puis cousus, empilés et a marqué pour la mort de cellules (

Discussion

Ici, la méthodologie de contrôler directement la survie neuronale sur une seule cellule de base est présentée. Par contraste avec les tests traditionnels pour la mort des cellules qui se limitent à des moments discrets et des populations entières de cellules, cette méthode permet l’évaluation continue d’une variété de facteurs tels que la morphologie cellulaire, expression de la protéine ou la localisation, et permet de déterminer comment chaque facteur influence la survie cellulaire de manière prospecti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12863
Magnesium chloride Hexahydrate	Sigma	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
Poly D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 supplement	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
96 well plates	TPP	0876