縦の蛍光顕微鏡による神経細胞の生存を監視

要約

ここでは、単一セルごとに生存率を監視し、細胞死を有意に予測変数を識別するプロトコルを提案します。

要約

Lysates または時間の複数のポイントで固定セルのコレクションを必要とする標準的な細胞毒性の試金は、感度と神経細胞の運命に影響を与える要因を評価する能力に限られています。これらのアッセイは、離散時間で細胞の個別集団の観察を必要とします。その結果、個々 の細胞は涙点形成やタンパク質サッカード定位誤りなど、細胞内のイベントが恒常性維持反応病の病原性ドライバーかどうかを判別する能力を厳しく制限すること、時間をかけて前向き後ことはできません。または単なる偶然の一致現象。単一セルの縦の顕微鏡は、個体群間の生存率の差を判断して強化された感度との因果関係を描く研究をできるように、これらの制限を克服します。このビデオ ガイドは蛍光タンパク質マーカーを表現するラット一次皮質ニューロンの単一細胞生存率を測定する実験のための代表的なワークフローの概要を説明します。ビューアーは高効率 transfections を達成するため、収集し、個々 のセルの将来の追跡を有効にする画像を処理する方法について説明し、Cox 比例ハザード解析を用いた神経細胞群の相対生存率を比較します。

概要

異常な細胞死は、多くの病気、がん、神経変性、ストローク¹などの要因です。細胞死の堅牢かつ敏感な試金は、治療戦略の開発と同様に、これらの疾患の特性に拡張または縮小細胞の生存に不可欠です。現在、直接またはサロゲート マーカー²を介して細胞死の測定方法の数十があります。たとえば、細胞死を選択的に染色死んでいるか生きている細胞³、重要な染料または特定リン脂質膜^4,報^{5,6 の出現を監視することによって助けを借りて、視覚的に評価できます。}.細胞内コンポーネントまたは細胞内代謝細胞溶解時にメディアに放出の測定は、細胞死^7,8のプロキシとして使用できます。また、細胞は代謝活性^9,10を評価することにより近似できます。これらのメソッドは、細胞生存率を評価するための迅速な手段を提供する、けれども注意事項なしではないです。それぞれの手法は、単一の人口、それは個々 の細胞の生存率は、そのユニークなとを区別することは不可能レンダリングとして文化を観察します。また、そのような人口に基づく試金は細胞死、細胞形態、蛋白質の表現、ローカライズなどの重要となる要因を測定することではありません。多くの場合、これらの試金は離散時間ポイントに限定され、時間の経過とともに細胞の連続観測を可能にしません。

対照的に、縦の蛍光顕微鏡は直接かつ継続的に単一セル単位¹¹死のリスクを監視する柔軟性の高い手法です。簡単に言えば、縦蛍光顕微鏡により細胞死とその強化したり、細胞死を抑制する要因の正確な決定を可能にする時間の長期間にわたって定期的に追跡する個々 の細胞の何千も、できます。メソッドは、そのベースで蛍光蛋白質を符号化するベクトルで、トランスフェクションした細胞の情報伝達を伴います。ユニークな受託者を設立し、このランドマークに関連して各 transfected セルの位置はイメージを作成し、時間、日数、または週のコース上の個々 のセルを追跡できます。これらの画像を順番に表示、蛍光、形態、および各セルの死の時間の割り当てを有効にする、細胞体の断片化の特性変化による細胞死がマークされます。死、ハザード関数によって決定の計算されたレート、定量的条件、比較したり関連の一変量あるいは多変量 Cox 比例ハザード解析¹²を使用して携帯電話の特性を選択できます。一緒に、これらのアプローチは、細胞集団の細胞死亡率と細胞死および/または生存 (図 1) を大幅予測変数の識別の正確かつ客観的差別を有効にします。

このメソッドを使用して、多彩なフォーマットをめっき後有糸分裂細胞の種類で生存を監視できますが、このプロトコルは株とイメージングの 96 ウェル プレートで培養ラット大脳皮質ニューロンのための条件を説明します。

プロトコル

すべての脊椎動物の仕事は、使用し、ミシガン大学 (プロトコル # PRO00007096) ケアの動物の委員会によって承認されました。実験は慎重に犠牲になる動物の数を最小限に抑える予定です。妊娠女性野生型 (WT)、非組み換えの長いエバンス ラット (ドブネズミ) は、チャンバー環境エンリッチメントを装備しユニット、ミシガン大学の実験動物医学 (ウラム) の世話に単独で収容されてNIH サポート ガイドに従ってケアと実験動物の使用のため。すべてのラットはルーチンによって安楽死の方法、安楽死、アメリカの獣医の医学連合およびミシガン州大学の安楽死に関するガイドラインの推奨に合致する前にできるだけ少しの時間としての住宅に入っていました種ガイドライン。

1 材料の準備

1. ^{13,14、前に説明したラット 4 デイズ体外ポリ-D-リジン コーティング プレートに 1 ミリリットル当たり 10 の6セル × 0.5 で皮質ニューロンの 19-20 仔と文化萌芽期の日からの皮質ニューロンを解剖します。 15,16,17,18,19}。
2. プラスミッド興味、エンドトキシンのプラスミッド DNA の隔離の手順を次の DNA を準備キット (材料の表を参照してください)。分光光度計を使用して得られた DNA を定量化します。
3. 生体外の日 4 (DIV4)、分注、フィルター、殺菌し、37 ° c: 6 mL で次のメディアを孵化させなさい減少血清メディア (RSM; 例えば.、OptiMEM)、25 mL 神経基底メディア (NBM) 40 mL NBKY (NBM + 1 mM キヌレン酸 + 10 mM MgCl₂7 の pH を調整します。4)、10 mL NBC (NBM + 1 x 神経細胞文化サプリメント + L - グルタミン x 1 + 1 x ペン連鎖球菌)。
   注:リストされているボリュームは、1 つの 96 ウェル プレートの株に対して十分です。特定の試薬のための材料の表を参照してください。

2. ラット大脳皮質神経細胞のトランスフェクション

1. 指定されたトランスフェクション シートの例を変更 (補足ファイル 1参照) プレート型、プレート マップ、Dna の数を調整することによって DNA 濃度と井戸 (緑箱) の数。
   注:全 DNA を関係なく、好評につき、0.2 μ g に合計かどうか 1 つ (例えば.、DNA A) または複数 (例えば、DNA B と C) DNA 構造を追加も。
2. スプレッドシートの作業は、1 つの管で RSM と DNA の適切な量を兼ね備えてください。別のチューブで RSM とトランスフェクション試薬 (例えば、Lipofectamine) の適切な量を兼ね備えてください。
3. 部屋の温度 (RT) 5 分間インキュベートします。
4. DNA、トランスフェクション試薬 RSM の混合物を結合し、室温で 20 分間インキュベートします。
5. このインキュベーション段階マルチ チャンネル ピペットを使用してそして洗浄する滅菌プラスチックたらい細胞 NBM のウェルあたり 100 μ L で 2 倍。エアコンのメディア (CM) を予約し、37 ° C で保存これと次のステップは、ニューロンが空気にさらされている時間の量を最小限に抑えるために注意してください。
6. NBM メディアを取り出し、100 μ L/NBKY のウェルに置き換えます。
7. 20 分が経過した後、各ウェルにトランスフェクション試薬・ DNA の混合物の 50 μ L を滴下追加します。
8. 37 ° C で 20 分間トランスフェクション試薬/DNA 複合体を持つ細胞を孵化させなさい
9. NBKY に 2 x を洗浄し、CM を 100 μ l 添加し、NBC の 100 μ L/ウェルに置き換えます。
10. 正常に transfected セルは、トランスフェクションの 16-24 h 内の蛍光顕微鏡で見えるはずです。効率を測定するには、蛍光顕微鏡を使用して、37 ° C で一晩インキュベートした後トランスフェクション
    注:この手法は、5 ~ 10% のトランスフェクション効率の結果します。

3. イメージング

1. 電動ステージと蛍光顕微鏡にプレートを置き、それのイメージを作成するたびにプレートを配置するユーザーを許可する受託者 (例えば、プレートの底のマーク) を確立します。この受託者の参考のためのイメージを保存します。
2. 目的のフィールドに移動し、受託座標 x と y を注意してください。
3. 蛍光ラベルを表現する transfected セルに焦点を当てます。
4. 手動または自動化された方法では、適切なチャネルまたはチャネル (例えば、赤色蛍光タンパク質 [RFP] 緑の蛍光蛋白質 [GFP], 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]) の蛍光画像を取る。定期的に間隔間隔でいくつかの画像を撮影して、画像処理中に井戸のモンタージュを組み立てることができます (手順 4 を参照)。
   注:間隔は、倍率、顕微鏡、および検出器サイズの光学系を含むいくつかの要因に依存します。一般に、隣接する画像間の光の間隔はイメージ重なりの小さい程度を可能にして、配置の機能に、各イメージのサイズの 90-95% の間になります。
5. たびに必要な元の受託者に合わせとしてしばしばのこのプロセスを繰り返します。生存時間解析、イメージングの起こるでセルの種類や実験の目的によって、すべての 6-24 h が使用。

4. 画像処理

注:画像取り込み、次の一連の処理手順が画像解析の前に必要です。これらなどが、ステッチ、積層、背景差分法 (図 1) に限定されません。次の手順の目的は、画像のスタック、または時系列、細胞は明らかにその背景から識別と複数の時間ポイントを以下に簡単にです。専用のフィジー マクロ (Image_Processing.ijm、補足のファイル 2を参照)、基本的なステッチ、スタッキングを実行し、バック グラウンド減算。ディスカッション セクションの各ステップと画像処理を実行するときにパラメーターの説明が表示されます。

1. 生データまたは入力ディレクトリに図 2に示すように書式を合わせて調整します。
2. 時間が連続していない場合 (すなわち、T1、T2、T3)、されるようにこれらのフォルダーを変更します。この手順はImage_Processingマクロがクラッシュしないことを確認する重要なスタック時。
3. プログラムを開く、クリックしてフィジー バーにImage_Processingマクロをドラッグするフィジー アイコンをダブルクリックします。フィジー諸島内のマクロが表示されます。
4. 画像、ステッチと積み上げの画像を所望の出力ディレクトリ、画像の縦長の数、蛍光チャンネルとプレート形式の数を含む入力ディレクトリを指定するImage_Processingマクロの行 2-7 を調整します。
5. イメージが取得された順序を決定します。これをテストするには、手動でプラグインドロップ ダウン メニュー |を操縦でフィジーのイメージのモンタージュをステッチします。ステッチ|グリッド/コレクションのステッチをします。正確にステッチのイメージが作成されるまでは、ドロップ ダウン メニューから型および順序内の設定を調整します。
6. GRID_TYPEとSTITCH_ORDERライン 8 と 9 のこれらの選択に一致するImage_Processingマクロの変数を調整します。
7. Image_Processingマクロで 10 号線を調整することによって井戸あたりの画像数を指定します。
   注:イメージのモンタージュで 2 × 2 の所に、この行が読む DIM = 2。
8. 背景差分が必要な場合の調整 BGSUB Image_Processingマクロで 14 行目 = true。
9. Image_Processingマクロの 15 行を調整することにより、ローリングの球の半径を設定します。
   注:最適な結果を得るのために、少なくとも半径を設定イメージに最も大きい前景オブジェクトの直径。
10. Image_Processingマクロを起動する実行をクリックします。開始後、 Image_Processingはステッチ、スタッキングと背景差分を自動的に進みます。

5 得点の細胞死

注:得点の細胞死と修正データの詳細についての議論を参照してください。

1. Image_Processingスクリプトによって生成される画像のスタックを探します。フィジーでこれらを開きます。
2. 個別におり、各セルにラベルを付ける、ツールをポイント内フィジーを使用します。各ポイントはセルの識別子を投資収益率 (関心領域) マネージャーに追加後は、 tを押します。
   注:識別子は、ROI マネージャーでラベルとすべてを表示チェック ボックスをクリックして視覚化できます。
3. 各画像のスタックと各細胞のダイスまたはファイルSurvival_spreadsheet.csv (補足のファイル 3 を参照) に修正する必要がある場合 timepoint のレコードで縦長処理を進めます。
   1. 各セルは、そのよく対応してその中の投資収益率数でセルごとに一意の識別子 (ID) が構成されているスプレッドシートの単一行を占めています。tp_death は、セルが time_death 時間の死の実際の時刻を表している間生きていること観察される最後の時間ポイントです。各セルについて、これらのデータを入力します。生存を使用してその後の分析のこの構造を維持するために重要です。R (補足ファイル 4を参照)。
      注: 細胞死を決定する条件に欠かせない、細胞の種類に応じて異なる場合があります。死んだニューロン^11,20 (図 3) の識別に使用される 3 つの主な基準: 蛍光強度 (69 h で例えば、ニューロン 1) の損失 (188 h で例えば、ニューロン 2) 細胞体と神経突起の損失の丸め整合性またはブレブ (188 h でニューロン 2 など)。
4. 最後の列にセルの検閲状態を記録します。
   注:独特の方法のためここでは、処理は検閲無修正セルが1によってマークされた中 r、修正のセルが0、マークされました。ライブの最後の時点のすべてのセルが、検閲、ため、 0としてマークに注意してください。

6. 解析と可視化結果の危険コックス比例の実行

1. 必要に応じて、https://cran.r-project.org/mirrors.html で R スタジオをダウンロードします。
2. R スタジオを開き、の生存のアイコンをダブルクリックします。Rスクリプト。
3. 生存の 2 行目にカーソルを置きます。Rし生存ライブラリをロードするために R studio のメイン ウィンドウの [実行] ボタンをクリックします。
4. サバイバルの 5 行目を変更します。Rファイルの場所と一致するスクリプトSurvival_spreadsheet.csv.実行、データ フレームとして生存データを読み込むをクリックします。
5. 8 と 9 の行を強調表示し、Cox 比例ハザード解析を実行するために R スタジオ コンソール ウィンドウの [実行] ボタンをクリックします。結果出力統計 R スタジオのコンソール ウィンドウに表示されます。
6. 生存の 12-16 行を強調表示します。R R スタジオ [プロット] タブに表示されます死のプロットの累積リスクを生成するために実行ボタンを押す。このファイルは、プロットの上の [エクスポート] ボタンをクリックして保存することができます。
7. 生存データを Kaplan-meier 曲線としてプロットすることが望ましいが場合、は、生存のライン 19-24 を強調表示します。Rし実行ボタンを押します。

結果

ここでトランスフェクションの手順を使用して、DIV4 ラット大脳皮質ニューロンが蛍光タンパク質マップルをエンコーディング プラスミドを導入させた。24 h 後トランスフェクションを初め、細胞を蛍光顕微鏡によるすべての 24 h 連続 10 日間をイメージしました。画像いた編成図 2で示されているように、ステッチ、積み上げ、細胞死 (

ディスカッション

ここでは、単一セルごとに神経細胞の生存を直接観察する方法が表示されます。離散時間とセルの全体の人口に制限されている細胞死の伝統的なアッセイと対照をなしてこの手法によりさまざまな細胞形態、蛋白質の表現、またはローカリゼーションなどの要因の継続的な評価とそれぞれの因子が将来的に細胞の生存をどのように影響するかを判断できます。

この方法?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12863
Magnesium chloride Hexahydrate	Sigma	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
Poly D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 supplement	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140122
96 well plates	TPP	0876