Überwachung der neuronalen Überleben über längs-Fluoreszenz-Mikroskopie

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zum Überleben auf eine einzelne Zelle Basis überwachen und Variablen, die deutlich Zelltod Vorhersagen zu identifizieren.

Zusammenfassung

Standard Zytotoxizität Assays, die die Sammlung von Lysates oder festen Zellen zu mehreren Zeitpunkten erfordern, haben nur begrenzte Empfindlichkeit und Fähigkeit zur Bewertung von Faktoren, die Einfluss auf neuronale Schicksal. Diese Tests erfordern die Beobachtung der getrennten Populationen von Zellen zu diskreten Zeitpunkten. Infolgedessen darf nicht einzelne Zellen prospektiv folgen im Laufe der Zeit die Fähigkeit zur Unterscheidung, ob subzelluläre Ereignisse, z. B. Puncta Entstehung oder Protein Mislocalization, pathogenen Treiber von Krankheit, homöostatische Reaktionen stark einschränken, oder rein zufällig Phänomene. Einzellige längs Mikroskopie überwindet diese Einschränkungen, so dass des Forschers um Unterschiede im Überleben zwischen Populationen bestimmen und zeichnen Sie kausale Zusammenhänge mit verbesserte Empfindlichkeit. Dieser video-Anleitung skizziere einen repräsentativen Workflow für Experimente Messung Einzeller Überleben der Ratte primären kortikalen Neuronen einen fluoreszierendes Protein-Marker zum Ausdruck zu bringen. Der Betrachter wird lernen, wie man Hocheffizienz Transfektionen erreichen, sammeln und verarbeiten Bilder ermöglichen die zukünftige Verfolgung einzelner Zellen und das relative Überleben der neuronalen Populationen mit Cox proportional Gefahrenanalyse zu vergleichen.

Einleitung

Abnorme Zellen der Tod ist ein treibender Faktor in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, Neurodegeneration und Takt¹. Robust und sensibel Assays für Zelltod sind unerlässlich, um die Charakterisierung dieser Störungen sowie die Entwicklung von therapeutischen Strategien zur Erweiterung oder Reduzierung der zellulären überleben. Derzeit gibt es Dutzende von Techniken zur Messung der Zelltod, entweder direkt oder durch Surrogat-Marker-². Zum Beispiel kann Zelltod visuell beurteilt werden mit Hilfe der lebenswichtige Farbstoffe, die tote oder lebende Zellen³selektiv beflecken oder durch das Auftreten von bestimmten Phospholipide auf der Plasmamembran^{4,5,6 Überwachung} . Messungen von intrazellulären Komponenten oder zellulären Metaboliten in den Medien auf zelluläre Auflösung freigegeben dient auch als Proxys für Zelle Tod^7,8. Alternativ kann zelluläre Lebensfähigkeit angenähert werden, durch die Beurteilung der Stoffwechselaktivität^9,10. Obwohl diese Methoden schnelle Mittel zur Bewertung der Zelle überleben bieten, sind sie nicht ohne Vorbehalte. Jede Technik beobachtet die Kultur als eine einzelne Population, wodurch es unmöglich, zwischen den einzelnen Zellen und ihre einzigartige Preise des Überlebens zu unterscheiden. Darüber hinaus können solche bevölkerungsbezogene Assays Faktoren messen, die für Zelltod, einschließlich zellulären Morphologie, Proteinexpression oder Lokalisierung wichtig sein können. In vielen Fällen diese Tests beschränken sich auf diskreten Zeitpunkten, und erlauben nicht die kontinuierliche Beobachtung von Zellen im Laufe der Zeit.

Im Gegensatz dazu ist längs Fluoreszenzmikroskopie eine hochflexible Methodik, die direkt und kontinuierlich das Risiko des Todes auf eine einzelne Zelle Basis^{11 überwacht}. In Kürze kann längs Fluoreszenzmikroskopie Tausende von einzelnen Zellen verfolgt werden in regelmäßigen Abständen über einen längeren Zeitraum hinweg, ermöglicht die präzise Bestimmung der Zelltod und die Faktoren, die zu verbessern oder zu unterdrücken, Zelltod. An der Basis umfasst der Methode die transiente Transfektion oder Transduktion von Zellen mit Vektoren fluoreszierende Proteine codieren. Eine einzigartige Treuhänder ist dann hergestellt, und die Position der einzelnen transfizierten Zellen in Bezug auf dieses Merkmal ermöglicht dem Benutzer, Bild und verfolgen Sie einzelne Zellen im Verlauf von Stunden, Tagen oder Wochen. Wenn diese Bilder nacheinander angezeigt werden, zeichnet sich Zelltod durch charakteristische Veränderungen in Fluoreszenz, Morphologie und Fragmentierung der Zellkörper, ermöglicht die Zuordnung von einer Zeit der Tod für jede Zelle. Die errechnete Rate des Todes, bestimmt durch die Hazard-Funktion kann dann quantitativ im Vergleich zwischen den Bedingungen oder im Zusammenhang mit zelluläre Eigenschaften mit univariaten und multivariaten Cox proportional Gefahren Analyse¹²auswählen. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die genaue und objektive Diskriminierung der Preise des Zelltods bei der zellularen Bevölkerung sowie die Ermittlung der Variablen, die deutlich Zelltod und/oder überleben (Abbildung 1 Vorhersagen).

Obwohl diese Methode verwendet werden kann, zu überleben in jeder Post-mitotische Zelle Art in einer Vielzahl von Formaten Plattieren zu überwachen, wird dieses Protokoll Bedingungen für transfecting und imaging-Ratte kortikale Neuronen in einer 96-Well-Platte kultiviert beschreiben.

Protokoll

Alle Wirbeltiere tierische Arbeit wurde vom Ausschuss für die Nutzung und Pflege von Tieren an der University of Michigan (Protokoll # PRO00007096) genehmigt. Experimente sind sorgfältig geplant, um die Anzahl der Tiere geopfert zu minimieren. Schwangere Frauen-Wildtyp (WT), nicht-transgenen lange Evans Ratten (Rattus Norvegicus) sind einzeln untergebracht, in Kammern mit Umweltanreicherung ausgestattet und betreut vom Referat für Labor Tier Medizin (ULAM) an der University of Michigan, in Übereinstimmung mit dem NIH-gestützte Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Alle Ratten wurden in der Routine Gehäuse für so wenig Zeit wie möglich vor Euthanasie, Einklang mit den Empfehlungen der Leitlinien für die Euthanasie von der American Veterinary Medical Association und der University of Michigan Methoden der Euthanasie durch gehalten. Arten-Richtlinien.

1. materielle Vorbereitung

1. Sezieren Sie kortikale Neuronen aus embryonalen Tag 19 – 20 Ratte Welpen und Kultur kortikale Neuronen bei 0,5 x 10⁶ Zellen pro Milliliter auf Poly-D-Lysin beschichtete Platten für 4 Tage in Vitro, Ratte, wie zuvor beschrieben^{13,14, 15,16,17,18,19}.
2. Bereiten Sie das Plasmid DNA des Interesses das Wiederherstellungsprogramm Endotoxin-freie Plasmid DNA-Isolierung kit (siehe Tabelle der Materialien). Die daraus resultierende DNA mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren.
3. Auf in-vitro-Tag 4 (DIV4), Aliquoten, Filter zu sterilisieren und inkubieren Sie folgenden Medien bei 37 ° C: 6 mL reduziert Serum Medien (RSM, z.B.., OptiMEM), 25 mL neuronalen basale Medien (NBM), 40 mL NBKY (NBM + 1 mM Kynurenic Säure + 10 mM MgCl₂, einem pH-Wert von 7 eingestellt. (4), 10 mL NBC (NBM + 1 X neuronale Zelle Kultur Ergänzung + 1 x L-Glutamin ergänzen + 1 x Stift Strep).
   Hinweis: Bände aufgeführt sind ausreichend für transfecting einer 96-Well-Platte. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für bestimmte Reagenzien.

2. die Transfektion von kortikalen Neuronen der Ratte

1. Ändern Sie die mitgelieferten Beispiel Transfektion Blatt (siehe ergänzende Datei 1) durch die Anpassung der Platte, Platte Karte, Anzahl der DNAs, DNA-Konzentration und Anzahl der Bohrungen (grüne Felder).
   Hinweis: Der gesamte-DNA fasst um 0,2 µg pro Bohrloch, unabhängig davon, ob man (z. B.., DNA-A) oder mehrere (z. B. DNA-B und C) DNA-Konstrukte hinzugefügt in jede Vertiefung.
2. Kombinieren Sie aus der Tabelle arbeiten, die entsprechende Menge von RSM und DNA in eine Röhre. Kombinieren Sie die entsprechende Menge an RSM und Transfection Reagens (z. B. Lipofectamine) in einem separaten Rohr.
3. Bei Raumtemperatur (RT) für 5 min inkubieren.
4. Kombinieren Sie die DNA und Transfection Reagens RSM Mischungen und 20 min bei RT inkubieren.
5. Während dieser Inkubationsschritt verwenden, eine Mehrkanal-Pipette und sterile Kunststoff Tröge waschen Zellen 2 X mit 100 µL pro Bohrloch der NBM. Reservieren Sie die konditionierten Medien (CM) und bei 37 ° c lagern Für diese und folgende Schritte kümmern Sie sich um die Zeit zu minimieren, die Neuronen der Luft ausgesetzt sind.
6. Entfernen Sie die NBM-Medien und mit 100 µL pro Bohrloch des NBKY ersetzen.
7. Nach 20 min vergangen, fügen Sie 50 µL Transfection Reagens/DNA-Gemisch tropfenweise in jede Vertiefung hinzu.
8. Inkubieren Sie Zellen mit Transfection Reagens/DNA-komplexe für 20 min bei 37 ° c
9. Spülen Sie 2 X mit NBKY und mit 100 µL CM und 100 µL der NBC pro Bohrloch zu ersetzen.
10. Erfolgreich transfected Zellen sollten durch Fluoreszenzmikroskopie innerhalb von 16 – 24 h Transfektion sichtbar. Um Effizienz zu beurteilen, verwenden Sie fluoreszierende Mikroskop, überprüfen die Transfektion nach Übernachtung Inkubation bei 37 ° C.
    Hinweis: Diese Technik ergibt sich ein Gesamtwirkungsgrad der Transfektion von 5 bis 10 %.

(3) Bildgebung

1. Die Platte auf einem fluoreszierenden Mikroskop mit einem motorisierten Stadium, und etablieren ein Treuhänder (z. B. eine Markierung auf der Unterseite der Platte), die es ermöglichen den Benutzer, die Platte jedes Mal ausrichten, die es abgebildet ist. Speichern Sie ein Bild von diesem Treuhand als Referenz.
2. Navigieren Sie zu einem Interessengebiet und beachten Sie die X / y-Koordinaten relativ zum Treuhänder.
3. Fokus auf transfizierten Zellen eine fluoreszierende Label zum Ausdruck zu bringen.
4. Nehmen Sie fluoreszierende Bilder in der entsprechenden Kanal oder Kanäle (z. B. rot fluoreszierende Protein [Ausschreibung] grün fluoreszierendes Protein [GFP], 4, 6-Diamidino-2-Phenylindole ' [DAPI]), entweder manuell oder automatisiert. Nehmen Sie mehrere Bilder in Abständen regelmäßig verteilt, kann eine Montage des Brunnens während der Bildverarbeitung montiert werden (siehe Schritt 4).
   Hinweis: Der Abstand hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich Vergrößerung, die Optik des Mikroskops und der Detektorgröße. Der optischen Abstand zwischen benachbarten Bildern werden in der Regel zwischen 90 – 95 % der Größe der jedes einzelne Bild, um eine kleine Portion Bildüberlappung zu ermöglichen und Ausrichtung verfügen.
5. Wiederholen Sie diesen Vorgang so oft wie erforderlich, Angleichung an die ursprünglichen Treuhänder jedes Mal. Für Überlebensanalyse findet bildgebenden alle 6 – 24 h, je nach Zelltyp und dem Zweck des Experiments.

(4) Bildverarbeitung

Hinweis: Nach Bildaufnahme sind eine Reihe von Verarbeitungsschritten erforderlich, vor der Bildanalyse. Diese beinhalten, aber sind nicht beschränkt auf, Nähte, stapeln und Hintergrundabzug (Abbildung 1). Diese Schritte soll ein Bildstapel oder Zeitreihen, in denen Zellen deutlich erkennbar von ihrer Herkunft und leicht zu folgen über mehrere Zeitpunkte sind zu produzieren. Ein spezielles Fidschi-Makro (Image_Processing.ijm, siehe ergänzende Datei 2), führt grundlegende Nähte, stapeln, und im Hintergrund der Subtraktion. Eine Erklärung von jedem Schritt und die Parameter, die bei der Durchführung von Bildverarbeitung wird in die Diskussion Abschnitt bereitgestellt.

1. Passen Sie die raw-Daten oder Eingabeverzeichnis entsprechend der Formatierung in Abbildung 2dargestellt.
2. Wenn Zeitpunkten nicht zusammenhängend sind (T1, T2, T3), benennen Sie diese Ordner, so dass sie sind. Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Image_Processing -Makro nicht abstürzt während stapeln.
3. Doppelklicken Sie auf die Fidschi-Symbol öffnen Sie das Programm dann klicken und ziehen das Image_Processing -Makro auf die Fidschi-Bar. Es öffnet sich das Makro in Fidschi.
4. Passen Sie Zeilen 2 bis 7 des Image_Processing Makros mit Bildern, das gewünschte Ausgabeverzeichnis für genäht und gestapelten Bilder, die Anzahl der bildgebenden Zeitpunkte, fluoreszierende Kanalanzahl und Plattenformat Eingabeverzeichnis angeben.
5. Bestimmen Sie die Reihenfolge, in der die Bilder erworben wurden. Um dies zu testen, Nähen Sie manuell eine Montage von Bildern in Fidschi von manövrieren zu Plugins Dropdown-Menü | Nähte | Raster/Sammlung zu nähen. Passen Sie die Einstellungen in den Dropdown-Menüs, Art und Reihenfolge , bis ein akkurat genähten Bild entsteht.
6. Passen Sie die Variablen GRID_TYPE und STITCH_ORDER in den Zeilen 8 und 9 des Image_Processing Makros entsprechend dieser Auswahl.
7. Geben Sie die Anzahl der Bilder pro Bohrloch durch Linie 10 in das Image_Processing -Makro anpassen.
   Hinweis: Für ein 2 x 2 Montage der Bilder, lautet diese Zeile DIM = 2.
8. Hintergrundabzug erforderlich, passen Sie Linie 14 in das Image_Processing -Makro, BGSUB = True.
9. Den rollende Ball Radius durch Anpassung der Linie 15 in das Image_Processing -Makro festgelegt.
   Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, legen Sie den Radius mindestens die Durchmesser der größten Vordergrundobjekt im Bild.
10. Klicken Sie auf Ausführen , um das Image_Processing -Makro zu starten. Einmal gestartet, wird die Image_Processing automatisch durch Nähte, stapeln und Hintergrundabzug voraus.

5. Tore schießen Zelltod

Hinweis: Sehen Sie die Diskussion Abschnitt Weitere Informationen auf scoring Zelltod und Zensur Daten.

1. Suchen Sie die Bild-Stapel durch das Image_Processing -Skript erzeugt. Öffnen Sie diese in Fidschi.
2. Verwenden Sie die richten Werkzeug , in Fidschi, um individuell beschriften Sie jede Zelle mit einer Zahl. Drücken t , nachdem jeder Punkt der ROI (Region of Interest) Manager die Cell-ID hinzugefügt werden.
   Hinweis: Die Bezeichner können visualisiert werden, indem Sie auf den Etiketten und zeigen alle Checkboxen in der ROI-Manager.
3. Fortschritt durch die Zeitpunkte in jedem Bildstapel und Datensatz Timepoint wenn jede Zelle entweder stirbt oder muss in der Datei Survival_spreadsheet.csv (siehe ergänzende Datei 3) zensiert werden.
   1. Jede Zelle nimmt eine einzelne Zeile in der Tabelle, wo eine eindeutige Kennung (ID) für jede Zelle der entsprechend gut und ROI-Nummer innerhalb so gut besteht. Tp_death ist der letzte Zeitpunkt, die, den eine Zelle beobachtet wird, zu leben, während Time_death der tatsächliche Zeitpunkt des Todes in Stunden darstellt. Geben Sie für jede Zelle diese Daten. Es ist wichtig, diese Struktur für die spätere Analyse mit überleben zu erhalten. R (siehe ergänzende Datei 4).
      Hinweis: Die Kriterien für die Bestimmung der Zelltod sind von entscheidender Bedeutung und können je nach Zelltyp. Drei Hauptkriterien dienen zur Identifizierung der Toten Neuronen^11,20 (Abbildung 3): Verlust der Fluoreszenzintensität (z. B. Neuron 1 69 h), Rundung der Zellkörper (z. B. Neuron 2 188 h) und den Verlust von Neuriten Integrität oder Blebbing (z. B. Neuron 2 188 h).
4. Notieren Sie den Zensor-Status der Zelle in der letzten Spalte.
   Hinweis: Hier, aufgrund der besonderen Art Zensur erfolgt durch R, zensierte Zellen zeichnen sich durch 0, während unzensierte Zellen durch 1gekennzeichnet sind. Beachten Sie, dass alle Zellen, die bis zum letzten Zeitpunkt Leben zensiert, und daher 0gekennzeichnet.

6. Durchführung Cox Proportional Gefahren, Analyse und Visualisierung von Ergebnissen

1. Bei Bedarf downloaden Sie R-Studio bei https://cran.r-project.org/mirrors.html.
2. Öffnen Sie R-Studio, und doppelklicken Sie auf das Symbol für das Überleben der . R Skript.
3. Platzieren Sie den Cursor in Zeile 2 der überleben. R und klicken Sie auf den run -Button im Hauptfenster der R-Studio um die Überlebens-Bibliothek laden.
4. Ändern Sie Zeile 5 der überleben. R Skript, um den Speicherort der Datei übereinstimmen Survival_spreadsheet.csv. Klicken Sie auf die Überlebensdaten als einen Dataframe laden laufen .
5. Markieren Sie Linien 8 und 9 zu und klicken Sie auf Ausführen in der R-Studio-Konsole-Fenster um Cox proportional Gefahrenanalyse durchführen. Ergebnisse und Statistiken der Ausgabe erscheint im Konsolenfenster von R-Studio.
6. Markieren Sie die Zeilen 12-16 überleben. R und drücken Sie die Schaltfläche " Ausführen " um eine kumulative Risiko des Todes Plot, zu produzieren, die in der Registerkarte "Grundstücke" R-Studio angezeigt wird. Diese Datei kann gespeichert werden, indem Sie auf die Schaltfläche " exportieren " über das Grundstück.
7. Wenn es wünschenswert ist, die Überlebensdaten als Kaplan-Meier-Kurve zu zeichnen, markieren Sie, Zeilen 19-24 von überleben. R und drücken Sie die Schaltfläche " Ausführen ".

Ergebnisse

Mit Hilfe der Transfektion beschriebene hier waren DIV4 Ratte kortikale Neuronen mit einem Plasmid Codierung der fluoreszierenden Proteins mApple transfiziert. Ab 24 h nach Transfektion, wurden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie alle 24 h für 10 aufeinanderfolgende Tage abgebildet. Die resultierenden Bilder wurden organisiert, wie in Abbildung 2gezeigt dann genäht, gestapelt und erzielte für Zelltod (Abbildung 1).

Diskussion

Hier präsentiert Methodik neuronaler überleben auf einer Single-Cell-Basis direkt zu überwachen. Diese Methode erlaubt im Gegensatz zur traditionellen Assays für Zelltod, die zu diskreten Zeitpunkten und ganze Bevölkerungen der Zellen beschränkt sind, für die kontinuierliche Bewertung einer Vielzahl von Faktoren wie zellulären Morphologie, Proteinexpression oder Lokalisierung, und können Sie bestimmen, wie jeder Faktor zellulare überleben in einer prospektiven Weise beeinflusst.

Dies...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12863
Magnesium chloride Hexahydrate	Sigma	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
Poly D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 supplement	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
96 well plates	TPP	0876