Monitoraggio di sopravvivenza di un neurone tramite microscopia a fluorescenza longitudinale

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per monitorare la sopravvivenza su una base di singola cellula e identificare le variabili che significativamente predicono la morte delle cellule.

Abstract

Saggi di citotossicità standard, che richiedono la raccolta di lisati o celle fisse a più punti di tempo, hanno limitato la sensibilità e la capacità di valutare i fattori che influenzano il destino di un neurone. Queste analisi richiedono l'osservazione di popolazioni separate delle cellule a intervalli di tempo discreti. Di conseguenza, le singole celle non possono essere seguite prospetticamente nel tempo, limitando gravemente la capacità di discriminare se subcellulari eventi, ad esempio puncta formazione o mislocalization di proteine, sono driver patogeni della malattia, le risposte omeostatiche, o fenomeni puramente coincidenti. Cella singola longitudinale microscopia supera queste limitazioni, che permette al ricercatore di determinare le differenze nella sopravvivenza tra popolazioni e disegnare relazioni causali con maggiore sensibilità. Questa video guida illustrerà un flusso di lavoro rappresentativo per gli esperimenti di sopravvivenza unicellulari di primaria neuroni corticali del ratto, che esprime un proteina fluorescente indicatore di misura. Lo spettatore sarà imparare a raggiungere ad alta efficienza transfezioni, raccogliere ed elaborare immagini consentendo il monitoraggio prospettico delle singole celle e confrontare la relativa sopravvivenza di popolazioni neuronali utilizzando analisi rischi proporzionali di Cox.

Introduzione

Morte delle cellule anormali è un fattore trainante in molte malattie, compreso cancro, neurodegenerazione e corsa¹. Saggi di robuste e sensibile per la morte delle cellule sono essenziali per la caratterizzazione di questi disordini, come pure lo sviluppo di strategie terapeutiche per estendere o ridurre la sopravvivenza cellulare. Attualmente esistono decine di tecniche per la misurazione di morte delle cellule, direttamente o tramite surrogati marcatori². Ad esempio, morte delle cellule può essere valutata visivamente con l'ausilio di coloranti vitali che macchia selettivamente cellule morte o vita³, o controllando l'aspetto dei fosfolipidi specifici sulla membrana plasmatica^4,5,6 . Misure di componenti intracellulari o di metaboliti cellulari rilasciati in media dopo la dissoluzione cellulare utilizzabile anche come proxy per cellule morte^7,8. In alternativa, la vitalità cellulare può essere approssimata valutando attività metabolica^9,10. Anche se questi metodi forniscono mezzi rapidi di valutare la sopravvivenza delle cellule, non sono senza avvertimenti. Ogni tecnica osserva la cultura come un'unica popolazione, rendendo impossibile distinguere tra le singole celle e loro unici tassi di sopravvivenza. Inoltre, tali dosaggi basati sulla popolazione sono in grado di misurare i fattori che possono essere importanti per la morte delle cellule, compreso la morfologia cellulare, l'espressione della proteina o localizzazione. In molti casi, queste analisi sono limitate ai punti di tempo discreto e non consentono l'osservazione continua delle cellule nel corso del tempo.

Al contrario, microscopia a fluorescenza longitudinale è una metodologia altamente flessibile che direttamente e continuamente controlla il rischio di morte su una singola cellula base¹¹. In breve, microscopia a fluorescenza longitudinale consente a migliaia di singole celle per essere monitorati ad intervalli regolari per lunghi periodi di tempo, consentendo precise determinazioni di morte delle cellule e dei fattori che migliorano o sopprimono la morte delle cellule. Alla sua base, il metodo prevede la trasfezione transiente o trasduzione delle cellule con vettori codificanti proteine fluorescenti. Un unico fiduciario viene quindi stabilito, e la posizione di ogni cellule transfettate in relazione a questa pietra miliare consente all'utente di immagine e tenere traccia di singole cellule nel corso di ore, giorni o settimane. Quando queste immagini vengono visualizzate in sequenza, la morte delle cellule è contrassegnata da cambiamenti caratteristici in fluorescenza, la morfologia e la frammentazione del corpo cellulare, consentendo l'assegnazione di un tempo di morte per ogni cella. Il tasso di morte, determinata dalla funzione di rischio, calcolato può quindi essere quantitativamente rispetto tra le condizioni, o correlato per selezionare caratteristiche cellulari utilizzando monovariante o analisi multivariata rischi proporzionali di Cox¹². Insieme, questi approcci consentono la discriminazione accurata e obiettiva dei tassi di morte delle cellule fra popolazioni cellulari e l'identificazione delle variabili che significativamente predicono la morte delle cellule e/o sopravvivenza (Figura 1).

Anche se questo metodo può essere utilizzato per monitorare la sopravvivenza in qualsiasi tipo di cellule post-mitotiche in una varietà di formati di placcatura, questo protocollo descriverà le condizioni per trasfezione e imaging neuroni corticali del ratto coltivati in una piastra a 96 pozzetti.

Protocollo

Tutto il lavoro degli animali vertebrato è stato approvato dal Comitato per l'uso e la cura degli animali presso l'Università del Michigan (protocollo n # PRO00007096). Gli esperimenti vengono pianificati attentamente per ridurre al minimo il numero di animali sacrificati. Incinta femmina wild-type (WT), non transgenica ratti lungo Evans (Rattus norvegicus) sono alloggiati singolarmente in camere dotate di arricchimento ambientale e curato dall'unità per laboratorio animale medicina (ULAM) presso l'Università del Michigan, in conformità con la Guida di NIH-supportato per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutti i ratti sono stati tenuti in custodia per il minor tempo possibile prima dell'eutanasia, coerenza con le raccomandazioni delle linee guida sull'eutanasia dell'associazione medica veterinaria americana e l'Università del Michigan metodi di eutanasia di routine Linee guida di specie.

1. materiale preparazione

1. Sezionare i neuroni corticali da giorno embrionale 19 – 20 cuccioli del ratto e cultura ratto neuroni corticali a 0,5 x 10⁶ cellule per millilitro sulle piastre rivestite con poli-D-lisina per 4 giorni in vitro, come descritto in precedenza^{13,14, 15,16,17,18,19}.
2. Preparare il plasmide DNA di interesse seguendo la procedura descritta da un isolamento di DNA plasmidico privo di endotossina kit (Vedi Tabella materiali). Quantificare il DNA risultante utilizzando uno spettrofotometro.
3. Il giorno in vitro filtro aliquota, 4 (DIV4), sterilizzare e incubare i seguenti supporti a 37 ° c: 6 mL ridotto media del siero (RSM; ad es.., OptiMEM), 25 mL di un neurone media basale (NBM), 40 mL NBKY (NBM + acido chinurenico 1 mM + 10 mM MgCl₂, regolato ad un pH di 7. 4), 10ml NBC (NBM + 1 x un neurone delle cellule supplemento cultura + 1 x supplemento di L-Glutammina + 1 x penna Strep).
   Nota: Volumi elencati sono sufficienti per trasfettando una piastra a 96 pozzetti. Fare riferimento alla Tabella materiali per reagenti specifici.

2. transfezione dei neuroni corticali del ratto

1. Modificare il fornito esempio foglio di transfezione (vedere Supplemental File 1) regolando il tipo di piastra, mappa di piastra, numero di DNAs, concentrazione del DNA e il numero di pozzetti (scatole verdi).
   Nota: Il DNA totale somme a 0,2 µ g per bene, indipendentemente dal fatto se uno (es.., A DNA) o più (ad es., DNA B e C) costrutti di DNA vengono aggiunti a ciascun pozzetto.
2. Lavorando dal foglio di calcolo, combinare la quantità appropriata di RSM e DNA in una provetta. Combinare la quantità appropriata di RSM e transfezione reagente (ad es., Lipofectamine) in un tubo separato.
3. Incubare a temperatura ambiente (TA) per 5 min.
4. Unire i composti RSM reagente DNA e transfezione e incubare a temperatura ambiente per 20 min.
5. Durante questa fase di incubazione, utilizzare una pipetta multicanale e depressioni di plastica sterile per lavare le cellule 2x con 100 µ l di NBM. Riserviamo il media condizionati (CM) e conservare a 37 ° C. Per questo e come segue, fare attenzione a ridurre al minimo la quantità di tempo che i neuroni sono esposti all'aria.
6. Rimuovere il supporto NBM e sostituire con 100 µ l di NBKY.
7. Sono trascorsi 20 minuti, aggiungere 50 µ l della miscela reagente/DNA transfezione goccia a goccia in ciascun pozzetto.
8. Incubare le cellule con i complessi di DNA/reagente di transfezione per 20 min a 37 ° C.
9. Sciacquare 2x con NBKY e sostituire con 100 µ l di CM e 100 µ l di NBC per pozzetto.
10. Cellule trasfettate con successo devono essere visibile da microscopia di fluorescenza all'interno 16 – 24 h di transfezione. Per valutare l'efficienza, è necessario utilizzare un microscopio a fluorescenza per controllare la transfezione dopo una notte di incubazione a 37 ° C.
    Nota: Questa tecnica si traduce in un'efficienza di trasfezione complessiva del 5-10%.

3. imaging

1. Collocare la piastra su un microscopio a fluorescenza con un tavolino motorizzato e stabilire un fiduciario (per esempio, un interrogativo sul fondo del piatto) che permetterà all'utente di allineare la piastra ogni volta che si è ripreso. Salvare un'immagine di questo fiduciari per riferimento.
2. Passare a un campo di interesse e le coordinate x-y relative l'intestazione fiduciaria di notare.
3. Concentrarsi su cellule transfettate che esprimono un'etichetta fluorescente.
4. Prendere immagini fluorescenti nel canale appropriato o canali (ad es., proteina fluorescente rossa proteina fluorescente [RFP], verde [GFP], 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), sia manualmente che in modo automatico. Prendendo diverse immagini a intervalli regolarmente distanziati, un montaggio del pozzo possa essere assemblato durante elaborazione dell'immagine (Vedi punto 4).
   Nota: La spaziatura dipende da parecchi fattori, compreso l'ingrandimento, l'ottica del microscopio e le dimensioni del rivelatore. In generale, la spaziatura ottica tra le immagini adiacenti sarà tra 90 – 95% delle dimensioni di ogni immagine, per consentire un certo grado di sovrapposizione di immagine e sono dotate di allineamento.
5. Ripetere questo processo come spesso come richiesto, allineamento per la fiduciaria originale ogni volta. Per l'analisi di sopravvivenza, imaging avviene ogni 6 – 24 h, a seconda del tipo di cella e lo scopo dell'esperimento.

4. image Processing

Nota: A seguito di acquisizione di immagini, una serie di passaggi di elaborazione sono richiesti prima dell'analisi di immagine. Questi includono, ma non sono limitati a, impunture, accatastamento e sottrazione di sfondo (Figura 1). L'obiettivo della procedura è quello di produrre una serie di immagini, o serie temporali, in cui le cellule sono chiaramente distinguibili dal loro background e facile da seguire nel corso di più punti di tempo. Una macro dedicato di FIJI (Image_Processing.ijm, vedere Supplemental File 2), esegue la cucitura base, accatastamento e sottrazione di base. Nella sezione discussione è fornire una spiegazione di ogni passaggio e i parametri da prendere in considerazione durante l'elaborazione di immagine.

1. Regolare i dati grezzi o directory di input per applicare la formattazione illustrato nella Figura 2.
2. Se punti temporali non sono contigui (cioè, T1, T2, T3), rinominare queste cartelle in modo che essi sono. Questo passaggio è fondamentale per garantire che la macro Image_Processing non bloccarsi durante l'impilamento.
3. Fare doppio clic sull'icona del Fiji per aprire il programma, quindi fare clic e trascinare la barra di Fiji la macro Image_Processing . Verrà aperta la macro all'interno di Fiji.
4. Regolare le righe 2-7 della macro Image_Processing per specificare la directory di input contenente immagini, la directory di output desiderato per immagini cucite e impilate, il numero di punti temporali imaging, numero di canali fluorescente e formato del piatto.
5. Determinare l'ordine in cui sono state acquisite le immagini. Per eseguire questo test, cucire manualmente un montaggio di immagini in FIJI manovrando per plugin drop down menu | Impunture | Collezione/grid impunture. Regolare le impostazioni all'interno dei menu a discesa tipo e ordine fino a quando non viene prodotta un'immagine con precisione cucita.
6. Modificare le variabili GRID_TYPE e STITCH_ORDER in linee 8 e 9 della macro Image_Processing per abbinare queste selezioni.
7. Specificare il numero di immagini per pozzetto regolando riga 10 della macro Image_Processing .
   Nota: Per un montaggio di 2 x 2 di immagini, questa linea avrebbe letto DIM = 2.
8. Se è necessaria la sottrazione di sfondo, regolare linea 14 nella macro Image_Processing BGSUB = true.
9. Impostare il raggio di rotolamento sfere regolando linea 15 nella macro Image_Processing .
   Nota: Per risultati ottimali, impostate il raggio su almeno il diametro dell'oggetto in primo piano più grande nell'immagine.
10. Fare clic su Esegui per avviare la macro Image_Processing . Una volta avviato, Image_Processing avanzerà automaticamente attraverso cuciture, accatastamento e sottrazione di sfondo.

5. segnando la morte delle cellule

Nota: Vedere la sezione di discussione per ulteriori informazioni su dati censura e segnando la morte delle cellule.

1. Individuare la serie di immagini prodotte dallo script Image_Processing . Aprire questi in FIJI.
2. Utilizzare il punto strumento all'interno di FIJI per etichettare singolarmente ogni cella con un numero. Premendo t dopo ogni punto aggiungerà l'identificatore di cella con il Manager di ROI (regione d'interesse).
   Nota: Gli identificatori possono essere visualizzati cliccando le caselle di controllo etichette e visualizzare tutto in gestione il ROI.
3. Progresso attraverso i punti temporali in ogni serie di immagini e registrare il timepoint quando ogni cellula muore o ha bisogno di essere censurato nel file Survival_spreadsheet.csv (Vedi File supplementare 3).
   1. Ogni cella che occupa una singola riga nel foglio di calcolo, dove un identificatore univoco (ID) per ogni cella è costituito da suo corrispondente bene e ROI numero all'interno di quel pozzo. tp_death è l'ultimo punto di tempo che una cella è osservata per essere viva, mentre time_death rappresenta il tempo effettivo di morte in ore. Per ogni cella, questi dati di input. È fondamentale per mantenere questa struttura per l'analisi successiva usando sopravvivenza. R (vedere Supplemental File 4).
      Nota: I criteri per determinare la morte delle cellule sono cruciali e possono variare a seconda del tipo di cella. Tre criteri principali sono utilizzati nell'identificazione dei neuroni morti^11,20 (Figura 3): perdita di intensità di fluorescenza (ad es., il neurone 1 a 69 h), arrotondamento del corpo cellulare (ad esempio, il neurone 2 a 188 h) e la perdita di neuriti l'integrità o blebbing (ad esempio, il neurone 2 a 188 h).
4. Registrare lo stato di censore della cella nell'ultima colonna.
   Nota: Qui, a causa di quella peculiare censura viene gestita da R, censurate celle sono contrassegnate da 0, mentre le cellule senza censure sono contrassegnate da 1. Si noti che tutte le cellule che vivono all'ultimo punto nel tempo sono censurate e pertanto contrassegnate come 0.

6. esecuzione proporzionale di Cox di rischi d'analisi e visualizzazione risultati

1. Se necessario, scaricare R studio presso https://cran.r-project.org/mirrors.html.
2. Aprire R studio e fare doppio clic sull'icona per la sopravvivenza di . R script.
3. Posizionare il cursore sulla linea 2 di sopravvivenza . R e fare clic sul pulsante Esegui nella finestra principale di R studio al fine di caricare la libreria di sopravvivenza.
4. Modificare la riga 5 della sopravvivenza . R script per corrispondere la posizione del file Survival_spreadsheet.csv. Fare clic su Esegui per caricare i dati di sopravvivenza come un dataframe.
5. Evidenziare le linee 8 e 9 e fare clic sul pulsante Esegui nella finestra di console di R studio al fine di eseguire analisi di rischi proporzionali di Cox. Risultati e statistiche di uscita vengono visualizzati nella finestra della console di studio R.
6. Evidenziare linee 12-16 di sopravvivenza . R e premere il pulsante di esecuzione al fine di produrre un rischio cumulativo di morte plot, che apparirà nella scheda trame in studio di R. Questo file può essere salvato facendo clic sul pulsante Esporta sopra la trama.
7. Se è auspicabile per tracciare i dati di sopravvivenza come una curva di Kaplan-Meier, evidenziare le righe 19-24 di sopravvivenza . R e premere il pulsante Esegui .

Risultati

Utilizzando la procedura di trasfezione descritta qui, neuroni corticali del ratto di DIV4 transfected con un plasmide che codifica la proteina fluorescente mApple. A partire dal post-transfezione 24h, cellule erano imaged da microscopia di fluorescenza ogni 24 h per 10 giorni consecutivi. Le immagini risultanti sono state organizzate come indicato in Figura 2, poi cucite, impilate e ha segnate per la morte delle cellule (Figura 1

Discussione

Qui, è presentata una metodologia per monitorare direttamente la sopravvivenza di un neurone su base cella singola. Contrariamente ai tradizionali saggi per la morte delle cellule che sono limitati a intervalli di tempo discreti e intere popolazioni delle cellule, questo metodo consente la valutazione continua di una varietà di fattori quali la morfologia cellulare, l'espressione della proteina o localizzazione, e possibile determinare come ciascun fattore influenza la sopravvivenza cellulare in modo prospettico.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12863
Magnesium chloride Hexahydrate	Sigma	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
Poly D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 supplement	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
96 well plates	TPP	0876