Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes-מתווכת טרנספורמציה של תפוחי אדמה, יזם פעילות של גן Suberin על ידי גאס Staining

Summary

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים להפוך את תפוחי האדמה צמחים. הטרנספורמציה Agrobacterium tumefaciens מוביל צמח מהונדס מלאה בעוד Agrobacterium rhizogenes מייצרת הטרנסגניים שורשים שעירים יורה פראי סוג זה יכול להיות עצמי שעבר בירושה. אנחנו מכן לזהות יזם פעילות על-ידי גאס צביעת שורשים טרנספורמציה.

Abstract

Agrobacterium sp. הוא אחד מהשיטות הנפוצה ביותר כדי להשיג את הצמחים הטרנסגניים כפי זה יש את היכולת להעביר ולשלב משלו-T-DNA הגנום של הצמח. כאן, אנו מציגים שתי מערכות טרנספורמציה לשינוי גנטית צמחים תפוחי אדמה (סולנום יכולת להתקשר אלי). בשינוי tumefaciens א , עלים נגועים, התאים טרנספורמציה נבחרו, מפעל חדש טרנספורמציה מוחלטת נוצר מחדש באמצעות phytohormones ב- 18 שבועות. בשינוי rhizogenes א , נובעת נגועים על ידי הזרקת החיידקים עם מחט, חדשים המתגלים טרנספורמציה שעיר השורשים מזוהים באמצעות סמן ניאון אדום, השורשים הלא-טרנספורמציה יוסרו. ב- 5-6 שבועות, המפעל וכתוצאה מכך הוא שילוב של צילומים פראי סוג עם שורשים שעירים טרנספורמציה מפותחת. להגברת ביומסה, שורשים שעירים טרנספורמציה יכול להיות טוחנות, מופצות עצמית. אנחנו מוחלים הן Agrobacterium -מתווכת שינוי שיטות להשגת שורשים לבטא את גן מדווח גאס מונחה על ידי יזם ג'ין biosynthetic הוחלף נגזר suberin. ההליך מכתימים גאס מסופק ומאפשר תא לוקליזציה של אינדוקציה יזם. שתי השיטות, הראו השורשים תפוחי אדמה טרנספורמציה מכתים suberized endodermis, exodermis, ובנוסף, בשורשים rhizogenes א הפכה הפעילות גאס גאס זוהה גם הופעתה של השורשים הצדדיים. תוצאות אלו מראים כי rhizogenes א יכול להיות כלי אלטרנטיבי מהר ללמוד הגנים מבוטאים שורשים.

Introduction

מלבד האינטרס הכלכלי, הדור של הצמחים הטרנסגניים כולל הרלוונטיות שלה במחקר כדי להדגים את הפונקציה האולטימטיבי של גנים, להבין טוב יותר את פיזיולוגיה של הצמח ופיתוח. הנפוצים ביותר שיטה עבור צמח DNA ההכנסה הוא Agrobacterium-מתווכת טרנספורמציה. Agrobacterium tumefaciens הוא מסוגל לייצר עפצים הכתר הרקמה הנגועה מיני צמחים רבים על ידי הפעולה של שלה פלסמיד (Ti) בתדר הגידול. פלסמיד מכיל אזור T-DNA עם קבוצה של גנים אשר ניתן לשלב הגנום צמח, זירוז רקמת dedifferentiation^1,2. ההחלפה של גנים אלה בתוך T-DNA על ידי transgene אפשרה את הדור של שינויים צמח מסוים הימנעות אפקטים פנוטיפי³. כדי להקל את transgene שיבוט לתוך T-DNA, האזור T-DNA יש כבר חתכתם ב פלסמיד עצמאי הנקרא פלסמיד בינארי, בעוד ששאר הגנים של פלסמיד Ti (הגנים התקפה אלימה לאפשר את מנגנוני העברת והוספה של T-DNA) היה להציב אותם פלסמיד המסייע. לחקר הביוטכנולוגיה צמח, שינוי על-ידי tumefaciens א יש מספר יתרונות: זה אינו צריך מכשירים יקרים, הוא מסוגל לייצר טרנספורמציה צמח ארעית ויציבה, והן מספר נמוך של ג'ין עותקים משולבים כרומוזום⁴. עם זאת, רוב הצמחים, אבל לא תודרנית, הדור של transformants יציב דורשת התחדשות הצמח בודד או מספר תאים באמצעות phytohormones אקסוגני, ביצוע תהליך זה מפרך וצורכת זמן. Rhizogenes א הוא גם מסוגל לשנות את הגנום צמח, בהפקת שורשים שעירים או שורשים adventitious באתרים זיהום עקב הביטוי של גנים rol ( לוקוסיםכבסיס) המקודדת בתדר שורש (Ri) פלסמיד⁵. למרות פחות למד יותר tumefaciens א, א rhizogenes משמש גם לקבלת הטרנסגניים שורשים. במקרה זה, rhizogenes א מכיל את המקורי T-DNA על פלסמיד רי ו פלסמיד בינארי עם השנייה T-DNA נושא את transgene. כאשר האתר זיהום גבעולים או hypocotyls, צמח מורכב ניתן להשיג, עם שורשים חדשים שעיר הטרנסגניים הבוקע פראי סוג יורה. לחלופין, שורשים טרנספורמציה שעיר יכול לגדול באופן עצמאי במבחנה בתקשורת עם כניסות מקור פחמן. השימוש rhizogenes א במקום tumefaciens א כדי לייצר רקמות הטרנסגניים הוא צובר רלוונטיות כאשר הבסיס הוא איבר המטרה, כי התחדשות הצמח לא נדרש, מכאן זה יותר מהר ויקרות פחות. מחקרים קודמים הדגימו מתודולוגיה זו הופקעו עבור אפיון פנוטיפי שורש גנים ספציפיים^6,7,8,9.

תפוחי האדמה (יכולת להתקשר אלי סולנום) הוא היבול הרביעי החשוב ביותר בעולם על פי המזון והחקלאות של האו ם (FAO) מאז פקעת יש רלוונטיות התזונתיות לצריכה אנושית על היותך מקור טוב של ויטמינים ומינרלים. מסיבה זו, תפוחי אדמה מוקם באור הזרקורים של ביוטכנולוגיה חקלאית, ונחשב גם כמו מודל ביולוגיים גנטיים, התפתחותית מחקרים^10,11. תפוחי אדמה טרנספורמציה תרמה בצורה משמעותית להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס הרקמות suberized דרך אפיון גנים המעורבים suberin, שעווה ביוסינטזה^{12,13,14 ,15,16,17}, suberin מונומר התחבורה¹⁸ ו שעתוק בתקנה¹⁹. Suberin feruloyl טרנספראז הגן, לריב, הוא אחד הגנים biosynthetic הוחלף נגזר מאופיין האלה; downregulation שלה מעורר ליקוי חזקה של ההגנה periderm, אשר הוא מתואם עם ירידה חזקה אסטרים ferulate של suberin, שעוות פקעות תפו א¹⁴. / ת, שורשים, זרעים של תודרנית, הסתרה באמצעות של שלו בשם orthologue (ASFT/RWP1) הפגינו גם תפקידה בהפקת אלקיל ferulates^20,suberin²¹. תפוחי אדמה, הקו כתב תעתיק לריב , הנוגדן לריב הראה בהתאמה כי הפעילות יזם החלבון נמצאים את exodermis, endodermis, phellogen-הנגזרים, רקמות הפצועים¹⁵.

בעבודה זו, אנחנו פירוט נוהל באמצעות rhizogenes א כדי לייצר שורשים שעירים הטרנסגניים נשמרים ביורה פראי סוג, תפוחי אדמה ללא הפרדות צבע מפעלים לייצור או טוחנות לגדול באופן עצמאי בתוך חוץ גופית. אנו מספקים גם את הפרוטוקול באמצעות tumefaciens א כדי לקבל תפוחי אדמה הטרנסגניים מלאה צמחים. כמקרה, rhizogenes א tumefaciens א טרנספורמציה עם וקטור בינארי זהה משמשים להשגת שורשים עם האמרגן לריב נהיגה גאס כתב גנים. התוצאות שדווחו, בהשוואה.

Protocol

פרוטוקול טרנספורמציה rhizogenes א הותאם ושינית קרן ואח⁷ והיה גנוטיפ נבדק ssp יכולת להתקשר אלי ס . יכולת להתקשר אלי (cv. דזירה). פרוטוקול טרנספורמציה tumefaciens א היה הותאם שונה בנרג'י ואח²² ו אחרים שנבדקו היו יכולת להתקשר אלי ס ssp. יכולת להתקשר אלי (cv. דזירה) ואת יכולת להתקשר אלי ס ה-ssp andigena. השלבים העיקריים של נהלים לשתיהן מסוכמות באיור 1 ו- 2 איור, בהתאמה.

הערה: כל השלבים של ההליך ביצוע העברות במבחנה , לעשות זאת במהירות, במידת האפשר, לתחזק את צלחות או סירים סגור, ובכך לחסוך צמח חשיפה לאוויר כדי להימנע כמישה וזיהום. צוין אחרת, כל incubations הצמח נעשו בו ארונות בתנאים של 12 שעות של 24 ° C h אור/12 של 20 ° C כהה, 67 µmol ז^-1 s^-1. צוין אחרת, לבצע כל החיידקים במחרוזות, במבחנה צמח ההעברות aseptic בתנאי תא למינארי. כל שאר המתכונים מדיה עבור Agrobacterium במבחנה צמח תרבויות ניתנים שולחן S1.

התראה: להפקיד כל חיידקים מהונדסים, צמחים לגורם פסולת הופקעו.

1. Agrobacterium תרבויות המשמש לשינוי

הערה: המתח המשמש לשינוי א rhizogenes C58C1:Pri1583⁷ (באדיבות שסופק על-ידי ד ר ברואר Inge) וזה עבור tumefaciens א היה GV2260 (לנוחיותנו מאת ד ר Salomé Prat). Rhizogenes א הפך עם וקטור בינארי PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-המחלקה לביולוגיה מערכות צמח Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) המכילה של T-DNA נושא סמן שינוי כדי לנטר את השורש שעיר צורה. כדי להשוות את השורשים טרנספורמציה שנוצר על ידי rhizogenes א tumefaciens א, הן נהפכו עם pKGWFS7 וקטור בינארי המכיל את T-DNA נושא ייצוג המקדם לריב נהיגה הגן β-glucoronidase (גאס) כתב הגן ההתנגדות Kanamycin סמן לבחירה¹⁵.

1. לבחור מושבה של Agrobacterium , לגדל את זה בן לילה (O/N) ב 5 מ של בינוני YEB בתוספת אנטיביוטיקה (טבלה S1) בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל- 28 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
2. לטרנספורמציה tumefaciens א , למדוד את הצפיפות האופטית, אשר חייב להיות OD₆₀₀ = 0.6-1.0.
   1. אם הצפיפות האופטית גבוהה, לעשות שתרבות הורדתו כדי OD₆₀₀ = 0.3 עם מדיה טריים ולחכות עד התרבות מגיע OD₆₀₀ = 0.6-1.
3. צנטריפוגה 1 מ"ל של תרבות Agrobacterium ב x 3000 g ומפרידה ספסל-top 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הסר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting, resuspend תאים 1 מ"ל של מדיום YEB טריים ללא אנטיביוטיקה. חזור על שלב זה כדי להבטיח הסרה מלאה של אנטיביוטיקה.
   1. לטרנספורמציה tumefaciens א , ב- resuspension האחרון להוסיף האחסון YEB המתאים כדי להשיג צפיפות אופטית הסופי של יתר₆₀₀ = 0.8.
5. לשמור תאים על הקרח תוך הכנת הצמחים כדי להיות נגוע.

2. לשתול חומר לשינוי

1. להפוך את אחד או שניים צומת גזע ייחורים המכיל גם הפסגה או בלוטות עזר מצמחים סטרילי במבחנה תפוחי אדמה (התורם צמחים); לגדל אותם במדיום מוצק 2 אלפיות השנייה בעציצים במשך 3 עד 4 שבועות (איור 1A ואיור 2A).

3. הצמח טרנספורמציה באמצעות rhizogenes א (איור 1)

הערה: הליך זה מאפשר קבלת של טרנספורמציה שורשים שעירים. להעריך את הביטוי transgene, דרוש פקד שלילי. כדי להכין את הפקד שלילי, בצע את ההליך באמצעות זן rhizogenes א untransformed או טרנספורמציה עם הווקטור ריק הכולל את הגן סמן טרנספורמציה.

1. השתמש לוחות מדיה טריים; לחלופין, הלוחות ניתן לשמור ב 4 ° C עם הצד המכסה, אטומה בחוזקה עם סרט שקוף למניעת התייבשות מדיה. כדי להכין את הצלחות מדיה מרובע, שיפוע אותם ~ 15°, מילוי עם 40 מ של MS, ולתת להם לחזק. זה יצמצם את איש הקשר של החלק אווירי של הצמח עם המדיום.
2. להעביר בזהירות רבה צמח התורם של המדיום 2 אלפיות השנייה צלחת 120 מ"מ x 120 מ"מ מרובע.
3. להזריק את גזע אחד internode 3 μL של התרבות rhizogenes א באמצעות מחט כירורגית ויש לחזור על זה פעמיים לכל צמח בפרקי הגבעולים שונים במידת האפשר.
   הערה: לשקול כל זריקה כאירוע טרנספורמציה עצמאית (איור 1B).
4. להעביר מיד את הצמח כולו צלחת מרובעת בינונית MS מוצק בתוספת acetosyringone 0.1 מ מ. להכיל צמחים 2 לכל צלחת.
   הערה: הפתרון 1 מ' מניות acetosyringone מוכן ב דימתיל סולפוקסיד, שניתן לאחסן ב-20 ° C.
5. לאטום את הצלחת באמצעות הדבקה, לארגן אותו אנכית בתוך ארון גידול במשך 4 ימים.
6. להעביר את הצמח צלחת מרובע חדש MS בינונית עם נתרן cefotaxime [500 µg/mL] להרוג rhizogenes א.
7. לאחר 10-12 ימים, שורשים שעירים יתחילו להופיע (איור 1C,ד 1). לאחר מכן, לסלק את שורשי הצמח מקורית, להעביר את הצמח צלחת מרובע חדש MS בינונית עם נתרן cefotaxime [500 µg/mL].
   הערה: שורשים שעירים טרנספורמציה ניתן לבדוק על ידי פלואורסצנטי אדום בעת שימוש בסמן שינוי DsRed (דמות תלת-ממד).
8. כדי להשיג צמח ללא הפרדות צבע (איור 1E), תן את השורשים שעיר הטרנסגניים לגדול במשך 3-4 שבועות ב MS בינוני עם נתרן cefotaxime [500 μg/mL] (לשנות המדיום כל שבוע).
9. בהתאם למטרה, להפיץ את השורשים שעיר הטרנסגניים והפקדים שלילי כדלקמן.
   1. העברת המפעל כולו מורכב הידרופוני (טבלה S2) או אדמה בינוני כדי לאפשר פיתוח מאסיבי.
   2. להפיץ בנפרד את השורשים שעיר טרנספורמציה, באמצעות אזמל לחתוך את השורשים לבטא את סמן אדום טרנספורמציה פלורסנט (חלבון DsRed) כאשר הם 4 – 8 ס"מ (איור 1E), להעביר אותם לתוך צלחת פטרי בינונית מוצק Gamborg B5 בתוספת 2% סוכרוז, cefotaxime נתרן [500 μg/mL]. חותם הצלחות עם מעבדה פלסטיק הסרט ואגדל אותם בחושך ב 20 º C.
      הערה: ניתן לטפל בשורשים תחת stereomicroscope מצויד כדי לזהות את פלורסצנטיות בתנאים סטריליים (ראה טבלה של חומרים).
   3. לייצור ביומסה (קרי, ניתוח ביטוי של גנים), לחתוך שורש הארוכה והשעירה נגעה 5 ס"מ ו להפיץ אותה ב 150 מ Erlenmeyer את הבקבוק עם 20 מ של Gamborg B5 בינוני נוזלי בתוספת 2% סוכרוז, cefotaxime נתרן [500 µg/mL]. לגדל את זה 6 שבועות בחושך-20 ° C ו- 60 סל ד.

איור 1: ציר הזמן כדי לקבל תפוחי אדמה הטרנסגניים שורשים שעירים באמצעות א rhizogenes. השבועות המצטבר כדי להגיע בכל שלב של תהליך שינוי, והשלבים הבאים לצמוח שורשים שעירים מוצגים. להחליפן בתמונות של שלבים שונים מתוארים: אתחול של התהליך באמצעות בת שבוע-3 במבחנה צמחים (A), ואז זיהום של הצמחים על ידי הזרקת rhizogenes א (B), היווצרות שגשוג רקמה (C, חצים) עם שורשים שעירים המתעוררים (D), שורשים שעירים מפותחת לבטא את סמן אדום טרנספורמציה פלורסנט DsRed (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. הצמח טרנספורמציה באמצעות tumefaciens א (איור 2)

הערה: הליך זה מאפשר קבלת של צמחים טרנספורמציה. כדי להעריך את ההשפעה של transgene, דרוש פקד שלילי. אפשרות אחת היא ללכת בעקבות ההליך משתמש של tumefaciens א טרנספורמציה עם הווקטור ריק. לחלופין, ניתן להשתמש פראי סוג צמחים.

1. לחתוך ומניחים עלה מצמחים 3-4-בת שבוע (איור 2 א) בצלחת פטרי. באמצעות אזמל לא לכלול הפטוטרת, לבצע קיצוץ רוחבי (1-3 תלוי בגודל העלה) במרכז העלה הקצוות הימנעות לניתוקם (איור 2B).
2. מיד למקם העלה צף על 10 מ"ל של 2 אלפיות השנייה טריים נוזל מדיית בצלוחית עם הצד abaxial למעלה, ולסגור את הצלחת. חזור על השלב אדיב עד 15 יוצא cv. דזירה ומשאיר 25 עבור ה-sspndigena (תלוי בגודל העלה).
3. מיד להוסיף 80 µL התרבות tumefaciens א -OD₆₀₀ = 0.8 בתקשורת נוזלי, homogenize את הצלחת באופן ידני עבור 1 דקות להפיץ את הפתרון חיידקי.
4. בזהירות חותם עם איטום הסרט, מכסים ברדיד אלומיניום, תקופת דגירה של 2 ימים בחדר ב 24 ° C כדי לאפשר את השינוי להתרחש.
5. להעביר את העלים שומרים בצד abaxial עד בינוני CIM (איור 2B), דגירה אותם במשך שבוע אחד על גידול בארון.
   1. לגרד את המדיום CIM עם הפינצטה כך העלים ניתן לאכלס יותר באמצעי התקשורת.
6. להעביר את העלים שומרים בצד abaxial עד ה-SIM בינוני (איור 2C), דגירה אותם בגידול cabinet, מרעננים המדיום כל 7-10 ימים, עד יורה בערך 2 ס מ גבוה.
   1. לגרד את המדיום SIM עם הפינצטה כך העלים יהיה מוקף באופן מלא ע י התקשורת. כאשר נצרי המתגלים להגיע את המכסה, לעבוד עם צלחות פטרי גבוה (100 x 20 מ מ, גובה x קוטר).
      הערה: קסם יהוו לאחר 2-3 שבועות ב- SIM בינוני (איור דו-ממדי) ויורה אחרי 6-7 שבועות (2E איור). נצרי ייחשבו אירועים טרנספורמציה עצמאי כאשר הם מגיחים קסם נוצר הפצעים עצמאית.
7. לחתוך שלוש יורה המתגלים בין כל קסם (נחשב לאותו אירוע טרנספורמציה) (איור 2E), העברת להם תרבות מבחנות בינונית מ"ג בתוספת cefotaxime נתרן [250 mg/L] כדי לאפשר השתרשות, תווית המשנה עם מספר, דגירה ב גידול בארון במשך 3-4 שבועות או עד נצרי נמרצת (2F איור).
   הערה: כאשר אתה מבתר את יורה, להסיר גם את קסם אחרת שלא יהוו הבסיס.
   1. חזור על השלב כמה שיותר פעמים הקווים עצמאי יש צורך. עד 5 טרנספורמציה שונים ניתן למקם אירועים בבקבוקון תרבות בקוטר של 8 ס מ לעבוד בביטחון מלא כי הצמחים מאירועים שונים לא מעורבבים.
8. בחר הצמח נמרצת ביותר של כל אירוע, לחתוך את הקטע הפסגה של הצילומים עם 3-4 פרקי הגבעולים ומניחים אותו בבקבוקון תרבות חדשה בינונית 2 אלפיות השנייה בתוספת cefotaxime נתרן [250 mg/L].
   הערה: 3-6 שבועות שהצמח יגדל בצורה יעילה, פיתוח לצלם נמרצת ושורשים.
   1. להחזיר לחדר את יורה שלא נבחרו עד הצמח שנבחר פיתחה באופן מלא.
9. לחתוך קטעים גזע מהמפעל עם internode אחד לפחות או עם ניצן הפסגה ולהעביר אותם למדיום חדש 2 אלפיות השנייה, בתוספת cefotaxime [250 mg/L]. דגירה אותם בבית הגידול בארון.
   1. לשכפל כל 3-4 שבועות להקים את הקווים במבחנה טרנספורמציה.
      הערה: נתרן cefotaxime נדרש לפחות שלוש העברות עוקבות למדיום 2 אלפיות השנייה כדי להיות בטוח כדי להרוג את tumefaciens א; לאחר מכן, אם נצפית overgrowth tumefaciens א , להעביר את הצמחים שוב למדיה 2 אלפיות השנייה, בתוספת cefotaxime נתרן.
10. כדי לאפיין את הצמח פנוטיפ, העברת צמחים קרקע שלהם אפיון מלא או לתרבות הידרופוניקה לבדיקה שורש.
    1. שמור את פקעות המיוצר בקרקע להפיץ ולשמור על הקווים הוקמה.

איור 2: ציר הזמן כדי להשיג את תפוחי האדמה הפכה צמחים באמצעות א tumefaciens. השבועות המצטבר כדי להגיע בכל שלב של תהליך שינוי, והשלבים הבאים כדי לגדל את הצמחים מוצגים. להחליפן בתמונות של שלבים שונים מתוארים: אתחול של התהליך באמצעות עלים מצמחים 3 - בן שבועיים במבחנה (), העברת הפצועים ואת נגוע עלים למדיה CIM (B), העלים כאשר הועבר SIM מדיה (C), את החזיית קסם סביב האזורים הפצועים לאחר 2-3 שבועות ב SIM מדיה (D), היווצרות לירות אחרי 9-11 שבועות בתקשורת SIM (E), ויורה את לאחר שהועבר למדיה MG (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

5. הידרופוני תרבות

1. להכין הפתרון של הוגלנד חצי כוח (0.5 x) (טבלה S2) בתוך דלי 10 L.
2. לטבול משאבת אקווריום כדי לשמור על הומוגניות ותנאי מספיק חמצן.
3. לכסות את הקירות של הדלי עם רדיד אלומיניום לצמוח שורשים בתנאי כהה.
4. הימנעות נזק הבסיס, להעביר במבחנה צמחי תרבות הידרופוני.
   הערה: הסר בינוני כל במבחנה הנותרים שורשים כדי למנוע התפשטות מיקרואורגניזם במהלך הדגירה ע י ניעור בקפידה את השורשים הושקע במים.
5. לכסות את הצמחים עם סרט שקוף כמו החממה כדי לאפשר הסתגלות נאותה דגירה בבית הבליעה הולך וגדל.
6. לחורר הסרט לאחר 3 ימים ולהסיר אותו לחלוטין שבוע אחד לאחר.
7. החלף מדיה טריים כל עשרה ימים.

6. גאס כתב פתולוגיה ג'ין assay

הערה: במקרה שלנו גאס ניתוח בוצע עם שורשים של 2-3 שבועות גדלו ב הידרופוניקה או בתוך חוץ גופית.

1. לתקן את השורשים עם אצטון 90% מקורר (v/v), דגירה זה במשך 20 דקות על קרח.
2. לבצע שתי מכונות שטיפה עם מים מזוקקים.
3. להוסיף גאס טריים מכתים פתרון (טבלה 1) ולהחיל ואקום (-70 הרשות הפלסטינית) במשך 20 דקות.
4. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך כדי להגן על גאס פוטוסנסיטיבית במשך 4 שעות או עד צבע כחול יהיה גלוי.
   הערה: הנוכחות של פרי, ferrocyanide בתמיסה גאס למזער פעפוע של התגובה מוצרים, מספקים לוקליזציה מדויקת יותר.
   התראה: שימוש ברדס fume, ללבוש ביגוד מגן בעת טיפול את רעל הציאניד נגזרים בפתרון גאס (אשלגן ferricyanide ו- ferrocyanide אשלגן). המצע גאס, סילוק החומר צריך להיות מסולק בבטחה.
5. להסיר את גאס מכתים פתרון וזורקים אותו במיכלים מתאימים.
6. לבצע שתי כביסות עם אתנול 70% (v/v).
7. להתבונן במיקרוסקופ שדה בהיר.
   הערה: גאס מכתים יציב במשך כמה שבועות; עם זאת, במהלך השבוע הראשון, האות גאס ברור, מפזרת פחות לתוך תאים שכנים. לאחסון ארוך יותר, לאטום את הצינור ואחסן אותו ב 4 º C.

טבלה 1: מתכון פתרון מכתימים. גאס.

תוצאות

Agrobacterium rhizogenes -מתווכת תפוחי אדמה טרנספורמציה

כתב יד זה, מוצג התהליך צעד אחר צעד כדי להשיג root טרנספורמציה עם rhizogenes א . איור 1 מציג סקירה של ההליך, אשר בסך הכל לוקח כ 5-6 שבועות (מתוך הזרקה של rhizogenes ?...

Discussion

תפוחי אדמה, המערכת השכיחה ביותר להשגת יציבה הצמחים הטרנסגניים מלאה משתמשת הטרנספורמציה על ידי זנים Agrobacterium tumefaciens הדורשים organogenesis באמצעות phytohormones אקסוגני. למרות שהפרוטוקולים Agrobacterium מבוסס יש פוטנציאל להשתלב וקטור הלא-T-DNA רצף²⁵, מתודולוגיה זו זמינה עדיין הכי קל ופחות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Panreac	1.310.071.21
Acetosyringone	Acros	115540050
Aquarium pump	Prodac	MP350
Autoclave	Ragpa Strelimatic
Bacteriological agar	Lab Conda	1800
BAP	Duchefa	B0904
Beef extract	Lab Conda	1700
Plant growing cabinet	Nuaire
Carbenicillin	Duchefa	C0109
Cefotaxime sodium	Duchefa	C0111
DMSO	Merck	1029310161
Ecotron infors	HT	29378
Ethanol	Merck	1,009,831,011
Falcon tube	Control tecnica	CFT011500
Ferricyanate	Sigma	101001081
Ferrocyanate	Sigma	100979088
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture	Apiglass	ref16
GA3	Sigma	G7645
Gamborg B5 media	Duchefa	G0210
Gelrite	Duchefa	G1101
Glucosa	Sigma	G5767
Kanamycin	Sigma	K1377
Leukopor tape	BSN Leukopor	BDF47467
Lupe	Wild-Heerbrugg	M420
Magnetic shaker	Agimatic	7000243
MES hydrate	Sigma	M2933-25G
MgSO4	Panreac	131404
Microscope	Olympus
Minufugue centrifugue 5415R	Eppendorf
Murashige and Skoog media	Duchefa	M0254.0050
Na2HPO4	Panreac	131679
NAA	Duchefa	N0903
NaCl	Panreac	131659
NaH2PO4	Sigma	58282
NightSea Stereo	SFA Moonting Adapter
Parafilm	Anorsa	PRFL-001-001
Peptone	Lab Conda	1616
Petri dishes (90 x 14)	Anorsa	200200
pHmetre	Crison
Phytotron	Inkoa	RFTI-R5485
Plant Agar	Duchefa	P1001
Refrigeratot	Liebherr Medline
Rifampicin	Duchefa	R0146
Spectinomycin	Sigma	59007
Spectrophotometer	Shimadzu
Square plates (120 x 120)	Deltalab	200204
Streptomycin	Sigma	S6501
Sucrose	Panreac	131621
Surgical blades	Swann-Morton	201
Surgical needle	NIPRO	015/0204
Triptone	Lab Conda	1612
Triton	Serva	37240
Unimax 1010 shaker	Heidolph
Vacuum	Dinko
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)	Biosynth	B-7398
Yeast extract	Lab Conda	1702.00
Zeatin riboside	Sigma	1001042850