Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-mediata trasformazione di patate e l'attività del promotore di un Gene di suberina da GUS Staining

Riepilogo

Qui, presentiamo due protocolli per trasformare piante di patate. La trasformazione di Agrobacterium tumefaciens conduce ad una pianta transgenica completa mentre l' Agrobacterium rhizogenes produce radici transgeniche pelosi in un tiro di tipo selvatico che può essere auto-propagato. Individuiamo quindi l'attività del promotore di GUS colorazione nelle radici trasformate.

Abstract

Agrobacterium SP. è uno dei metodi più diffusi per ottenere piante transgeniche in quanto ha la capacità di trasferire e integrare la propria T-DNA nel genoma della pianta. Qui, presentiamo due sistemi di trasformazione per modificare geneticamente le piante di patata (Solanum tuberosum). Nella trasformazione di a. tumefaciens , foglie sono infetti, le cellule trasformate sono selezionate e un nuovo impianto completo trasformato viene rigenerato utilizzando fitormoni in 18 settimane. Nella trasformazione di a. rhizogenes , steli sono infettati iniettando i batteri con un ago, le nuove radici pelosi trasformate emerse vengono rilevate utilizzando un marcatore fluorescente rosso e le radici non trasformate vengono rimossi. In 5-6 settimane, la pianta risultante è un composito di un germoglio di tipo selvaggio con radici pelosi trasformate completamente sviluppate. Per aumentare la biomassa, le radici di pelosi trasformate possono essere asportate e self-propagate. Abbiamo applicato entrambi metodi di trasformazione dell'agrobatterio -mediata per ottenere radici che esprimono il gene reporter GUS guidato da un promotore del gene biosintetici suberina. La procedura di colorazione di GUS è fornita e permette la localizzazione cellulare dell'induzione promotore. In entrambi i metodi, le radici di patata trasformata ha mostrato macchiatura nella quali endodermis ed exodermis e inoltre, nelle radici di a. rhizogenes trasformato l'attività GUS GUS inoltre è stato rilevato nell'emersione di radici laterali. Questi risultati suggeriscono che a. rhizogenes può essere uno strumento veloce alternativo per studiare i geni che sono espressi nelle radici.

Introduzione

A parte di interesse economico, la generazione di piante transgeniche ha una propria rilevanza nella ricerca per dimostrare la funzione dei geni e capire meglio la fisiologia vegetale e sviluppo. Il più diffuso metodo per pianta inserimento del DNA è Agrobacterium-mediata trasformazione. Agrobacterium tumefaciens è in grado di generare corona Galle nel tessuto infetto di molte specie vegetali dall'azione del suo tumore-induzione plasmide (Ti). Il plasmide contiene una regione T-DNA con un set di geni che sarà integrato nel genoma della pianta e indurre il tessuto dedifferenziazione^1,2. Lo scambio di questi geni all'interno del T-DNA di transgene ha permesso la generazione di modifiche specifiche impianto evitando effetti fenotipici³. Per facilitare il transgene clonazione nel T-DNA, regione del T-DNA è stata asportata in un plasmide indipendente chiamato un plasmide binario, mentre il resto dei geni del plasmide Ti (i geni di virulenza che consentono i meccanismi di trasferimento e inserimento di T-DNA) sono stati collocato in un plasmide helper. Per ricerca di biotecnologia della pianta, trasformazione di a. tumefaciens ha diversi vantaggi: essa non ha bisogno di costosi dispositivi, è in grado di generare sia trasformazione in pianta stabile e transitoria e basso numero di copie sono integrate nel gene la cromosoma⁴. Tuttavia, per la maggior parte delle piante, ma non, di Arabidopsis la generazione di trasformanti stabile richiede la rigenerazione della pianta da una sola o poche cellule utilizzando esogeni fitormoni, rendendo questo processo laborioso e che richiede tempo. A. rhizogenes è anche in grado di modificare il genoma della pianta, producendo radici pelosi o radici avventizie presso i siti di infezione a causa dell'espressione dei geni rol (radice loci) codificato in radice-induzione (Ri) plasmide⁵. Anche se meno studiata rispetto a. tumefaciens, a. rhizogenes è utilizzato anche per ottenere radici transgeniche. In questo caso, a. rhizogenes contiene l'originale T-DNA nel plasmide Ri e un plasmide binario con un secondo T-DNA che trasportano il transgene. Quando il sito di infezione è in fusti o ipocotili, una pianta composita può essere ottenuta, con nuove radici transgeniche pelosi emergenti dai germogli di tipo selvaggio. In alternativa, pelosa radici trasformate possono crescere autonomamente in vitro nei media con ingressi sorgente di carbonio. L'uso di a. rhizogenes invece di a. tumefaciens per produrre tessuti transgenici sta guadagnando importanza quando la radice è l'organo bersaglio, perché pianta rigenerazione non è necessaria e quindi è più veloce e meno costoso. Gli studi precedenti hanno dimostrato questa metodologia ha stanziata per la caratterizzazione fenotipica di radice specifici geni^6,7,8,9.

La patata (Solanum tuberosum) è il quarto più importanti delle colture del mondo secondo la Food and Agriculture Organization delle Nazioni Unite (FAO) poiché il tubero ha rilevanza nutrizionale destinati al consumo umano per essere una buona fonte di vitamine e minerali. Per questo motivo, patata è stata posta sotto i riflettori di biotecnologia agricola e inoltre è considerata come un buon modello biologico per genetica ed evolutiva Studi^10,11. Trasformazione di patate ha contribuito significativamente alla comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti quali tessuti attraverso la caratterizzazione di geni coinvolti nella Suberina e cera biosintesi^{12,13,14 ,15,16,17}, Suberina monomero trasporto¹⁸ e trascrizione regolamento¹⁹. Il gene della transferasi feruloil suberina, FHT, è uno di questi geni biosintetici caratterizzati; la downregulation dà luogo ad un danno forte della protezione del periderma, che è correlata con una diminuzione forte in miscela di etanolo esteri di Suberina e cere di tuberi di patata¹⁴. In concomitanza, nelle radici e semi di Arabidopsis, il Ko di suo putativo ortologo (Massimo/RWP1) inoltre ha dimostrato suo ruolo nella produzione di alchil ferulates in suberina^20,21. Patata, la linea di transcriptional reporter FHT e l'anticorpo FHT hanno mostrato rispettivamente che l'attività del promotore e le proteine si trovano in exodermis, endodermis, i phellogen-derivati e in tessuti feriti¹⁵.

In questo lavoro, dettagliamo un protocollo utilizzando a. rhizogenes per produrre transgeniche radici pelosi che sono mantenute in un tiro di tipo selvaggio, generazione di piante di patate composito o asportato per crescere autonomamente in vitro. Forniamo anche il protocollo utilizza a. tumefaciens per ottenere piante di patate transgeniche completa. Come caso di studio, a. rhizogenes e a. tumefaciens trasformato con lo stesso vettore binario sono utilizzati per ottenere le radici con il promotore FHT Guida di espressione del gene reporter GUS . I risultati sono segnalati e rispetto.

Protocollo

Il protocollo di trasformazione a. rhizogenes è stato adattato e modificato da corno et al.⁷ e il genotipo testato era S. tuberosum ssp. tuberosum (c.v. Désirée). Il protocollo di trasformazione a. tumefaciens è stato adattato e modificato da Bono et al.²² e i genotipi testati erano S. tuberosum ssp. tuberosum (c.v. Désirée) e S. tuberosum SSP. andigena. Le fasi principali di entrambe le procedure sono riassunti nella Figura 1 e figura 2, rispettivamente.

Nota: In tutte le fasi della procedura di esecuzione in vitro trasferimenti, farlo rapidamente e quando possibile, mantenere le piastre o vasi chiusi, riducendo così al minimo pianta esposizione all'aria per evitare l'avvizzimento e contaminazione. Diversamente indicato, tutte le incubazioni di pianta sono state fatte in armadi nelle condizioni di 12h di 24 ° C luce/12 h di 20 ° C scuro e 67 µmol m^-1 s^-1. Altrimenti, eseguire tutti i batteri manipolazione e in vitro pianta trasferimenti in condizioni asettiche in cappa a flusso laminare. Tutte le ricette di media per Agrobacterium e in vitro di colture vegetali sono fornite in Tabella S1.

Attenzione: Deposito di tutti i batteri geneticamente modificati e le piante per il contenitore di raccolta appropriato.

1. culture Agrobacterium usate per la trasformazione

Nota: Il ceppo utilizzato per la trasformazione di a. rhizogenes era la C58C1:Pri1583⁷ (gentilmente fornito da Dr. Inge Broer) e che per la a. tumefaciens era il GV2260 (gentilmente fornito da Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-dipartimento di biologia dei sistemi vegetali presso Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) che contiene un T-DNA che trasportano un marcatore di trasformazione per monitorare la radice pelosa formazione. Per confrontare le radici trasformate generate da a. rhizogenes e a. tumefaciens, entrambi sono stati trasformati con il pKGWFS7 di vettore binario che contiene un T-DNA che trasportano il promotore FHT guida il gene reporter β-glucoronidase (GUS) ed il gene di resistenza alla kanamicina come un marcatore selezionabile¹⁵.

1. Scegli una colonia di Agrobacterium e crescere durante la notte (O/N) in 5 mL di medium YEB completate con gli antibiotici (Tabella S1) in una provetta da centrifuga 50 mL a 28 ° C con agitazione a 200 giri/min.
2. Per la trasformazione di a. tumefaciens , misurare la densità ottica, che deve essere OD₆₀₀ = 0.6-1.0.
   1. Se la densità ottica è più alta, fare una sottocultura abbassandola a OD₆₀₀ = 0.3 con media fresco e aspettare finché raggiunge la cultura OD₆₀₀ = 0,6-1.
3. Centrifugare 1 mL di coltura di Agrobacterium a 3.000 x g in una centrifuga di banco per 10 min a temperatura ambiente.
4. Pipettaggio per rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di mezzo YEB fresco senza antibiotici. Ripetere questo passaggio per garantire la rimozione completa di antibiotici.
   1. Per la trasformazione di a. tumefaciens , nella risospensione ultimo aggiungere il volume appropriato di YEB per ottenere una densità ottica finale di OD₆₀₀ = 0,8.
5. Mantenere le cellule sul ghiaccio durante la preparazione le piante per essere infettati.

2. il materiale vegetale per la trasformazione

1. Fare uno o due nodo talee o contenenti l'apicale o i germogli ausiliari da sterile in vitro patata piante (donatore); farle crescere in mezzo solido 2MS in vasi per 3-4 settimane (Figura 1A e Figura 2A).

3. impianto di trasformazione utilizzando a. rhizogenes (Figura 1)

Nota: Questa procedura permette di ottenere delle radici pelosi trasformate. Per valutare l'espressione del transgene, è necessario un controllo negativo. Per preparare il controllo negativo, seguire la procedura utilizzando un ceppo di a. rhizogenes trasformato o trasformato con il vettore vuoto che include il gene marcatore di trasformazione.

1. Utilizzare mezzi freschi piatti; in alternativa, le piastre possono essere tenute a 4 ° C dal lato del coperchio, ermeticamente sigillate con pellicola trasparente per evitare la disidratazione media. Per preparare i piatti quadrati media, loro inclinazione ~ 15°, riempimento con 40 mL di MS e farli solidificare. Questo ridurrà al minimo il contatto della parte aerea della pianta con il mezzo.
2. Trasferimento molto attentamente una pianta di donatore da 2MS medio a piastra quadrata 120 x 120 mm.
3. Iniettare a uno stelo internodo 3 μL della cultura a. rhizogenes utilizzando un ago chirurgico e ripeterlo due volte per pianta in diversi internodi quando possibile.
   Nota: Considerare ogni iniezione come un evento di trasformazione indipendente (Figura 1B).
4. Trasferire immediatamente l'intera pianta ad una piastra quadrata con tinta MS supplementato con acetosyringone di 0,1 mM. Ospitare 2 piante per piastra.
   Nota: La soluzione di riserva acetosyringone 1m è preparata in DMSO e possa essere conservata a-20 ° C.
5. Sigillare la piastra utilizzando nastro chirurgico e disporre verticalmente all'interno di un armadietto di crescita per 4 giorni.
6. Trasferire la pianta ad una nuova piastra quadrata con MS supplementato con cefotaxime sodium [500 µ g/mL] di uccidere a. rhizogenes.
7. Dopo 10-12 giorni, radici pelosi inizieranno ad apparire (Figura 1,1D). Quindi, asportare le radici native della pianta e trasferire la pianta ad una nuova piastra quadrata con MS supplementato con cefotaxime sodico [500 µ g/mL].
   Nota: Radici pelosi trasformate possono essere controllate da fluorescenza rossa quando usando un pennarello di trasformazione DsRed (Figura 3D).
8. Per ottenere una pianta composita (Figura 1E), lasciare le radici pelosi transgeniche crescere per 3-4 settimane in MS supplementato con cefotaxime sodico [500 μg/mL] (cambiare il mezzo ogni settimana).
9. A seconda dello scopo, propagare le radici pelosi transgeniche e controlli negativi come segue.
   1. Trasferire la pianta intera composita a idroponici (Tabella S2) o medio del terreno per consentire lo sviluppo massiccio.
   2. Per propagare individualmente le radici trasformate pelosi, usando un bisturi tagliata le radici che esprime l'indicatore rosso fluorescente trasformazione (proteina DsRed) quando sono lunghe 4-8 cm (Figura 1E) e trasferirli in una capsula di Petri con terreno solido Gamborg B5 completato con 2% di saccarosio e cefotaxime sodium [500 μg/mL]. Sigillare le piastre con parafilm plastica e farle crescere al buio a 20 ° C.
      Nota: Le radici possono essere manipolate sotto un microscopio stereoscopico in grado di rilevare la fluorescenza in condizioni sterili (Vedi Tabella materiali).
   3. Per la produzione di biomassa (cioè, analisi di espressione genica), tagliare una radice lunga pelosi di 5 cm e si propagano in una beuta da 150 mL con 20 mL di liquido Gamborg B5 supplementato con 2% di saccarosio e cefotaxime sodium [500 µ g/mL]. Crescere per 6 settimane al buio a 20 ° C e 60 giri/min.

Figura 1: Sequenza temporale per ottenere patate transgeniche radici pelosi utilizzando a. rhizogenes. Le settimane cumulative per raggiungere ogni fase del processo di trasformazione e i passi successivi per crescere le radici pelosi sono mostrate. Sono raffigurate immagini rappresentative di diverse fasi: l'iniziazione del processo utilizzando 3-settimana-vecchio in vitro di piante (A), quindi l'infezione delle piante iniettando a. rhizogenes (B), la formazione della proliferativa tessuto (C, frecce) con radici pelosi emergenti (D) e le radici sviluppate pelosi che esprime l'indicatore rosso fluorescente trasformazione DsRed (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. impianto trasformazione utilizzando a. tumefaciens (Figura 2)

Nota: Questa procedura permette di ottenere delle piante trasformate. Per valutare effetto del transgene, è necessario un controllo negativo. È possibile seguire la procedura utilizzando un a. tumefaciens trasformate con il vettore vuoto. In alternativa, possono essere utilizzati piante wild type.

1. Tagliare e posizionare una foglia dalle piante di 3-4-settimana-vecchio (Figura 2A) in una capsula di Petri. Usando un bisturi escludere il picciolo e fare tagli trasversali (1-3 a seconda delle dimensioni della foglia) dal centro della foglia ai bordi evitando loro tagliando (Figura 2B).
2. Immediatamente posto la foglia che galleggia su 10 mL di 2MS fresco liquido media in una capsula di Petri con il lato abbagliai fino e chiudere la piastra. Ripetere il passo in grado di ospitare fino a 15 fogli per CV Désirée e 25 foglie per SSP. unndigena (a seconda delle dimensioni di foglia).
3. Immediatamente aggiungere 80 µ l di a. tumefaciens cultura OD₆₀₀ = 0,8 in mezzi liquidi e omogeneizzare la piastra manualmente per 1 min distribuire la soluzione batterica.
4. Con attenzione sigillare con pellicola sigillante, coprire con carta stagnola e incubare per 2 giorni in una camera a 24 ° C per consentire la trasformazione si verificano.
5. Trasferire le foglie mantenendo abbagliai laterale fino a medie CIM (Figura 2B) e incubare a loro per una settimana in un armadietto di crescita.
   1. Raschiare il mezzo CIM con le pinzette, affinché le foglie possono essere risolte al meglio sui media.
6. Trasferire le foglie mantenendo abbagliai laterale fino a mezzo SIM (Figura 2) e incubare a loro in un armadietto, rinfrescante il mezzo ogni 7-10 giorni, fino a quando i germogli sono circa 2 cm di altezza di crescita.
   1. Raschiare il mezzo SIM con le pinzette, affinché le foglie possono essere completamente circondate dai media. Quando i germogli emersi raggiungono il coperchio, lavorare con altezza di Petri (100 x 20 mm, altezza x diametro).
      Nota: Il callo si forma dopo 2-3 settimane in media SIM (Figura 2D) e i germogli dopo 6-7 settimane (Figura 2E). I germogli saranno considerati eventi di trasformazione indipendente quando emergono dal callo formato dalle ferite indipendente.
7. Taglio tre tiri è emerso da ogni callo (considerato lo stesso evento di trasformazione) (Figura 2E), trasferimento per matracci di cultura con il mezzo di MG completati con cefotaxime sodium [250 mg/L] per consentire il tifo, etichettare il sottoinsieme con un numero e Incubare in una crescita armadietto per 3-4 settimane o fino a quando i germogli sono vigoroso (Figura 2F).
   Nota: Quando si tagliano i germogli, rimuovere bene il callo altrimenti che la radice non si formerà.
   1. Ripetere il passaggio tante volte quante sono necessarie linee indipendenti. Fino a 5 diversi trasformazione eventi possono essere messo in un matraccio di cultura con un diametro di 8 cm per lavorare in piena fiducia che le piante da eventi diversi non sono mescolate.
8. Selezionare la pianta più vigorosa di ciascun evento, tagliare il segmento apicale delle riprese con internodi di 3-4 e posizionarlo in un matraccio di cultura nuova con 2MS supplementato con cefotaxime sodium [250 mg/L].
   Nota: In 3-6 settimane che la pianta crescerà in modo efficiente, lo sviluppo di una vigorosa ripresa e radici.
   1. Riportare alla camera i germogli non selezionati fino a quando la pianta selezionata è completamente sviluppato.
9. Tagliare segmenti di fusto dalla pianta con almeno un internodo o con la gemma apicale e trasferirli al nuovo 2MS supplementato con cefotaxime [250 mg/L]. Incubare a loro nella crescita armadietto.
   1. Replicare ogni 3-4 settimane per stabilire le linee in vitro trasformato.
      Nota: Il sodio cefotaxima è necessaria in almeno tre trasferimenti successivi a 2MS medio per essere sicuri di uccidere a. tumefaciens; in seguito, se si osserva la crescita eccessiva di a. tumefaciens , trasferire le piante nuovamente ai media di 2MS completati con cefotaxime sodium.
10. Per caratterizzare il fenotipo della pianta, è necessario trasferire piante al suolo per la loro completa caratterizzazione o alla coltura idroponica per ispezione di radice.
    1. Mantenere i tuberi prodotti nel terreno per propagare e mantenere le linee stabilite.

Figura 2: Timeline per ottenere patate trasformato piante utilizzando a. tumefaciens. Le settimane cumulative per raggiungere ogni fase del processo di trasformazione e i passi successivi per coltivare le piante sono mostrate. Sono raffigurate immagini rappresentative di diverse fasi: l'iniziazione del processo utilizzando foglie da 3 - settimana-vecchio in vitro le piante (A), il trasferimento dei feriti e infetto foglie ai media CIM (B), le foglie quando trasferito a Media SIM (C), la visualizzazione del callo intorno alle aree feriti dopo 2-3 settimane in SIM media (D), la formazione di sparare dopo 9-11 settimane in media SIM (E) e i germogli dopo essere stato trasferito ai media di MG (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. idroponico cultura

1. Preparare la soluzione di Hoagland a una mezza forza (0.5 x) (Tabella S2) in un secchio di 10 L.
2. Immergere una pompa da acquario per mantenere condizioni di ossigeno adeguato e omogeneità.
3. Ricoprono le pareti del secchio con foglio di alluminio di crescere radici in condizioni di oscurità.
4. Evitando danni alle radici, trasferimento in vitro le piante in coltura idroponica.
   Nota: Rimuovere qualsiasi supporto restante in vitro dalle radici per evitare la proliferazione di microrganismi durante l'incubazione agitando accuratamente le radici immerse in acqua.
5. Coprire le piante con pellicola trasparente come una serra per consentire un'adeguata acclimatazione e incubare in camera di crescita.
6. Forare la pellicola dopo 3 giorni e rimuoverlo completamente una settimana dopo.
7. Sostituire con mezzi freschi ogni 10 giorni.

6. analisi del gene del reporter istochimiche GUS

Nota: Nel nostro caso il GUS analisi è stata eseguita con radici di 2-3 settimane coltivate in idroponica o in vitro.

1. Difficoltà le radici con acetone refrigerati il 90% (v/v) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
2. Effettuare due lavaggi con acqua distillata.
3. Aggiungere GUS fresco colorazione soluzione (tabella 1) e applicare il vuoto (-70 Pa) per 20 min.
4. Incubare a 37 ° C nel buio per proteggere il GUS fotosensibile per 4 h o fino a quando un colore blu è visibile.
   Nota: La presenza di ferri - e ferrocianuro in soluzione di GUS minimizzare la diffusione dei prodotti di reazione e fornire la localizzazione più precisa.
   Attenzione: Utilizzare un aspiratore e indossare indumenti protettivi quando si maneggia i derivati del cianuro tossico in soluzione di GUS (il ferricianuro di potassio e ferrocianuro di potassio). Il substrato di GUS e il materiale di smaltimento devono essere eliminati in modo sicuro.
5. Rimuovere GUS soluzione di colorazione e gettarlo negli appositi contenitori.
6. Effettuare due lavaggi con etanolo 70% (v/v).
7. Osservare sotto un microscopio a campo chiaro.
   Nota: GUS macchiatura è stabile per un paio di settimane; Tuttavia, durante la prima settimana, il segnale di GUS è chiaro e diffonde meno in cellule vicine. Per conservarli più a lungo, sigillare il tubo e conservare a 4 ° C.

Tabella 1: Ricetta di soluzione colorante GUS.

Risultati

Agrobacterium rhizogenes -mediata trasformazione di patate

In questo manoscritto, viene presentata la procedura dettagliata per ottenere trasformato radice con a. rhizogenes . Figura 1 presenta una panoramica della procedura, che richiede complessivamente circa 5-6 settimane (da iniezione di a. rhizogenes per ottenere pienamente sviluppate...

Discussione

Patata, il sistema più comune per ottenere piante transgeniche complete stabile utilizza la trasformazione da ceppi di Agrobacterium tumefaciens che richiedono organogenesi utilizzando fitormoni esogeni. Anche se i protocolli di Agrobacterium basato ha il potenziale per integrare non-T-DNA vettore sequenza²⁵, questa metodologia è ancora il metodo più semplice e meno costoso disponibile per trasformare piante di patate. Negli ultimi anni, l'interesse in a. rhizogenes-t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Panreac	1.310.071.21
Acetosyringone	Acros	115540050
Aquarium pump	Prodac	MP350
Autoclave	Ragpa Strelimatic
Bacteriological agar	Lab Conda	1800
BAP	Duchefa	B0904
Beef extract	Lab Conda	1700
Plant growing cabinet	Nuaire
Carbenicillin	Duchefa	C0109
Cefotaxime sodium	Duchefa	C0111
DMSO	Merck	1029310161
Ecotron infors	HT	29378
Ethanol	Merck	1,009,831,011
Falcon tube	Control tecnica	CFT011500
Ferricyanate	Sigma	101001081
Ferrocyanate	Sigma	100979088
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture	Apiglass	ref16
GA3	Sigma	G7645
Gamborg B5 media	Duchefa	G0210
Gelrite	Duchefa	G1101
Glucosa	Sigma	G5767
Kanamycin	Sigma	K1377
Leukopor tape	BSN Leukopor	BDF47467
Lupe	Wild-Heerbrugg	M420
Magnetic shaker	Agimatic	7000243
MES hydrate	Sigma	M2933-25G
MgSO4	Panreac	131404
Microscope	Olympus
Minufugue centrifugue 5415R	Eppendorf
Murashige and Skoog media	Duchefa	M0254.0050
Na2HPO4	Panreac	131679
NAA	Duchefa	N0903
NaCl	Panreac	131659
NaH2PO4	Sigma	58282
NightSea Stereo	SFA Moonting Adapter
Parafilm	Anorsa	PRFL-001-001
Peptone	Lab Conda	1616
Petri dishes (90 x 14)	Anorsa	200200
pHmetre	Crison
Phytotron	Inkoa	RFTI-R5485
Plant Agar	Duchefa	P1001
Refrigeratot	Liebherr Medline
Rifampicin	Duchefa	R0146
Spectinomycin	Sigma	59007
Spectrophotometer	Shimadzu
Square plates (120 x 120)	Deltalab	200204
Streptomycin	Sigma	S6501
Sucrose	Panreac	131621
Surgical blades	Swann-Morton	201
Surgical needle	NIPRO	015/0204
Triptone	Lab Conda	1612
Triton	Serva	37240
Unimax 1010 shaker	Heidolph
Vacuum	Dinko
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)	Biosynth	B-7398
Yeast extract	Lab Conda	1702.00
Zeatin riboside	Sigma	1001042850