Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining

Resumo

Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.

Resumo

Agrobacterium SP. é um dos métodos mais utilizados para obter plantas transgênicas, pois tem a capacidade de transferir e integrar sua próprias T-DNA no genoma da planta. Aqui, apresentamos dois sistemas de transformação para modificar geneticamente as plantas de batata (Solanum tuberosum). Na transformação da . tumefaciens , folhas são infectadas, as células transformadas são Selecionadodas e uma nova planta completa de transformada é regenerada usando fitohormônios em 18 semanas. Na transformação da . rhizogenes , hastes estão infectados por injetar a bactéria com uma agulha, as novas raízes peludas surgiu transformadas são detectadas usando um marcador fluorescente vermelho e as raízes não-transformadas são removidas. Em 5-6 semanas, a planta resultante é um composto de um tiro de tipo selvagem com raízes peludas transformados totalmente desenvolvidos. Para aumentar a biomassa, as raízes peludas transformadas podem ser extirpadas e self propagadas. Nós aplicamos os dois métodos de transformação Agrobacterium -mediada para obter raízes expressando o gene repórter GUS impulsionado por um promotor do gene biossintética de suberina. O procedimento de coloração GUS é fornecido e permite a localização de célula da indução promotor. Em ambos os métodos, as raízes de batata transformada mostraram GUS coloração na cor endoderme e exoderme e além disso, em raízes de a. rhizogenes transformou a atividade de GUS também foi detectado o surgimento de raízes laterais. Estes resultados sugerem que a. rhizogenes pode ser uma ferramenta rápida alternativa para estudar os genes que são expressos em raízes.

Introdução

Além de interesse econômico, a geração de plantas transgênicas tem sua própria relevância na pesquisa para demonstrar a função final dos genes e para entender melhor a fisiologia vegetal e desenvolvimento. O mais amplamente utilizado método para inserção de DNA de plantas é Agrobacterium-mediado transformação. Agrobacterium tumefaciens é capaz de gerar coroa galhas em muitas espécies de plantas, o tecido infectado pela ação do seu do plasmídeo indutor de tumor (Ti). O plasmídeo contém uma região de T-DNA com um conjunto de genes que será integrado no genoma da planta e induzir o tecido quê^1,2. A troca destes genes dentro do T-DNA pelo transgene permitiu a geração de modificações específicas planta evitando efeitos fenotípicos³. Para facilitar o transgene clonagem no T-ADN, a região de T-DNA tem sido retirada em um plasmídeo independente chamado um plasmídeo de binário, enquanto o resto dos genes do plasmídeo Ti (os genes de virulência que permitem que os mecanismos de transferência e inserção de T-DNA) têm sido colocadas em um plasmídeo ajudante. Para pesquisa de biotecnologia de plantas, transformação pela . tumefaciens tem várias vantagens: não necessita de dispositivos caros, é capaz de gerar tanto transformação planta estável e transitória e baixo número de cópias são integradas de gene a cromossoma⁴. No entanto, para a maioria das plantas, mas não de Arabidopsis, a geração de transformants estável requer regeneração de plantas de uma única ou algumas células usando fitohormônios exógenos, tornando este processo trabalhoso e demorado. A. rhizogenes também é capaz de modificar o genoma da planta, produzindo raízes peludas ou adventícias raízes dos locais de infecção devido a expressão de genes de rol (raiz loci) codificado na raiz de indução (Ri) do plasmídeo⁵. Embora menos estudado do que a. tumefaciens, a. rhizogenes também é usado para a obtenção de raízes transgénicas. Neste caso, a a. rhizogenes contém o T-DNA original no plasmídeo Ri e um plasmídeo binário com um segundo T-DNA carregando o transgene. Quando o local de infecção é em hastes ou hipocótilo, uma planta composta pode ser obtida, com novas raízes transgénicas peludas emergentes de rebentos de tipo selvagem. Alternativamente, raízes transformadas peludas podem crescer autonomamente em vitro na mídia com entradas de fonte de carbono. O uso de a. rhizogenes em vez de a. tumefaciens para produzir tecidos transgênicos está ganhando relevância quando a raiz é o órgão-alvo, porque a regeneração da planta não é necessária e, portanto, é mais rápido e menos dispendioso. Estudos anteriores têm demonstrado esta metodologia apropriada para a caracterização fenotípica de raiz genes específicos^6,7,8,9.

A batata (Solanum tuberosum) é a quarta mais importante colheita no mundo de acordo com a organização a alimentação e agricultura das Nações Unidas (FAO) desde que o tubérculo tem relevância nutricional para consumo humano, por ser uma boa fonte de vitaminas e minerais. Por esse motivo, a batata foi colocada no centro do atenções da biotecnologia agrícola e também é considerada como um bom modelo biológico para genética e do desenvolvimento de estudos de^10,11. Transformação de batata contribuiu significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes tecidos cor através da caracterização de genes envolveram em suberina e cera biossíntese^{12,13,14 ,15,16,17}, suberina monômero transporte¹⁸ e transcrição Regulamento¹⁹. Gene da suberina feruloyl transferase, FHT, é um destes genes biossintéticos caracterizadas; seu downregulation dá origem a um forte comprometimento da proteção periderme, que está correlacionado com uma forte diminuição em ésteres Ferulato de suberina e ceras em tubérculos de batata¹⁴. Concomitantemente, nas raízes e sementes de Arabidopsis, o nocaute do seu putativo orthologue (ASFT/RWP1), também demonstrou seu papel na produção de ferulates de alquila em suberina^20,21. Na batata, a linha de repórter transcriptional FHT e o anticorpo FHT mostraram respectivamente que a atividade de promotor e a proteína estão localizados na exoderme, a endoderme, os felogênio-derivados e em tecidos feridos,¹⁵.

Neste trabalho, detalhamos um protocolo utilizando a. rhizogenes para produzir transgênicas raízes peludas que são mantidas em uma sessão do tipo selvagem, gerando plantas de batata composto ou extirpado para crescer autonomamente em vitro. Nós também fornecemos o protocolo utilizando a. tumefaciens para obter plantas de batata transgénica completa. Como um estudo de caso, a. rhizogenes e a. tumefaciens transformada com o vetor binário mesmo são usados para obter as raízes com o promotor FHT dirigindo a expressão do gene repórter GUS . Os resultados são relatados e comparados.

Protocolo

O protocolo de transformação a. rhizogenes foi adaptado e modificado de Horn et al.⁷ e o genótipo testado foi S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée). O protocolo de transformação da . tumefaciens foi adaptado e modificado de Banerjee et al.²² e os genótipos testados foram S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée) e S. tuberosum SSP. andigena. As principais etapas de ambos os procedimentos são resumidas na Figura 1 e Figura 2, respectivamente.

Nota: Em todas as etapas do procedimento de realizar transferências em vitro , fazê-lo rapidamente e quando possível, manter as placas ou vasos fechados, minimizando assim a exposição da planta ao ar para evitar contaminação e murcha. Contrário, toda a incubação do planta foram feitas em armários sob as condições de 12 h de 24 ° C luz/12 h de 20 ° C escuro e 67 µmol m^-1 s^-1. Contrário, realize todas as bactérias e manipulação em vitro planta transferências em condições assépticas numa vizinhança de fluxo laminar. Todas as receitas de mídia para culturas de plantas de Agrobacterium e in vitro são fornecidas na Tabela S1.

Atenção: Deposite todas as bactérias geneticamente modificadas e as plantas para o recipiente de resíduos adequado.

1. culturas de Agrobacterium usadas para transformação

Nota: A tensão usada para a transformação da. rhizogenes foi o C58C1:Pri1583⁷ (gentilmente cedido pelo Dr. Inge Broer) e para a a. tumefaciens foi o GV2260 (gentilmente cedido pelo Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes foi transformada com o vetor binário PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-departamento de biologia de sistemas planta na Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) que contém um T-DNA carregando um marcador de transformação para monitorar a raiz pilosa formação. Para comparar as raízes transformadas geradas pela . rhizogenes e a. tumefaciens, ambos foram transformados com o vetor binário pKGWFS7 que contém um T-DNA carregando o promotor FHT dirigindo o gene repórter β-glucoronidase (GUS) e o gene de resistência de canamicina como um marcador selecionável de¹⁵.

1. Escolher uma colônia de Agrobacterium e cultivá-la durante a noite (O/N) em 5 mL de meio YEB suplementado com antibióticos (Tabela S1) num tubo de centrífuga de 50 mL a 28 ° C com agitação a 200 rpm.
2. Para a transformação da . tumefaciens , medir a densidade óptica, o que deve ser OD₆₀₀ = 0.6-1.0.
   1. Se a densidade óptica é mais elevada, fazer uma subcultura abaixá-la para OD₆₀₀ = 0.3 com mídia fresca e espere até que a cultura atinja OD₆₀₀ = 0,6-1.
3. Centrifugar 1 mL da cultura de Agrobacterium a 3.000 x g em uma centrífuga de bancada para 10 min à temperatura ambiente.
4. Remover o sobrenadante por pipetagem e ressuspender as células em 1 mL de meio fresco de YEB sem antibióticos. Repita esta etapa para assegurar a remoção completa dos antibióticos.
   1. Para a transformação da . tumefaciens , no último ressuspensão adicionar o volume apropriado de YEB para obter uma densidade óptica final de OD₆₀₀ = 0,8.
5. Manter as células no gelo enquanto prepara as plantas para ser infectado.

2. material para a transformação da planta

1. Fazer um ou dois nó estaquia também contendo o apical ou os botões auxiliares de estéril em vitro batata plantas (doador); cultivá-las em meio sólido 2MS em uns potenciômetros para 3 a 4 semanas (figura 1A e Figura 2A).

3. planta de transformação usando a. rhizogenes (Figura 1)

Nota: Este procedimento permite a obtenção de raízes peludas transformadas. Para avaliar a expressão do transgene, é necessário um controlo negativo. Para preparar o controlo negativo, siga o procedimento utilizando uma cepa da . rhizogenes unlit ou transformada com o vetor vazio que inclui o gene marcador de transformação.

1. Usar placas de mídia fresco; Alternativamente, as placas podem ser mantidas a 4 ° C, com a tampa para cima, firmemente seladas com película transparente para evitar a desidratação de mídia. Para preparar os pratos quadrados mídia, inclinai-los ~ 15°, enchê-lo com 40 mL de MS e deixar solidificar. Isto irá minimizar o contato da parte aérea da planta com o meio.
2. Transferência de cuidadosamente uma planta doadora do meio de 2MS para uma placa quadrada de 120 x 120 mm.
3. Injetar a um haste entrenó 3 μL da cultura a. rhizogenes usando uma agulha cirúrgica e repeti-lo duas vezes por planta em diferentes entrenós quando possível.
   Nota: Considere cada injecção como um evento de transformação independente (figura 1B).
4. Transferi imediatamente a planta inteira para uma placa quadrada com sólido MS suplementado com 0,1 mM acetosyringone. Acomodar 2 plantas por placa.
   Nota: A solução 1 M acetosyringone é preparada em DMSO e pode ser armazenada a-20 ° C.
5. Selar a placa usando fita cirúrgica e organizá-lo verticalmente dentro de um armário de crescimento por 4 dias.
6. Transferi a fábrica para uma nova placa quadrada com MS suplementado com cefotaxima sódio [500 µ g/mL] para matar a. rhizogenes.
7. Depois de 10-12 dias, peludas raízes começarão aparecer (Figura 1,1D). Em seguida, excisar as raízes nativas da planta e transferir a fábrica para uma nova placa quadrada com MS suplementado com cefotaxima sódio [500 µ g/mL].
   Nota: Raízes peludas transformadas podem ser verificadas por fluorescência vermelha quando usando um marcador DsRed de transformação (Figura 3D).
8. Para obter uma planta composta (Figura 1E), deixe as raízes transgénicas peludas crescer por 3-4 semanas em MS suplementado com cefotaxima sódio [500 μg/mL] (mudar o médio toda semana).
9. Dependendo da finalidade, propaga as raízes transgénicas peludas e os controles negativos como segue.
   1. Transferi a planta inteira composta para uma hidropônico (Tabela S2) ou média de solo para permitir o desenvolvimento maciço.
   2. Para propagar individualmente as raízes peludas transformadas, usar um bisturi corta as raízes expressando o marcador vermelho fluorescente transformação (proteína DsRed) quando eles são 4-8 cm de comprimento (Figura 1E) e transferi-los para uma placa de Petri com meio sólido de Gamborg B5 suplementado com 2% de sacarose e cefotaxima sódio [500 μg/mL]. Selar as placas com película de plástico de laboratório e cultivá-las no escuro a 20 ° C.
      Nota: As raízes podem ser manipuladas sob um microscópio estereoscópico equipado para detectar a fluorescência sob condições estéreis (ver Tabela de materiais).
   3. Para a produção de biomassa (ou seja, análise de expressão do gene), cortar uma raiz muito peludo de 5cm e propagá-la em um Erlenmeyer de 150 mL com 20 mL de meio líquido de Gamborg B5 suplementado com 2% de sacarose e cefotaxima sódio [500 µ g/mL]. Cultivá-la por 6 semanas no escuro a 20 ° C e 60 rpm.

Figura 1: Linha do tempo para obter batata transgênicas raízes peludas usando a. rhizogenes. As semanas cumulativas para alcançar cada etapa do processo de transformação e as etapas subsequentes para crescer as raízes peludas são mostradas. Imagens representativas das diferentes fases são descritas: a iniciação do processo usando 3 semanas em vitro de plantas (A), em seguida de infecção das plantas injetando a. rhizogenes (B), a formação da proliferativa tecido (C, setas) com raízes peludos emergentes (D) e as raízes peludas desenvolvidas expressando o marcador vermelho fluorescente transformação DsRed (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. plante transformação usando a. tumefaciens (Figura 2)

Nota: Este procedimento permite a obtenção de plantas transformadas. Para avaliar efeito do transgene, é necessário um controlo negativo. Uma opção é seguir o procedimento usando um a. tumefaciens transformada com o vetor vazio. Alternativamente, podem ser usadas plantas tipo selvagem.

1. Corte e coloque uma folha das plantas de 3-4 semana de idade (Figura 2A) em uma placa de Petri. Usando um bisturi excluir o pecíolo e fazer cortes transversais (1-3, dependendo do tamanho da folha) no centro da folha para as bordas, evitando cortá-los (Figura 2B).
2. Coloque a folha a flutuar em 10 mL de 2MS fresco media líquidos em uma placa de Petri com o lado abaxial imediatamente e fechar a chapa. Repita a etapa, acomodando até 15 folhas para CV Désirée e 25 folhas para SSP. umndigena (dependendo do tamanho da folha).
3. Imediatamente adicione 80 µ l da . tumefaciens cultura no OD₆₀₀ = 0,8 nos meios líquidos e homogeneizar a placa manualmente durante 1 min distribuir a solução bacteriana.
4. Cuidadosamente com filme de vedação do selo, cubra com papel alumínio e incubar durante dois dias em uma câmara de 24 ° c e deixe a transformação ocorrer.
5. Transfira as folhas mantendo lado abaxial até meio CIM (Figura 2B) e incube-os por uma semana em um armário de crescimento.
   1. Raspe o meio CIM com a pinça para que as folhas podem ser melhor acomodadas na mídia.
6. Transfira as folhas mantendo lado abaxial até meio SIM (Figura 2) e incube-os em um armário, refrescando o meio cada 7-10 dias, até que os brotos são cerca de 2 cm de altura de crescimento.
   1. Raspe o meio SIM com a pinça, para que as folhas podem ser totalmente cercadas pela mídia. Quando os brotos surgiu alcançar a tampa, trabalho com altos pratos de Petri (100 x 20 mm, altura x diâmetro).
      Nota: Os calos formarão após 2-3 semanas SIM médio (Figura 2D) e os brotos após 6-7 semanas (Figura 2E). Os brotos serão considerados eventos de transformação independente quando eles emergem do calo, formado a partir de feridas independentes.
7. Corte três tiros surgiu do cada calo (considerado o mesmo evento de transformação) (Figura 2E), transferência para frascos de cultura com meio MG suplementados com cefotaxima sódio [250 mg/L] para permitir a torcer, rotular o subconjunto com um número e incube em um crescimento do armário para 3-4 semanas ou até que os brotos são vigorosas (Figura 2F).
   Nota: Ao cortar os brotos, remova bem o calo senão que não formará a raiz.
   1. Repita o passo tantas vezes quantas linhas independentes são necessários. Até 5 transformação diferentes eventos podem ser colocados em um frasco de cultura com um diâmetro de 8 cm para trabalhar em plena confiança que as plantas de eventos diferentes não se misturam.
8. Selecione a planta mais vigorosa de cada evento, cortar o segmento apical das filmagens com 3-4 entrenós e colocá-lo em um novo frasco de cultura com 2 MS suplementado com cefotaxima sódio [250 mg/L].
   Nota: Em 3-6 semanas que a planta crescerá com eficiência, desenvolvendo um broto vigoroso e raízes.
   1. Trazer de volta para a câmara os brotos não selecionado até que a planta selecionada desenvolveu-se plenamente.
9. Cortar segmentos de caule da planta pelo menos um entrenó ou com o broto apical e transferi-los para nova 2 MS suplementado com cefotaxima [250 mg/L]. Incube-os no crescimento do armário.
   1. Replica a cada 3-4 semanas para estabelecer as linhas em vitro transformado.
      Nota: O sódio cefotaxima é necessária pelo menos três transferências subsequentes a 2MS médio para ter a certeza para matar a a. tumefaciens; Depois, se supercrescimento da . tumefaciens é observado, transferi as plantas novamente para mídia de 2 MS suplementada com sódio de cefotaxima.
10. Para caracterizar o fenótipo da planta, transferir as plantas ao solo para a sua caracterização completa ou a cultura de hidroponia para inspeção de raiz.
    1. Manter os tubérculos produzidos no solo para propagar e manter as linhas estabelecidas.

Figura 2: Linha do tempo para obter batata transformou plantas usando a. tumefaciens. As semanas cumulativas para alcançar cada etapa do processo de transformação e as etapas subsequentes para crescer as plantas são mostradas. Imagens representativas dos diferentes estágios são descritas: o início do processo, usando folhas de plantas em vitro 3 semana de idade (A), a transferência dos feridos e infectados deixa para a mídia CIM (B), as folhas quando transferido para SIM media (C), a visualização do calo em torno das áreas feridos após 2-3 semanas na mídia (D) SIM, a formação de tiro depois de 9-11 semanas na mídia SIM (E) e os brotos depois sendo transferido para mídia MG (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. hidropônica cultura

1. Preparar a solução de Hoagland a uma metade da força (0.5 x) (Tabela S2) em um balde de 10L.
2. Mergulhe uma bomba de aquário para manter a homogeneidade e condições adequada de oxigênio.
3. Cobrir as paredes do balde com folha de alumínio para criar raízes no escuro.
4. Evitando danos de raiz, transferi em vitro plantas para cultura hidropónica.
   Nota: Remova qualquer meio restantes em vitro de raízes para evitar a proliferação de microorganismos durante a incubação, agitando cuidadosamente as raízes imergidas em água.
5. Cobrir as plantas com película transparente como uma estufa de vidro para permitir a adequada aclimatação e incubar em câmara de crescimento.
6. Faça furos no filme depois de 3 dias e removê-lo completamente uma semana depois.
7. Substitua com mídia fresca em 10 dias.

6. ensaio de gene repórter histochemical GUS

Nota: No nosso caso o GUS análise foi realizada com raízes de 2-3 semanas, cultivadas em hidroponia ou in vitro.

1. Corrigir as raízes com acetona gelada de 90% (v/v) e incube-lo por 20 minutos no gelo.
2. Execute duas lavagens com água destilada.
3. Adicione fresco GUS coloração solução (tabela 1) e aplicar vácuo (-70 Pa) por 20 min.
4. Incube a 37 ° C, no escuro, para proteger o GUS fotossensível por 4h ou até uma cor azul é visível.
   Nota: A presença de ferri - e ferrocianeto em solução GUS minimizar a difusão dos produtos de reação e fornecer localização mais precisa.
   Atenção: Usar uma coifa e utilizar vestuário de protecção ao manusear os derivados tóxicos de cianeto em solução GUS (o ferricianeto de potássio e ferrocianeto de potássio). O substrato de GUS e o material de descarte devem ser descartados com segurança.
5. Remover o GUS solução de coloração e descartá-lo em recipientes apropriados.
6. Execute duas lavagens com etanol 70% (v/v).
7. Observe em um microscópio de campo claro.
   Nota: GUS coloração é estável por algumas semanas; no entanto, durante a primeira semana, o sinal de GUS é claro e difunde-se menos em células de vizinhos. Para uma conservação mais longa, fechar o tubo e armazená-lo em 4 ° C.

Tabela 1: Receita de solução coloração de GUS.

Resultados

Agrobacterium rhizogenes -mediado transformação de batata

Neste manuscrito, é apresentado o procedimento passo a passo para obter a raiz transformada com a. rhizogenes . A Figura 1 apresenta uma visão geral do processo, que ao todo leva cerca de 5-6 semanas (a partir de injeção da . rhizogenes para obtenção de raízes peludas total...

Discussão

Em batata, o sistema mais comum para obter plantas transgênicas completas estáveis usa a transformação por cepas de Agrobacterium tumefaciens que exigem organogênese usando fitohormônios exógenos. Embora os protocolos de Agrobacterium baseado tem potencial para integrar o vetor não-T-DNA sequência²⁵, esta metodologia é ainda o mais fácil e menos caro disponível para transformar plantas de batata. Durante os últimos anos, o interesse na . rhizogenes-transform...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Panreac	1.310.071.21
Acetosyringone	Acros	115540050
Aquarium pump	Prodac	MP350
Autoclave	Ragpa Strelimatic
Bacteriological agar	Lab Conda	1800
BAP	Duchefa	B0904
Beef extract	Lab Conda	1700
Plant growing cabinet	Nuaire
Carbenicillin	Duchefa	C0109
Cefotaxime sodium	Duchefa	C0111
DMSO	Merck	1029310161
Ecotron infors	HT	29378
Ethanol	Merck	1,009,831,011
Falcon tube	Control tecnica	CFT011500
Ferricyanate	Sigma	101001081
Ferrocyanate	Sigma	100979088
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture	Apiglass	ref16
GA3	Sigma	G7645
Gamborg B5 media	Duchefa	G0210
Gelrite	Duchefa	G1101
Glucosa	Sigma	G5767
Kanamycin	Sigma	K1377
Leukopor tape	BSN Leukopor	BDF47467
Lupe	Wild-Heerbrugg	M420
Magnetic shaker	Agimatic	7000243
MES hydrate	Sigma	M2933-25G
MgSO4	Panreac	131404
Microscope	Olympus
Minufugue centrifugue 5415R	Eppendorf
Murashige and Skoog media	Duchefa	M0254.0050
Na2HPO4	Panreac	131679
NAA	Duchefa	N0903
NaCl	Panreac	131659
NaH2PO4	Sigma	58282
NightSea Stereo	SFA Moonting Adapter
Parafilm	Anorsa	PRFL-001-001
Peptone	Lab Conda	1616
Petri dishes (90 x 14)	Anorsa	200200
pHmetre	Crison
Phytotron	Inkoa	RFTI-R5485
Plant Agar	Duchefa	P1001
Refrigeratot	Liebherr Medline
Rifampicin	Duchefa	R0146
Spectinomycin	Sigma	59007
Spectrophotometer	Shimadzu
Square plates (120 x 120)	Deltalab	200204
Streptomycin	Sigma	S6501
Sucrose	Panreac	131621
Surgical blades	Swann-Morton	201
Surgical needle	NIPRO	015/0204
Triptone	Lab Conda	1612
Triton	Serva	37240
Unimax 1010 shaker	Heidolph
Vacuum	Dinko
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)	Biosynth	B-7398
Yeast extract	Lab Conda	1702.00
Zeatin riboside	Sigma	1001042850