Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Özet

Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.

Özet

Agrobacterium sp. aktarmak ve kendi T-DNA bitkinin genom entegre olanağı olduğu gibi transgenik bitkiler elde etmek için en çok kullanılan yöntemlerinden biridir. Burada, genetik olarak patates (Solanum tuberosum) bitkiler değiştirmek için iki dönüşüm sistemleri mevcut. A. tumefaciens dönüştürme, yaprakları bulaşmış, dönüştürülmüş hücreler seçilir ve yeni tam dönüştürülmüş bitki 18 hafta içinde etki kullanarak yeniden oluşturulur. A. rhizogenes dönüştürme, sapları bakteri bir iğneyle enjekte edilerek bulaşmış, yeni ortaya dönüştürülmüş kıllı kökleri kırmızı bir floresan işaretçisi kullanarak algılanır ve sigara dönüştürülmüş kökleri kaldırılır. 5-6 hafta içinde elde edilen bitki tam gelişmiş dönüştürülmüş kıllı kökleri ile vahşi türü çekimleri karmaşıktır. Biyokütle artırmak için dönüştürülmüş kıllı kökleri eksize kendi kendine yayılır ve. Biz kökleri suberin biyosentetik gen düzenleyici tarafından tahrik GUS muhabir gen ifade elde etmek için her iki aracılı Agrobacterium -dönüştürme yöntemleri uygulanır. GUS boyama yordam sağlanır ve hücre yerelleştirme organizatörü indüksiyon sağlar. Her iki yöntem de GUS GUS faaliyet suberized endodermis ve exodermis ve buna ek olarak, dönüştürülmüş A. rhizogenes kökleri boyama da yan kökler ortaya çıkması algılandı dönüştürülmüş patates kökleri gösterdi. Bu sonuçlar A. rhizogenes kökleri ifade edilir genler çalışmaya hızlı alternatif bir araç olabilir öneririz.

Giriş

Ekonomik çıkarları dışında transgenik bitkilerin üretimi araştırma ultimate işlev genlerin göstermek için ve Bitki fizyolojisi ve geliştirme daha iyi anlamak için kendi ilgisi yok. Bitki DNA ekleme Agrobacteriumiçin en yaygın yöntem kullanılan-dönüşüm aracılı. Agrobacterium tumefaciens crown galls birçok bitki türü virüslü dokuda onun tümör-inducing (Ti) plazmid eylem tarafından elde edebilecektir. Plazmid T-DNA bölge bitki genom entegre edilecek ve doku dedifferentiation^1,2neden genlerin bir dizi içerir. T-DNA transgene tarafından bu genlerde alışverişini fenotipik etkileri³kaçınarak belirli bitki değişiklikler nesil izin verdi. T-DNA'sı klonlama transgene kolaylaştırmak için T-DNA bölge Ti plazmid genler kalan süre ikili bir plazmid denilen bir bağımsız plazmid olarak eksize (T-DNA aktarımı ve ekleme mekanizmaları izin virülans genler) olmuştur bir yardımcı plazmid yerleştirilir. Bitki biyoteknoloji araştırmaları için dönüştürme A. tumefaciens tarafından birçok avantajı vardır: Bu pahalı cihazları gerekmez, istikrarlı ve geçici bitki dönüştürme hem Gen kopya içine entegre edilir az sayıda üretmek mümkün Kromozom⁴. Ancak, çoğu bitkiler ama değil Arabidopsis, kararlı transformants nesil bitki rejenerasyonu tek bir veya birkaç hücre eksojen etki, bu işlem yapma zahmetli ve zaman alıcı kullanarak gerektirir. A. rhizogenes da kıllı kökleri veya kök-inducing (RI) plazmid⁵' te kodlanmış rol (kök loci) gen ifadesi nedeniyle enfeksiyon sitelerdeki adventif kökleri üreten bitki genom değiştirmek yapabiliyor. Her ne kadar daha az A. tumefaciensokudu, A. rhizogenes transgenik kökleri elde etmek için de kullanılır. Bu durumda, A. rhizogenes özgün T-Ri Plazmid ve ikili bir plazmid DNA'sını ikinci bir T-DNA transgene taşıyan içerir. Enfeksiyonu site kaynaklanıyor olsa veya hypocotyls olduğunda, bileşik bir bitki, vahşi türü sürgünler ortaya çıkan yeni kıllı transgenik kökleri ile elde edilebilir. Alternatif olarak, kıllı dönüştürülmüş kökleri özerk vitro ortamda karbon kaynak girişi büyüyebilir. Kök çünkü bitki yeniden oluşturma işlemi gerekli değildir ve bu nedenle daha hızlı ve daha az maliyetli hedef organ olduğunda A. rhizogenes transgenik doku üretmek için A. tumefaciens yerine kullanımı alaka kazanıyor. Önceki çalışmalarda Bu metodoloji kök belirli genler^6,7,8,9fenotipik karakterizasyonu için tahsis göstermiştir.

Patates (Solanum tuberosum) gıda ve Tarım Örgütü Birleşmiş Milletler (FAO) göre dünyanın dördüncü en önemli ürün olduğu için yumru vitaminler iyi bir kaynak olduğu için insan tüketimi için beslenme ilgisi vardır ve mineraller. Bu nedenle, patates tarımsal biyoteknoloji spot olarak yerleştirildi ve genetik ve gelişimsel için iyi bir biyolojik model^10,11çalışmalar olarak da kabul edilir. Patates dönüşüm önemli genler karakterizasyonu aracılığıyla altta yatan suberized dokularda suberin içinde yer ve biyosentezi^{12,13,14 balmumu moleküler mekanizmaları anlamak için bulunmuştur ,15,16,17}, suberin monomer taşıma¹⁸ ve transkripsiyon yönetmelik¹⁹. Suberin feruloyl transferaz gene, FHT, bu karakterize biyosentetik genlerin biridir; onun downregülasyon suberin ferulate esterleri güçlü bir düşüş ve Vakslar, patates yumrular¹⁴ile ilişkili periderm koruma güçlü bir bozulma artış sağlar. Kullanılazlar, kökleri ve Arabidopsis tohumları, onun sözde orthologue (ASFT/RWP1) nakavt de alkil ferulates suberin^20,21üreten rolüne gösterdi. Patates, FHT transkripsiyon muhabir çizgi ve FHT antikor sırasıyla organizatörü etkinlik ve protein exodermis, endodermis, phellogen türevleri ve yaralı doku¹⁵yer gösterdi.

Bu çalışmada, bir protokol A. rhizogenes yaban türü çekimleri de sürdürülür transgenik kıllı kökleri üretmek için kullanma, bileşik patates bitkiler oluşturmadan veya özerk içinde vitrobüyümeye eksize ayrıntı. Biz de tam patates transgenik bitkiler elde etmek için A. tumefaciens kullanarak iletişim kuralı sağlar. Bir vaka çalışması olarak A. rhizogenes ve A. tumefaciens ile aynı ikili vektör dönüşüm kökleri GUS muhabir gen ekspresyonu sürüş FHT organizatörü ile almak için kullanılır. Sonuçlar bildirdi ve karşılaştırıldığında.

Protokol

A. rhizogenes dönüştürme Protokolü uyarlanmış ve boynuz vd.⁷ ' den değiştiren ve test genotip S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. özellikle). A. tumefaciens dönüştürme Protokolü uyarlanmış ve düşük Banerjee ve ark.²² değiştiren ve test genotip S. tuberosum ssp edildi. tuberosum (cv. özellikle) ve S. tuberosum ssp. andigena. Her iki yordamlar ana adımları şekil 1 ve Şekil 2'de, anılan sıraya göre özetlenir.

Not: Vitro transferler gerçekleştirme yordamı tüm adımları, hızlı bir şekilde yapmak ve mümkün olduğunda, tabak ya da kapalı, tencere böylece solan ve kontaminasyonu önlemek için havaya bitki maruz minimize korumak. Aksi belirtilmedikçe, tüm bitki incubations dolapları 24 ° C ışık/12 h 20 ° C karanlık ve 67 µmol m^-1 s^-112 h koşullar altında yapılmıştır. Aksi belirtilmedikçe, tüm bakteri manipülasyon ve vitro bitki transferler laminar akış kukuIeta aseptik şartlarda gerçekleştirin. Agrobacterium ve vitro bitki kültürler için tüm medya tarifleri Tablo S1içinde sağlanır.

Uyarı: Genetiği değiştirilmiş bakteri ve yürüttüğü atık konteyner bitkiler Kasası.

1. Agrobacterium kültürler dönüşümü için kullanılan

Not: (Lütfen Dr. Inge Broer tarafından sağlanan) C58C1:Pri1583⁷ A. rhizogenes dönüştürme için kullanılan zorlanma ve bunun için A. tumefaciens (lütfen Dr Salomé Prat tarafından sağlanan) GV2260 oldu. A. rhizogenes ile ikili vektör PK7GWIWG2_II-T-bir dönüşüm işareti taşıyan kıllı kök izlemek için DNA içeren RedRoot (VIB-bölümü bitki sistemleri Biyoloji Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) dönüştü oluşumu. A. rhizogenes ve A. tumefacienstarafından oluşturulan dönüştürülmüş kökleri karşılaştırmak için her ikisi de β-glucoronidase (GUS) muhabir gen sürüş FHT organizatörü taşıyan bir T-DNA içeren ikili vektör pKGWFS7 ile dönüştürülmüş ve sefaloridin direnç gen olarak seçilebilir işaret¹⁵.

1. Agrobacterium kolonisi almak ve bu gecede (O/N) antibiyotik (Tablo S1) ile desteklenmiş YEB orta 5 ml 200 devir / dakikada sallayarak ile 50 mL santrifüj tüpü 28 ° C'de büyümek.
2. A. tumefaciens dönüştürme için OD₆₀₀ olmalıdır optik yoğunluk ölçmek = 0,6-1.0.
   1. Optik yoğunluk daha yüksek ise, OD₆₀₀ düşürücü bir alt kültür olun kültür OD₆₀₀ ulaşıncaya kadar taze medya ve bekleme ile 0,3 = = 0,6-1.
3. Agrobacterium kültür 3000 x g bir tezgah üstü santrifüj oda sıcaklığında 10 dakika içinde de 1 mL santrifüj kapasitesi.
4. Pipetting tarafından süpernatant kaldırın ve 1 mL taze YEB orta Antibiyotikler olmadan hücrelerde resuspend. Antibiyotik tümüyle kaldırılmasını sağlamak için bu adımı yineleyin.
   1. A. tumefaciens dönüşüm için son resuspension OD₆₀₀ son optik yoğunluğu elde etmek için uygun YEB birim ekleme 0.8 =.
5. Hücreler buz bulaşması için bitkiler hazırlanırken tutmak.

2. bitki materyali için dönüştürme

1. Bir ya da iki düğüm kök kesimler de apikal veya steril vitro patates bitkilerden (donör bitkiler); yardımcı tomurcukları içeren yapmak Onları 3-4 hafta boyunca (şekil 1A ve şekil 2A) katı 2MS orta tencere içinde büyümek.

3. bitki A. rhizogenes (şekil 1) kullanarak dönüştürme

Not: Bu prosedür dönüştürülmüş kıllı kökleri almak sağlanır. Transgene ifade değerlendirmek için bir negatif kontrol gereklidir. Negatif kontrol hazırlamak için dönüştürülmemiş ya da dönüştürme marker gen içerir boş vektör ile dönüştürülmüş bir A. rhizogenes zorlanma kullanarak yordamı izleyin.

1. Taze medya tabak kullanın; Alternatif olarak, tabakları, kapak tarafı ile 4 ° C'de medya kurutma önlemek için şeffaf filmle sıkıca kapalı tutulabilir. Kare medya tabak hazırlamak için onları ~ 15 °, MS, 40 mL ile doldurun eğim ve kuvvetlendirmek bildirin. Bu bitki ile orta hava parçası temasını en aza indirmek olacaktır.
2. Çok dikkatli bir şekilde bir donör bitki bir 120 x 120 mm kare tabak 2 MS ortamından aktarmak.
3. Cerrahi bir iğne A. rhizogenes kültürünün bir kök düğümler arası 3 μL için enjekte ve farklı internodes mümkün olduğunda bitki başına iki kez tekrarlayın.
   Not: her enjeksiyon bir bağımsız dönüşüm olayı (şekil 1B) olarak düşünün.
4. Hemen tüm bitki katı MS Orta 0,1 mM acetosyringone ile takviye ile kare bir tabağa aktarın. Plaka başına 2 bitkiler karşılamak.
   Not: 1 M acetosyringone hisse senedi çözüm DMSO içinde hazırlanan ve -20 ° C'de depolanan
5. Cerrahi bant kullanarak plaka mühür ve dikey 4 gündür bir büyüme kabine içinde düzenleyin.
6. Bitki için yeni bir kare plaka A. rhizogenesöldürmeye sefotaksim sodyum ile [500 µg/mL] desteklenen MS orta aktarabilirsiniz.
7. 10-12 gün sonra kıllı kökleri (şekil 1 c,1 D) görünmesini başlayacak. Daha sonra yerli bitki köklerinin tüketim ve bitki için yeni bir kare tabak sefotaksim sodyum [500 µg/mL] ile desteklenen MS orta aktarabilirsiniz.
   Not: Dönüştürülmüş kıllı kökleri tarafından kırmızı Floresans ne zaman bir DsRed dönüşümün işaretçisi (şekil 3D) kullanarak kontrol edilebilir.
8. Kompozit tesisi (şekil 1E) elde etmek için 3-4 hafta sefotaksim sodyum [500 μg/mL] ile desteklenen MS ortamda büyümeye transgenik kıllı kökleri izin (orta her hafta değiştirin).
9. Amacına bağlı olarak takip transgenik kıllı kökleri ve negatif kontrolleri yaymak.
   1. Bir hydroponic (Tablo S2) veya toprak orta büyük gelişme için izin vermek için tüm bileşik bitki aktarın.
   2. Kırmızı floresan dönüştürme işaretleyici (DsRed protein) ifade kökleri kesilmiş bir neşter kullanarak tek tek dönüştürülmüş kıllı kökleri yaymak için ne zaman onlar 4-8 cm uzunluğunda (şekil 1E) ve onları bir petri Gamborg B5 katı orta ile içine transfer % 2 sukroz ve sefotaksim sodyum ile [500 μg/mL] desteklenmiştir. Plastik laboratuar film ile plakalarının ve onları 20 ° C'de karanlıkta büyümek
      Not: Kökleri steril koşullarda ( Tablo malzemelerigörmek) floresan algılamak için donatılmış bir stereomicroscope altında manipüle edilebilir.
   3. Biyokütle üretimi (yani, gen ifade analizi) için 5 cm uzun kıllı kök kesmek ve ile Gamborg B5 sıvı orta % 2 sukroz ve sefotaksim sodyum ile [500 µg/mL] takıma 20 mL 150 ml Erlenmeyer şişeye aktarabilirsiniz. Bu karanlıkta 20 ° C ile 60 d/d, 6 hafta boyunca büyümeye.

Resim 1: patates transgenik kıllı kökleri A. rhizogeneskullanarak elde etmek için zaman çizelgesi '. Dönüşüm süreci ve kıllı kökleri büyümek için sonraki adımları her aşamada ulaşmak için toplu hafta gösterilir. Farklı aşamalarında temsil edici görüntüleri tasvir: 3-hafta-yaşlı vitro kullanarak işlemi başlatma tertibatları (A), o zaman enfeksiyon bitkilerin A. rhizogenes (B), proliferatif oluşumu enjekte edilerek doku (C, ok) gelişmekte olan kıllı kökleri (D) ile ve kırmızı floresan dönüşümün işaretçisi DsRed (E) ifade gelişmiş kıllı kökleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. bitki A. tumefaciens (Şekil 2) kullanarak dönüştürme

Not: Bu prosedür dönüştürülmüş bitkilerin almak sağlanır. Transgene'nın etkisini değerlendirmek için bir negatif kontrol gereklidir. Bir seçenek ile boş vektör dönüştürülmüş bir A. tumefaciens kullanarak yordamı takip etmektir. Alternatif olarak, vahşi türü bitkiler kullanılabilir.

1. Keser ve bir yaprak (şekil 2A) 3-4-hafta-yaşlı bitkilerden bir kabında yerleştirir. Bir neşter kullanarak petiole dışlamak ve enine keser (yaprak boyutuna bağlı olarak 1-3) (şekil 2B) kesme kaçınarak kenarları yaprak Merkezi'nden yapmak.
2. Hemen taze 2MS üzerinde 10 mL sıvı bir petri abaxial tarafı ile medyada yukarı yüzen yaprak yerleştirmek ve plaka kapatın. İlâ 15 accomodating adım cv. özellikle yaprakları yineleyin ve 25 (yaprak boyutu) bağlı olarakndigena ssp. için bırakır.
3. Hemen A. tumefaciens kültürünün 80 µL OD₆₀₀ eklemek sıvı ortamda 0.8 = ve bakteriyel çözüm dağıtmak 1 dk için el ile plaka lunaparkçı.
4. Dikkatle film mühürleme ile mühür, alüminyum folyo ile kapatın ve 24 ° C'de ortaya dönüştürme izin için bir odasında 2 gün kuluçkaya.
5. CIM orta (şekil 2B) kadar abaxial yan tutmak yapraklarını aktarın ve onları bir hafta içinde bir büyüme kabine için kuluçkaya.
   1. Böylece yapraklar daha iyi medyada kalabileceği CIM orta cımbız ile kazı.
6. SIM orta (şekil 2C) kadar abaxial yan tutmak yapraklarını aktarın ve onları bir büyüme orta her 7-10 günde, sürgünler 2 cm boyunda olana yenileniyor kabine kuluçkaya.
   1. Böylece yapraklar tamamen medya tarafından çevrili olmak SIM orta cımbız ile kazı. Ortaya sürgünler kapağı ulaştığınızda, uzun boylu Petri yemekler ile çalışmak (100 x 20 mm, yükseklik x çapı).
      Not: 6-7 hafta (şekil 2E) sonra SIM orta (şekil 2B) ve sürgünler 2-3 hafta sonra Kallus oluşturacak. Çekimleri ne zaman onlar bağımsız yarasından oluşmuş Kallus ortaya bağımsız dönüşüm olayları olarak kabul edilecektir.
7. Kesme üç vuruyor ortaya çıktı (aynı dönüşüm olayı olarak kabul edilir) her Kallus (şekil 2E), onlara kültür şişeler MG orta ile sefotaksim sodyum [250 mg/L] ile izin vermek için takıma transfer destekliyorum, etiket alt bir sayı ile ve bir büyüme kabin 3-4 hafta için ya da sürgün dinç (şekil 2F) kadar kuluçkaya.
   Not: sürgün, kesme kaldırdığınızda de Kallus aksi takdirde kök oluşturacak değil.
   1. Olarak bağımsız satırları gerektiği kadar yineleyin. En fazla 5 farklı dönüştürme olayları farklı etkinlikler bitkilerden değil karışık tam güven içinde çalışmak için 8 cm çapında bir kültür şişesi yerleştirilebilir.
8. Her olay en güçlü bitki seçin, 3-4 internodes ile çekim apikal segment keser ve yeni bir kültür şişeye sefotaksim sodyum [250 mg/L] ile desteklenmiş 2MS orta ile yerleştirir.
   Not: 3-6 hafta içinde bitki verimli bir şekilde büyüyecek, güçlü bir çekim ve kökleri gelişmekte.
   1. Seçilen bitki tam olarak geliştirmiştir kadar seçili olmayan sürgünler odasına getir.
9. En az bir düğümler arası veya apikal bud ile bitki kök kesimleri kesme ve sefotaksim [250 mg/L] ile desteklenen yeni 2MS orta aktarabilirsiniz. Onları kabine büyüme kuluçkaya.
   1. Her 3-4 hafta dönüştürülmüş vitro hatları kurmak için çoğaltma.
      Not: Sefotaksim sodyum 2MS orta için en az üç sonraki transferler emin olmak için A. tumefaciensöldürmek için gereklidir; A. tumefaciens büyüme gözlem yapılırsa, daha sonra bitkiler tekrar sefotaksim sodyum ile desteklenmiş 2MS medyaya aktarmak.
10. Bitki fenotip karakterize etmek için bitkiler toprak tam onların karakterizasyonu için ya da suda kültür kök muayene için aktarmak.
    1. Toprakta yaymak ve kurulan satırları korumak için üretilen yumrular tutun.

Resim 2: patates elde etmek için zaman çizelgesi dönüştürülmüş A. tumefacienskullanarak bitkiler. Dönüşüm süreci ve bitkiler büyümek için sonraki adımları her aşamada ulaşmak için toplu hafta gösterilir. Farklı aşamalarında temsil edici görüntüleri tasvir: işlemi kullanarak başlatma (A) 3 - hafta eski vitro bitkilerin yaprakları, yaralı ve virüslü transferini CIM medya (B), ne zaman transfer yaprakları yaprakları SIM medya (C), yaralı alanların etrafında Kallus görselleştirme SIM medya (D), SIM medya (E) 9-11 hafta sonra ateş oluşumu ve (F) MG medyaya transfer ediliyor sonra sürgünler 2-3 hafta sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

5. hydroponic kültür

1. Hoagland'ın çözüm yarım strength için hazırlamak (0.5 x) (Tablo S2) 10 L kova.
2. Homojenliği ve uygun oksijen koşulları korumak için bir akvaryum pompası sokmak.
3. Karanlık koşullarda kökleri büyümeye alüminyum folyo ile kova duvarlarını kapsayacak.
4. Kök zarar kaçınarak, vitro bitkiler için hydroponic kültür aktarın.
   Not: kökleri mikroorganizma yayılması kuluçka sırasında dikkatli bir şekilde suya batırılır kökleri sallayarak önlemek için kalan herhangi bir vitro ortamda kaldırın.
5. Şeffaf film yeterli iklimlendirme ve büyüyen odasında kuluçkaya sağlamak bir sera gibi bitkilerle kapsar.
6. 3 gün sonra filmde delikler yapmak ve tamamen bir hafta sonra çıkarın.
7. Taze medya ile 10 günde değiştirin.

6. GUS histochemical muhabir gen tahlil

Not: bizim durumumuzda GUS analiz 2-3 hafta suda veya içinde vitrokökleri ile gerçekleştirildi.

1. Kökleri % 90'ı soğuk aseton (v/v) ile düzeltmek ve 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya.
2. Distile su ile iki yıkama gerçekleştirin.
3. Taze GUS çözüm (Tablo 1) Boyama ekleyin ve vakum uygulayın (-70 Pa) 20 dk için.
4. İçinde karanlık bir mavi renk görünene kadar veya 4 h için ışığa duyarlı GUS korumak için 37 ° C'de kuluçkaya.
   Not: Ferri ve ferrocyanide GUS çözümde varlığı reaksiyon ürünleri Difüzyon en aza indirmek ve daha kesin yerelleştirme sağlar.
   Dikkat: bir duman başlığı kullan ve toksik siyanür türevleri GUS çözüm (potasyum ferricyanide ve potasyum ferrocyanide) ele alırken koruyucu giysi giyin. GUS substrat ve elden çıkarma malzeme güvenli bir şekilde atılmalıdır.
5. Çözüm boyama GUS kaldırmak ve uygun kaplarda atın.
6. Etanol % 70 (v/v) ile iki yıkama gerçekleştirin.
7. Parlak alan mikroskop altında gözlemlemek.
   Not: boyama GUS için birkaç hafta stabil; Ancak, ilk haftasında GUS sinyal açıktır ve komşu hücrelerin içine daha az dağılır. Daha uzun depolama, tüp mühür ve 4 ° C'de depolayın

Tablo 1: GUS boyama çözüm tarifi.

Sonuçlar

Agrobacterium rhizogenes -patates dönüştürme aracılı

Bu makale, A. rhizogenes ile dönüştürülmüş kök elde etmek için adım adım yordam sunulur. Şekil 1 tamamen (üzerinden tam olarak gelişmiş kıllı kökleri edinmeye A. rhizogenes enjeksiyon) yaklaşık 5-6 hafta sürer yordamı, genel bir bakış sunar. O zaman, bitki b...

Tartışmalar

Patates, istikrarlı tam transgenik bitkiler elde etmek için en yaygın sistem eksojen etki kullanarak organogenesis gerektiren Agrobacterium tumefaciens suşları tarafından dönüştürme kullanır. Sigara-T-DNA vektör sıra²⁵entegre potansiyeline göre Agrobacterium protokolleri sahip olmasına rağmen bu metodoloji hala en kolay ve daha az pahalı patates bitkiler dönüştürmek kullanılabilir. Son yıl içinde A. rhizogenesilgi-aracılı dönüştürme transgen...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Panreac	1.310.071.21
Acetosyringone	Acros	115540050
Aquarium pump	Prodac	MP350
Autoclave	Ragpa Strelimatic
Bacteriological agar	Lab Conda	1800
BAP	Duchefa	B0904
Beef extract	Lab Conda	1700
Plant growing cabinet	Nuaire
Carbenicillin	Duchefa	C0109
Cefotaxime sodium	Duchefa	C0111
DMSO	Merck	1029310161
Ecotron infors	HT	29378
Ethanol	Merck	1,009,831,011
Falcon tube	Control tecnica	CFT011500
Ferricyanate	Sigma	101001081
Ferrocyanate	Sigma	100979088
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture	Apiglass	ref16
GA3	Sigma	G7645
Gamborg B5 media	Duchefa	G0210
Gelrite	Duchefa	G1101
Glucosa	Sigma	G5767
Kanamycin	Sigma	K1377
Leukopor tape	BSN Leukopor	BDF47467
Lupe	Wild-Heerbrugg	M420
Magnetic shaker	Agimatic	7000243
MES hydrate	Sigma	M2933-25G
MgSO4	Panreac	131404
Microscope	Olympus
Minufugue centrifugue 5415R	Eppendorf
Murashige and Skoog media	Duchefa	M0254.0050
Na2HPO4	Panreac	131679
NAA	Duchefa	N0903
NaCl	Panreac	131659
NaH2PO4	Sigma	58282
NightSea Stereo	SFA Moonting Adapter
Parafilm	Anorsa	PRFL-001-001
Peptone	Lab Conda	1616
Petri dishes (90 x 14)	Anorsa	200200
pHmetre	Crison
Phytotron	Inkoa	RFTI-R5485
Plant Agar	Duchefa	P1001
Refrigeratot	Liebherr Medline
Rifampicin	Duchefa	R0146
Spectinomycin	Sigma	59007
Spectrophotometer	Shimadzu
Square plates (120 x 120)	Deltalab	200204
Streptomycin	Sigma	S6501
Sucrose	Panreac	131621
Surgical blades	Swann-Morton	201
Surgical needle	NIPRO	015/0204
Triptone	Lab Conda	1612
Triton	Serva	37240
Unimax 1010 shaker	Heidolph
Vacuum	Dinko
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)	Biosynth	B-7398
Yeast extract	Lab Conda	1702.00
Zeatin riboside	Sigma	1001042850