חקירת שינויים Caecum Microbiota לאחר פציעה טראומטית במוח עכברים

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול לגרום לטשטוש פגיעה מוחית טראומטית באמצעות מכשיר הקשה לרוחב הכלי נקישה ואחריו אוסף של תוכן caecum לניתוח microbiome בטן.

Abstract

העלאת ראיות מראה כי הציר מיקרוביוטה-המוח-בטן ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות המוח. מספר מחקרים גם להדגים כי פציעות במוח טראומטי לגרום לשינויים במעיים מיקרוביוטה. עם זאת, מנגנונים המשמשים את הוויסות הדו-כיווני של ציר המוח-המעיים נותרים בלתי ידועים. כיום, מספר דגמים קיימים ללימוד השינויים מיקרוביוטה במעיים לאחר פגיעה מוחית טראומטית. לכן, המחקר המוצג משלב פרוטוקולים לגרימת נזק מוחי טראומטי באמצעות התקן כלי הקשה נוזל לרוחב וניתוח של דגימות caecum לאחר הפציעה עבור חקירת שינויים מיקרובידום הבטן. שינויים של הרכב המעיים מיקרוביוטה לאחר פגיעה מוחית טראומטית נקבעים באמצעות שינוי רצף של 16 s-rDNA. פרוטוקול זה מספק שיטה אפקטיבית ללימוד היחסים בין מיקרואורגניזמים בידור ופגיעה מוחית טראומטית.

Introduction

פגיעה מוחית טראומטית (tbi) היא בעיית בריאות הציבור העולמי והגורם המוביל למוות ונכות אצל מבוגרים צעירים^1,2. TBI גורמת למקרי מוות רבים מדי שנה, והניצולים חווים מגוון של לקויות פיזיות, פסיכיאטריות, רגשיות וקוגניטיביות. לכן, TBI הוא נטל כבד למשפחתו של המטופל ולמשאבי החברה. TBI מערבת הן את הפגיעה המוחית העיקרית המתרחשת בזמן הטראומה וכל פציעות מוחי משני המתפתחים שעות לחודשים לאחר הפציעה הראשונית. פגיעה מוחית משנית מתווכת על ידי כמה מפלים ביוכימיים, אשר אינם מזיקים רק למוח אלא גם יש השפעות שליליות משמעותיות על מערכות איברים שונים, כולל מערכת העיכול³.

כיום, ישנם שלושה דגמים כדי לגרום TBI בניסויים בבעלי חיים: פגיעה בכלי הקשה של נוזל, שליטה השפעה קורטיקלית (CCI), והאצת ירידה במשקל. פציעה לרוחב הכלי הקשה (LFPI) היא המודל הנפוץ ביותר להקמת פגיעה מוחית מפוזר (DAI)⁴. המכשיר מייצר פגיעה מוחית באמצעות כריתת גולגולת על ידי החלת דופק קצר של לחץ נוזלי על השכבה השלמה. הדופק נוצר על ידי השביתה של המטוטלת. LFPI היא שיטת מידול מתוכמת ולשליטה עבור מחקר TBI.

המיקרובידום מוגדר הגנום הקולקטיבי של כל המיקרואורגניזמים השוכנים בגוף האדם. חיידקים מעיים במיוחד לא רק לשחק תפקיד חשוב בהומאוסטזיס מעיים פונקציה אלא גם לווסת היבטים רבים של הפיזיולוגיה המארחת ותפקוד של איברים אחרים⁵. בשנים האחרונות, יש הגדלת ראיות המציינת כי מיקרוביוטה המעיים להסדיר את התפתחות המוח ותפקוד באמצעות צירי המוח-בטן⁶. השיבוש של המעיים מיקרוביוטה נקשר להפרעות בתפקוד המוח כולל מחלת פרקינסון, הפרעות במצב הרוח, ואוטיזם⁷. לאחרונה, מחקרים פרה-קליניים דיווחו גם כי פגיעה במוח חריפה יכול לגרום לשינויים במעיים microbiota^8,9.

מחקר של Treangen ואח '¹⁰ מצאו ירידה משמעותית בשלושה מינים מיקרוביאלית וגדל בשני מינים מיקרוביאלית אחרי tbi המושרה של CCI. הוכחה זו מצביעה על כך שאפנון של מיקרוביוטה עשוי להיות שיטה טיפולית בניהול TBI. עם זאת, המנגנונים המשמשים לפגיעה במוח המושרה שינויים מיקרוביוטה עדיין לא ידוע. מסיבה זו, מודל פשוט ויעיל יחסית של לימוד השינויים במעיים מיקרוביוטה לאחר TBI נדרש. לכן, המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול לבחון שינויים במעיים מיקרוביוטה לאחר TBI בעכברים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה הניסיונית לאתיקה בעלי חיים של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג. כל המכשירים והחומרים המשמשים בניתוח הם עקרים. התהליך של המשך. לוקח בערך 20 דקות

1. טיפול בבעלי חיים

1. השתמש 5 עד 6-שבוע בן זכר C57BL/6J עכברים (20-25 g של משקל) בניסוי זה.
2. לשמור על עכברים על מחזור אור/12 h 12/כהה, ולוודא שהם מקבלים מזון ומים libitum המודעה. לספק את אותם כמויות של מזון ומים הן קבוצות הדמה ו TBI במהלך המחקר.
3. לעשות את כל המאמצים כדי למזער את הכאב בעלי חיים ואי נוחות.

2. אינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית

1. הזרקת קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג)/xylazine (10 מ"ג/ק"ג) IP עבור הרדמה. בדוק את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס העין או רפלקס הכאב. השתמש בדמעות מלאכותיות או משחה עין סיכה כדי לשמור על העיניים מפני ייבוש.
2. לאחר הרדמה, לשים את העכבר בתנוחה נוטה. השתמש במשטח חימום מבוקר טמפרטורה כדי לשמור על הטמפרטורה ב-37 ° c במהלך הניתוח ובמשך 30 דקות אחרי TBI.
3. . תגלח את השיער באזור החתך
4. לחטא את הקרקפת עם 70% אתנול באמצעות שלושה חלוקים לסירוגין, ולאחר מכן בטעות את הקרקפת במישור משונן.
5. השתמש מלקחיים לסגת את החתך משני הצדדים ולהפריד את קרום החזה מעט.
6. השתמש בסמן כדי לצייר מעגל (3 מ"מ קוטר) על האזור הקודקודית הימנית של הגולגולת, 2 מ"מ הרחק מקו האמצע.
7. לקדוח את הגולגולת עם מקדחה חשמלית. ודא ששלב זה מופעל בזהירות כדי להגן על השכבה הפגומה.
8. הסירו את כנף העצם וחשפו חלון עצם קטן (3 מ"מ קוטר).
9. מניחים צינורית של פציעה מפלסטיק (קוטר פנימי = 2.5 מ"מ, אורך = 8 מ"מ) על פתיחת הגולגולת ובטון הצינורית לגולגולת באמצעות אקריליק שיניים.
10. מלא את הצינורית בעזרת מזרק (5 מ ל) 0.9 סטרילי (מתמיסת מלח רגילה) המשתמשת במזרק (3 מ"ל) כדי להבטיח שאין בועות בצינורית.
11. הפעילו את האולוסקופ ואת המגבר והקפידו שצינור הלחץ הגבוה של פציעת ההקשה בנוזל הרוחבי (LFPI) יהיה חופשי מבועות האוויר. בדוק את המכשיר על ידי אספקת כ 10 פולסים עד שהוא נותן אות קבוע. כוונן את זווית מיקום המטוטלת כדי להגיע לעוצמת פעימה של כ-2.0 כספומט.
12. חברו את צינורית הפציעה להתקן LFPI. לגרום לפגיעה במוח על ידי משיכת ההדק ושחרור המטוטלת. לאחר מכן, השיגו דופק והעבר אותו לדורא דרך מערכת האבובים המלאה בנוזלים.
13. להפעיל את העכברים בקבוצה המזויף עם הליך כירורגי זהה. אל תבצע את ה-LFPI.

3. טיפול לאחר ניתוח

1. לאחר גרימת פגיעה במוח, הסר את צינורית הפלסטיק ותפר את החתך. במהלך הניתוח מנהל בופרינורטין (2mg/ק"ג) מ"ר או IP ולאחר מכן כל 6-12 h במשך שלושה ימים.
2. הנח את העכבר על משטח חימום עד שהוא אמבולטורי. הגדר את הטמפרטורה של משטח החימום כדי 37 ° צ' כדי להאיץ החייאה הרדמה.
3. לשים את העכבר בכלוב ולנהל מזון ומים libitum המודעה.

4. לפרוטומיה ואוסף דגימות מהcaecum

1. המתת חסד העכברים על ידי CO₂ ואחריו פריקה צוואר הרחם על נקודות הזמן המתאימות.
   הערה: בניסוי זה, נקודות הזמן שנבחרו היו 1 h, 6 h, 1 d, 3 ד, ו -7 ד פוסט טראומטי פגיעה במוח כדי לנתח את האבולוציה הדינמית של מיקרוביוטה בטן.
2. להסיר את השיער מפני השטח של הבטן. לחטא את הבטן עם 70% אתנול.
3. מניחים את העטוף הסטרילי על העכבר. לחתוך את הבטן התחתונה באמצע, ממש מעל הראש בעכברים הזכרים.
4. לאחר חשיפת המעיים, אתרו את המעי הסטום והפרידו אותו בעדינות מפני מעיים אחרים. הימנע אוחז את מעי עם שיניים או מלקחיים חדים. השתמש במלקחיים מרועטיים, כגון מלקחיים של אדסון בסרפי.
5. חותכים את הקסטה. עם מספריים חדים
6. לחלץ את התוכן caecum באופן ידני על ההלבשה סטרילי ולאחסן את התוכן בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
7. אחסן את תוכן caecum בשעה-80 ° c עד ניתוח מיקרובידום.

5. הפקת דנ א ו-16S-rDNA ניתוח נתונים

1. בידוד של דנ א מצואה
   הערה: ערכת בידוד DNA זמינה מסחרית (טבלת חומרים) שימש לניסוי זה.
   1. השתמש אזמל כדי לגרד 300 מ"ג של צואה בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL ומניחים את השפופרת על הקרח.
   2. הוסף 1 מ ל של מאגר מעכב לכל דוגמה. מערבולת ברציפות במשך 1 דקות או עד דגימת צואה הוא הומוגניים ביסודיות.
   3. צנטריפוגה את המדגם במהירות המקסימלית עבור 1 דקות כדי לצנפה את חלקיקי הצואה.
   4. פיפטה 2 μL של מחקר. לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש Pipet 600 μL של supernatant משלב 5.1.3 לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל המכילים פרוטטינואז K. לאחר מכן, להוסיף 600 μL של מאגר 1 ו מערבולת עבור 15 s.
   5. מודקון את המדגם ב 70 ° c עבור 10 דקות.
   6. הוסף 600 μL של 100% אתנול לליפוסט (1:1 יחס) ו לערבב על ידי vortexing. צנטריפוגה במהירות המקסימלית לזמן קצר כדי להסיר טיפות מתוך מכסה הצינור.
   7. החל 600 μL של הליפוסט לעמודת הסחרור. צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 1 דקות. למחוק את הזרימה. . חזור על השלב הזה עוד פעם אחת לאחר מכן, העבר את העמודה לצינור אוסף חדש של 2 מ"ל.
   8. פתח את עמודת הספין והוסף 500 μL של מאגר 2. צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 1 דקות. הסר את העמודה והציבו אותו בשפופרת אוסף חדשה של 2 מ"ל.
   9. הוסף 500 μL של מאגר 3 לתוך העמודה. צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 3 דקות. למחוק את הזרימה. חזור על התהליך הצנטריפוגה פעם אחת כדי להבטיח את מאגר 3 הוא חומק לחלוטין.
   10. מניחים את עמודת הספין לתוך צינור חדש 2 מ ל צינור ופיפטה 200 μL של מאגר 4 ישירות על הקרום. מודטה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 1 דקות כדי להייוט DNA.
2. שנות הרצף וניתוח נתונים של 16S-rDNA
   1. השתמש 20-30 ng של DNA כדי ליצור הגברה.
   2. השתמש בצבעי יסוד זמינים מסחריים המיועדים לאזורים שאינם שמרו יחסית, הגובלים באזורי ההיפר-משתנים של V3 ו-V4 של חיידקים 16S rDNA. שימשו את הרצף הקדמי המכיל את "הסדרה" CCTACGGRGVGAAT "והפוך את התחל המכיל את הרצף" GGACTACNCGGGTWCC "במחקר הנוכחי.
   3. הפוך את התגובות PCR לתערובת על ידי הוספת 2.5 μL של מאגר 1, 2 μL של dNTPs, 1 μL של כל פריימר, 0.5 μL של DNA פולימראז, ו 20 ng של DNA תבנית בשפופרת. השתמש ddH₂O כדי לכוונן את מערכת התגובה 25 μl.
   4. הגדר את הפרמטרים של תגובת ה-PCR כדלקמן: בצע את הקדם-הדנטורציה ב-94 ° צ' למשך 3 דקות פעם אחת. לבצע דנטורציה ב 94 ° c עבור 5 s, לספח ב 57 ° צ' עבור 90 s, להאריך ב 72 ° צ' עבור 10 s, ולחזור על זה 24x.
   5. בצע ברצף מזווג PE250/300 בהתאם להוראה של היצרן ולהשתמש QIIME ניתוח נתונים חבילת עבור ניתוח נתונים rRNA של 16S.
      הערה: בניסוי זה, רצפי DNA וניתוח נתונים נעשו בעיקר על ידי החברה רצף מקצועי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הקמת TBI מופיעה באיור 1. לאחר הרדמה חיטוי, הקרקפת היה מsagittally (איור 1A). פתיחת גולגולת (בקוטר 3 מ"מ) הייתה מחוגלת לתוך הגולגולת על קליפת המוח הימנית עם מקדחה חשמלית, השכבה הייתה שלמה (איור 1B, C). מעבר לחלון העצם הונחה צינורי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מוצג כאן הוא פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לקבוע שינויים במיקרוביוטה cecal לאחר TBI בעכברים. אינדוקציה של פגיעה מוחית ואיסוף של דגימות תוכן caecum הם חלקים קריטיים של הפרוטוקול.

למרות החוקרים לאחר שחקרו את השינויים של מיקרוביוטה בטן בעקבות TBI, הפגיעה במוח המשמש במחקרים אלה היו CCI-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA isolation kit	QIAGEN	51604	For fast purification of genomic DNA from stool samples
Gene analysis service	GENEWIZ		Gene analyse service
Heating pad	Shanghai SAFE Biotech Co.	TR-200	heating pad
Injector	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		injector
LFPI device	Virginia Commonwealth University	FP302	LFPI device
Micro cranial drill	RWD Life Science	78061	Micro cranial drill
Povidone Iodine	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		Povidone Iodine