Farelerde Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Caecum Mikrobiyotasında Ki Değişikliklerin Araştırılması

Özet

Burada sunulan bir protokol bağırsak mikrobiyom analizi için caecum içeriğinin toplanması takip bir lateral sıvı perküsyon cihazı kullanarak diffüz travmatik beyin hasarı neden olur.

Özet

Artan kanıtlar mikrobiyota-bağırsak-beyin ekseninin beyin hastalıklarının patogenezinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Çeşitli çalışmalar da travmatik beyin yaralanmaları bağırsak mikrobiyota değişikliklere neden olduğunu göstermektedir. Ancak beyin-bağırsak ekseninin çift yönlü düzenlenmesinin altında yatan mekanizmalar bilinmemektedir. Şu anda, birkaç model travmatik beyin hasarı sonrası bağırsak mikrobiyota değişiklikleri incelemek için var. Bu nedenle, sunulan çalışma, bir lateral sıvı perküsyon cihazı ve bağırsak mikrobiyom değişiklikleri araştırmak için yaralanma aşağıdaki kaecum örneklerinin analizi kullanarak travmatik beyin hasarı indükleyen protokolleri birleştirir. Travmatik beyin hasarı sonrası bağırsak mikrobiyota bileşiminde yapılan değişiklikler 16S-rDNA dizilimi kullanılarak belirlenir. Bu protokol enterik mikroorganizmalar ve travmatik beyin hasarı arasındaki ilişkileri incelemek için etkili bir yöntem sağlar.

Giriş

Travmatik beyin hasarı (TBI) küresel bir halk sağlığı sorunu ve genç erişkinlerde ölüm ve sakatlık önde gelen nedeni^1,2. TBI her yıl birçok ölüme neden olur ve hayatta kalanlar çeşitli fiziksel, psikiyatrik, duygusal ve bilişsel engellerle karşılaşır. Bu nedenle, TBI bir hastanın aile ve toplumsal kaynaklar için ağır bir yüktür. TBI travma sırasında meydana gelen birincil beyin hasarı ve ilk yaralanma dan sonra ay saat geliştirmek herhangi bir ikincil beyin yaralanmaları içerir. İkincil beyin hasarı birkaç biyokimyasal basamaklar tarafından aracılık edilir, hangi sadece beyne zararlı değil, aynı zamanda çeşitli organ sistemleri üzerinde önemli olumsuz etkileri vardır, gastrointestinal sistem de dahil olmak üzere³.

Şu anda, hayvan deneylerinde TBI ikna etmek için üç model vardır: sıvı perküsyon yaralanması, kontrol kortikal etkisi (CCI), ve ağırlık düşme ivme. Lateral sıvı perküsyon hasarı (LFPI) yaygın beyin hasarı kurmak için en sık kullanılan modeldir (DAI)⁴. Cihaz bozulmamış dura kısa bir sıvı basıncı darbe uygulayarak bir kraniektomi yoluyla beyin hasarı üretir. Bu nabız sarkaç darbe tarafından oluşturulur. LFPI, TBI araştırmaları için tekrarlanabilir ve kontrol edilebilir bir modelleme yöntemidir.

Mikrobiyom, insan vücudunda bulunan tüm mikroorganizmaların kolektif genomları olarak tanımlanır. Özellikle bağırsak mikropları sadece bağırsak homeostazve fonksiyonu önemli bir rol oynamak değil, aynı zamanda konak fizyolojisi ve diğer organların işleyişi birçok yönünü düzenleyen⁵. Son yıllarda, bağırsak mikrobiyota beyin-bağırsak^eksenleri6 ile beyin gelişimi ve fonksiyonu düzenleyen gösteren kanıtlar artmaktadır. Bağırsak mikrobiyota bozulması Parkinson hastalığı, duygudurum bozuklukları da dahil olmak üzere çeşitli beyin fonksiyon bozuklukları ile bağlantılı olmuştur, ve otizm⁷. Son zamanlarda, preklinik çalışmalar da akut beyin hasarı bağırsak mikrobiyota değişiklikleri neden olabilir bildirdin^8,9.

Treangen ve ark.¹⁰ tarafından yapılan bir çalışmada, CCI'ye bağlı TBI'den sonra üç mikrobiyal türde önemli azalmalar ve iki mikrobiyal türde artış saptandı. Bu kanıt bağırsak mikrobiyota modülasyonu TBI yönetiminde tedavi yöntemi olabileceğini göstermektedir. Ancak, beyin hasarına bağlı bağırsak mikrobiyota değişiklikleri altında yatan mekanizmalar bilinmemektedir. Bu nedenle, TBI sonra bağırsak mikrobiyota değişiklikleri çalışma nispeten basit ve verimli bir model gereklidir. Bu nedenle, bu çalışma farelerde TBI sonra bağırsak mikrobiyota değişiklikleri incelemek için bir protokol sunuyor.

Protokol

Yapılan tüm işlemler Zhejiang Üniversitesi Deneysel Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Cerrahide kullanılan tüm alet ve malzemeler sterildir. TBI proceudre yaklaşık 20 dakika sürer.

1. Hayvan bakımı

1. Bu deneyde 5-6 haftalık erkek C57BL/6J fareler (20-25 g ağırlık) kullanın.
2. Fareleri 12 saat açık/karanlık bir döngüde koruyun ve yiyecek ve su reklamı libitum aldıklarından emin olun. Çalışma boyunca hem sham hem de TBI gruplarına aynı miktarda yiyecek ve su sağlayın.
3. Hayvan ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için tüm çabayı gösterin.

2. Travmatik beyin hasarıin indüksiyonu

1. Anestezi için Ketamin (80-100 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg) IP enjekte edin. Bir göz refleksi veya ağrı refleksi kullanarak anestezi derinliğini test edin. Gözlerin kurumasını engellemek için yapay gözyaşı veya yağlayıcı göz merhemi kullanın.
2. Anesteziden sonra fareyi yatkın bir konuma getirin. Ameliyat sırasında ve TBI'den sonra 30 dakika boyunca sıcaklığı 37 °C'de tutmak için sıcaklık kontrollü bir ısıtma yastığı kullanın.
3. Kesi bölgesinin saçını tıraş edin.
4. Üç alternatif scrubs kullanarak% 70 etanol ile kafa derisi dezenfekte, sonra bir sagital düzlemde kafa derisi eğim.
5. Her iki taraftaki kesiği geri çekmek ve periostu biraz ayırmak için forseps kullanın.
6. Kafatasının sağ parietal bölgesinde, orta hattan 2 mm uzaklıkta bir daire (3 mm çapında) çizmek için bir işaretleyici kullanın.
7. Kafatasını elektrikli matkapla delin. Durayı hasar görmemesi için bu adımın dikkatle çalıştırıldığından emin olun.
8. Kemik kapağını çıkarın ve küçük bir kemik penceresini (3 mm çapında) ortaya çıkarın.
9. Kraniyotomi üzerine plastik bir yaralanma kanül (iç çap = 2,5 mm, uzunluk = 8 mm) yerleştirin ve bir diş akrilik kullanarak kafatasına kanül çimento.
10. Kanülde kabarcık olmadığından emin olmak için bir şırınga (5 mL) kullanarak kanülünü steril %0,9 NaCl (normal tuzlu) ile doldurun.
11. Osiloskopve amplifikatör açın ve yanal sıvı perküsyon yaralanması (LFPI) cihazın yüksek basınç tüpü hava kabarcıkları ücretsiz olduğundan emin olun. Sabit bir sinyal verene kadar yaklaşık 10 darbe vererek cihazı test edin. Yaklaşık 2,0 atm darbe yoğunluğuna ulaşmak için sarkaç başlangıç konumunun açısını ayarlayın.
12. Yaralanma kanülünü LFPI cihazına bağlayın. Tetiği çekerek ve sarkaç bırakarak beyin hasarına neden olur. Daha sonra, bir darbe almak ve tüm kapalı sıvı dolu tüp sistemi ile dura iletin.
13. Aynı cerrahi işlem ile sahte grupta fareler çalıştırın. LFPI'yi gerçekleştirmeyin.

3. Ameliyat sonrası tedavi

1. Beyin hasarı na neden olduktan sonra, plastik kanül kaldırmak ve kesi dikiş. Ameliyat sırasında buprenorfin (2mg/kg) SQ veya IP ve bundan sonra her 6-12 saat üç gün boyunca uygulayın.
2. Fareyi bir ısıtma yastığının üzerine ambulatuar olana kadar yerleştirin. Anestezik resüsitasyonu hızlandırmak için ısıtma yastığının sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
3. Fareyi kafese geri koyun ve yiyecek ve su reklamı libitumuygulayın.

4. Laparotomi ve caecum dan örnek toplama

1. Fareleri CO₂ ile ötenazi ve ardından ilgili zaman noktalarında servikal çıkış.
   NOT: Bu deneyde, seçilen zaman noktaları bağırsak mikrobiyotasının dinamik evrimini analiz etmek için 1 saat, 6 saat, 1 d, 3 d ve 7 d travma sonrası beyin hasarıidi.
2. Karın yüzeyinden saç çıkarın. Karın bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.
3. Farenin üzerine steril bir perde yerleştirin. Alt karın orta hattından bir kesi yapın, erkek farelerde prepuce hemen üzerinde.
4. Bağırsaklar maruz kaldıktan sonra, çekum bulmak ve yavaşça diğer bağırsak yollarından ayırdı. Dişli veya keskin forceps ile çekum kavramakaçının. Serasyonlu Adson forceps gibi atravmatik forceps kullanın.
5. Keskin makas ile caecum kesin.
6. Caecum içeriğini steril pansuman üzerine elle ayıklayın ve içindekileri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte saklayın.
7. Mikrobiyom analizine kadar caecum içeriğini -80 °C'de saklayın.

5. DNA çıkarma ve 16S-rDNA dizilemesi ve veri analizi

1. DNA'nın dışkıdan izolasyonu
   NOT: Bu deney için ticari olarak kullanılabilen BIR DNA izolasyon kiti(Malzeme Tablosu)kullanılmıştır.
   1. 2 mL mikrosantrifüj tüp içinde dışkı 300 mg kazımak ve buz üzerinde tüp yerleştirmek için bir neşter kullanın.
   2. Her numuneye 1 mL inhibe arabelleği ekleyin. Girdap sürekli olarak 1 dk veya dışkı numunesi iyice homojenleşene kadar.
   3. Dışkı parçacıklarını peletlemek için numuneyi maksimum hızda 1 dakika santrifüj edin.
   4. Yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüp içine proteinaz K Pipet 2 μL. 5.1.3 adımdan proteinaz K içeren 2 mL mikrosantrifüj tüpüne süpernatantın 600 μL'si. Daha sonra, 15 s için Tampon 1 ve girdap 600 μL ekleyin.
   5. Numuneyi 70 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
   6. Lysate'ye %100 etanol (1:1 oran) ekleyin ve girdap ile karıştırın. Tüp kapağının içinden damlaları çıkarmak için kısa bir süre maksimum hızda santrifüj.
   7. Spin sütununa 600 μL lysate uygulayın. 1 dk. Maksimum hızda santrifüj. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Ardından, sütunu yeni bir 2 mL toplama tüpüne aktarın.
   8. Dönüş sütununa açın ve 500 μL Arabellek 2 ekleyin. 1 dk. Maksimum hızda santrifüj sütunu çıkarın ve yeni bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin.
   9. Sütuna 500 μL Arabellek 3 ekleyin. 3 dk. Akış-through atın maksimum hızda santrifüj. Arabellek 3'ün tamamen eluted olduğundan emin olmak için santrifüj işlemini bir kez tekrarlayın.
   10. Spin kolonu yeni bir tüp 2 mL toplama tüpüne ve pipet 200 μL Tampon 4'ü doğrudan membrana yerleştirin. Oda sıcaklığında 1 dakika (RT) için kuluçka, sonra DNA'yı ejeketmek için 1 dakika maksimum hızda santrifüj.
2. 16S-rDNA dizilimi ve veri analizi
   1. Amplikonoluşturmak için 20-30 ng DNA kullanın.
   2. Bakteri 16S rDNA V3 ve V4 hiperdeğişken bölgeleri sınırsınırları nispeten korunmuş bölgeler için tasarlanmış ticari olarak kullanılabilir astar kullanın. Bu çalışmada "CCTACGGRRBGBGCACaGKVRVGAAT" dizisini içeren ileri astarlar ve "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC" dizisini içeren ters astarlar kullanılmıştır.
   3. Bir tüpe 2,5 μL Tampon 1, 2 μL dNTPs, her astar1 μL, 0,5 μL DNA polimeraz ve 20 ng şablon DNA ekleyerek PCR reaksiyonları karışımını yapın. Reaksiyon sistemini 25 μL'ye ayarlamak için ddH₂O'yu kullanın.
   4. PCR reaksiyon parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: 94 °C'de ön denatürasyonu bir kez 3 dk gerçekleştirin. Denatürasyon 5 s için 94 °C'de, 57 °C'de 90 s için anneal yapın, 72°C'de 10 s'de uzatın ve bu 24x'i tekrarlayın.
   5. Pe250/300 eşleştirilmiş uçlu sıralamayı üreticinin talimatına göre gerçekleştirin ve 16S rRNA veri analizi için QIIME veri analizi paketini kullanın.
      NOT: Bu deneyde DNA dizilimi ve veri analizi öncelikle profesyonel bir sıralama şirketi tarafından yapılmıştır.

Sonuçlar

TBI'nin kuruluşu Şekil 1'degösterilmiştir. Anestezi ve dezenfeksiyondan sonra kafa derisi sagittally kesilirdi (Şekil 1A). Bir kraniotomi (3 mm çapında) bir elektrikli matkap ile sağ parietal korteks üzerinde kafatası içine trephined, dura bozulmadan tutuldu(Şekil 1B,C). Plastik bir yaralanma kanül kemik penceresi üzerine yerleştirildi ve diş akrilik kullanılarak kaf...

Tartışmalar

Burada sunulan farelerde TBI sonra cekal mikrobiyota değişiklikleri belirlemek için basit ve verimli bir protokoldür. Beyin hasarının indüksiyonu ve caecum içerik örneklerinin toplanması protokolün kritik parçalarıdır.

Araştırmacılar TBI aşağıdaki bağırsak mikrobiyota değişiklikleri incelediolmasına rağmen, Bu çalışmalarda kullanılan beyin hasarı CCI-8 ve kilo damla / darbe kaynaklı modeller⁹. Ancak, CCI modeli ço...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA isolation kit	QIAGEN	51604	For fast purification of genomic DNA from stool samples
Gene analysis service	GENEWIZ		Gene analyse service
Heating pad	Shanghai SAFE Biotech Co.	TR-200	heating pad
Injector	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		injector
LFPI device	Virginia Commonwealth University	FP302	LFPI device
Micro cranial drill	RWD Life Science	78061	Micro cranial drill
Povidone Iodine	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		Povidone Iodine