Untersuchung von Veränderungen in Caecum Microbiota nach traumatischen Hirnverletzungen bei Mäusen

Zusammenfassung

Präsentiert hier ist ein Protokoll, um diffuse traumatische Hirnverletzungen mit einem lateralen Fluid Percussion-Gerät gefolgt von der Sammlung des Caecum-Gehalts für Darm-Mikrobiom-Analyse induzieren.

Zusammenfassung

Zunehmende Erkenntnisse zeigen, dass die Mikrobiota-Darm-Gehirn-Achse eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Hirnerkrankungen spielt. Mehrere Studien zeigen auch, dass traumatische Hirnverletzungen Veränderungen der Darmmikrobiota verursachen. Jedoch, Mechanismen, die der bidirektionalen Regulation der Gehirn-Darm-Achse zugrunde liegen, bleiben unbekannt. Derzeit gibt es nur wenige Modelle für die Untersuchung der Veränderungen in Darm-Mikrobiota nach traumatischen Hirnverletzungen. Daher kombiniert die vorgestellte Studie Protokolle zur Induktion traumatischer Hirnverletzungen mit einem lateralen Fluid Percussion-Gerät und die Analyse von Caecum-Proben nach Verletzungen zur Untersuchung von Veränderungen im Darmmikrobiom. Veränderungen der Darmmikrobiotazusammensetzung nach traumatischen Hirnverletzungen werden mittels 16S-rDNA-Sequenzierung bestimmt. Dieses Protokoll bietet eine effektive Methode zur Untersuchung der Beziehungen zwischen enterischen Mikroorganismen und traumatischen Hirnverletzungen.

Einleitung

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind ein globales Problem der öffentlichen Gesundheit und die häufigste Todesursache bei jungen Erwachsenen^1,2. TBI verursacht jedes Jahr viele Todesfälle, und Überlebende erleben eine Vielzahl von körperlichen, psychiatrischen, emotionalen und kognitiven Behinderungen. Daher ist TBI eine schwere Belastung für die Familiären und gesellschaftlichen Ressourcen eines Patienten. TBI beinhaltet sowohl die primäre Hirnverletzung, die zum Zeitpunkt des Traumas auftritt, als auch alle sekundären Hirnverletzungen, die Stunden bis Monate nach einer anfänglichen Verletzung entstehen. Sekundäre Hirnverletzungen werden durch mehrere biochemische Kaskaden vermittelt, die nicht nur schädlich für das Gehirn sind, sondern auch erhebliche negative Auswirkungen auf verschiedene Organsysteme haben, einschließlich des Magen-Darm-Systems³.

Derzeit gibt es drei Modelle, um TBI in Tierversuchen zu induzieren: Flüssigkeitspercussion-Verletzung, Kontrolle kortikaler Auswirkungen (CCI) und Gewichtsabnahmebeschleunigung. Lateral Fluid Percussion Injury (LFPI) ist das am häufigsten verwendete Modell, um diffuse Hirnverletzungen (DAI) zu etablieren⁴. Das Gerät verursacht Hirnverletzungen durch eine Kraniektomie, indem es einen kurzen Flüssigkeitsdruckimpuls auf die intakte Dura aufträgt. Dieser Impuls entsteht durch den Schlag des Pendels. LFPI ist eine reproduzierbare und kontrollierbare Modellierungsmethode für die TBI-Forschung.

Das Mikrobiom ist definiert als das kollektive Genom aller Mikroorganismen, die sich im menschlichen Körper befinden. Insbesondere Darmmikroben spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei der Darmhomöostase und Funktion, sondern regulieren auch viele Aspekte der Wirtsphysiologie und der Funktion anderer Organe⁵. In den letzten Jahren, Es gibt zunehmend Hinweise, die darauf hindeuten, dass Darm-Mikrobiota reguliere Gehirnentwicklung und Funktion über Gehirn-Darm-Achsen⁶. Störung der Darmmikrobiota wurde mit mehreren Gehirnfunktionsstörungen einschließlich Parkinson-Krankheit, affektive Störungen, und Autismus⁷verbunden. Kürzlich, präklinische Studien haben auch berichtet, dass akute Hirnverletzungen Veränderungen in der Darmmikrobiota^induzierenkönnen 8^,9.

Eine Studie von Treangen et al.¹⁰ fand signifikante Abnahmen bei drei mikrobiellen Arten und Erhöht bei zwei mikrobiellen Arten nach CCI-induziertem TBI. Diese Beweise deuten darauf hin, dass die Modulation von Darmmikrobiota eine therapeutische Methode im TBI-Management sein kann. Jedoch, die Mechanismen zugrunde Hirnverletzung-induzierte Darm-Mikrobiota Veränderungen bleiben unbekannt. Aus diesem Grund ist ein relativ einfaches und effizientes Modell zur Untersuchung der Veränderungen der Darmmikrobiota nach TBI erforderlich. Daher präsentiert die vorliegende Studie ein Protokoll zur Untersuchung von Veränderungen in Darmmikrobiota nach TBI bei Mäusen.

Protokoll

Alle durchgeführten Verfahren wurden von der Experimental Animal Ethics Committee der Zhejiang University genehmigt. Alle Instrumente und Materialien, die in der Chirurgie verwendet werden, sind steril. Das TBI-Proceudre dauert ca. 20 Minuten.

1. Tierpflege

1. Verwenden Sie 5- bis 6 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse (20-25 g Gewicht) in diesem Experiment.
2. Halten Sie Mäuse auf einem 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus, und stellen Sie sicher, dass sie Nahrung und Wasser ad libitum erhalten. Stellen Sie die gleichen Mengen an Nahrung und Wasser sowohl für die Schein- als auch für die TBI-Gruppe während der gesamten Studie bereit.
3. Machen Sie alle Anstrengungen, um die Schmerzen und Beschwerden der Tiere zu minimieren.

2. Induktion traumatischer Hirnverletzungen

1. Injektion Ketamin (80-100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) IP zur Anästhesie. Testen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Augenreflex oder Schmerzreflex. Verwenden Sie künstliche Tränen oder Schmiermittel Augensalbe, um die Augen vor dem Trocknen zu halten.
2. Nach der Anästhesie, setzen Sie die Maus in anfällige Position. Verwenden Sie ein temperaturgeregeltes Heizkissen, um die Temperatur während der Operation und 30 min nach TBI bei 37 °C zu halten.
3. Rasieren Sie die Haare des Schnittbereichs.
4. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 70% Ethanol mit drei abwechselnden Peelings, dann incise die Kopfhaut in einer sagittalen Ebene.
5. Verwenden Sie Zangen, um den Einschnitt auf beiden Seiten zurückzuziehen und das Periost leicht zu trennen.
6. Verwenden Sie einen Marker, um einen Kreis (3 mm Durchmesser) auf dem rechten parietalen Bereich des Schädels, 2 mm von der Mittellinie entfernt, zu zeichnen.
7. Bohren Sie den Schädel mit einem elektrischen Bohrer. Stellen Sie sicher, dass dieser Schritt sorgfältig durchgeführt wird, um die Dura vor Beschädigungen zu schützen.
8. Entfernen Sie die Knochenklappe und legen Sie ein kleines Knochenfenster (3 mm Durchmesser) zur Bedeckung.
9. Legen Sie eine Plastikverletzungskanüle (Innendurchmesser = 2,5 mm, Länge = 8 mm) über die Kraniotomie und zementieren Sie die Kanüle mit einem Zahnacryl zum Schädel.
10. Füllen Sie die Kanüle mit sterilen 0,9% NaCl (normale Saline) mit einer Spritze (5 ml), um sicherzustellen, dass es keine Blasen in der Kanüle.
11. Schalten Sie das Oszilloskop und den Verstärker ein und stellen Sie sicher, dass das Hochdruckrohr der LFPI-Vorrichtung (Lateral Fluid Percussion Injury) frei von Luftblasen ist. Testen Sie das Gerät, indem Sie etwa 10 Impulse liefern, bis es ein stetiges Signal aussendet. Stellen Sie den Winkel der Pendelstartposition so ein, dass eine Pulsintensität von etwa 2,0 atm erreicht wird.
12. Schließen Sie die Verletzungskanüle an das LFPI-Gerät an. Induzieren Sie Hirnverletzungen, indem Sie den Auslöser ziehen und das Pendel loslassen. Dann erhalten Sie einen Impuls und übertragen Sie ihn über das gesamte geschlossene, mit Flüssigkeit gefüllte Schlauchsystem an die Dura.
13. Betreiben Sie die Mäuse in der Scheingruppe mit dem gleichen chirurgischen Verfahren. Führen Sie den LFPI nicht aus.

3. Post-Chirurgie-Behandlung

1. Nach der Induktion der Hirnverletzung, entfernen Sie die Kunststoffkanüle und Verschließen Sie den Schnitt. Während der Operation verabreichen Buprenorphin (2mg/kg) SQ oder IP und danach alle 6-12 h für drei Tage.
2. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis es ambulant ist. Stellen Sie die Temperatur des Heizkissens auf 37 °C ein, um die Anästhesiezung zu beschleunigen.
3. Legen Sie die Maus wieder in den Käfig und verabreichen Sie Nahrung und Wasser ad libitum.

4. Laparotomie und Probensammlung aus dem Caecum

1. Euthanisieren Sie die Mäuse durch CO_2, gefolgt von zervikalen Dislokationen zu den entsprechenden Zeitpunkten.
   HINWEIS: In diesem Experiment waren die ausgewählten Zeitpunkte 1 h, 6 h, 1 d, 3 d und 7 d posttraumatische Hirnverletzungen, um die dynamische Entwicklung der Darmmikrobiota zu analysieren.
2. Entfernen Sie das Haar von der Oberfläche des Bauches. Desinfizieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
3. Legen Sie einen sterilen Vorhang über die Maus. Machen Sie einen Schnitt von der unteren Bauchmittellinie, knapp über der Präbiss in den männlichen Mäusen.
4. Nachdem der Darm exponiert ist, lokalisieren Sie das Cecum und trennen Sie es sanft von anderen Darmtrakten. Vermeiden Sie es, das Cecum mit verzahnten oder scharfen Zangen zu greifen. Verwenden Sie atraumatische Zangen, wie Z. B. Adson-Zangen mit Serrationen.
5. Schneiden Sie das Caecum mit einer scharfen Schere.
6. Den Caecuminhalt manuell auf sterile Verbande extrahieren und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahren.
7. Bewahren Sie den Caecumgehalt bei -80 °C bis zur Mikrobiomanalyse auf.

5. DNA-Extraktion und 16S-rDNA-Sequenzierung und Datenanalyse

1. Isolierung von DNA aus Kot
   HINWEIS: Für dieses Experiment wurde ein handelsübliches DNA-Isolationskit (Materialtabelle) verwendet.
   1. Verwenden Sie ein Skalpell, um 300 mg Kot in einem 2 ml Mikrozentrifugenrohr zu kratzen und legen Sie das Rohr auf Eis.
   2. Fügen Sie jeder Probe 1 ml Inhibitionspuffer hinzu. Wirbel kontinuierlich für 1 min oder bis die Fäkalienprobe gründlich homogenisiert ist.
   3. Zentrifugieren Sie die Probe mit der maximalen Geschwindigkeit von 1 min, um die Fäkalienpartikel zu pelleten.
   4. Pipette 2 l Proteinase K in ein neues 2 ml Mikrozentrifugenrohr. Pipetten Sie 600 l des Überstandes von Schritt 5.1.3 in das 2 ml Mikrozentrifugenrohr mit Proteinase K. Fügen Sie dann 600 l Puffer 1 und Wirbel für 15 s hinzu.
   5. Inkubieren Sie die Probe bei 70 °C für 10 min.
   6. Fügen Sie dem Lysat (1:1-Verhältnis) 600 l 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie es durch Wirbeln. Zentrifuge mit der maximalen Geschwindigkeit kurz, um Tropfen aus der Innenseite des Rohrdeckels zu entfernen.
   7. Tragen Sie 600 l des Lysats auf die Spinspalte auf. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Übertragen Sie dann die Säule in ein neues 2 ml-Sammelrohr.
   8. Öffnen Sie die Spin-Spalte, und fügen Sie 500 L Puffer 2 hinzu. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min. Entfernen Sie die Säule und legen Sie sie in ein neues 2 ml Sammelrohr.
   9. Fügen Sie der Spalte 500 L Puffer 3 hinzu. Zentrifuge bei der maximalen Geschwindigkeit für 3 min. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess einmal, um sicherzustellen, dass der Puffer 3 vollständig eluiert ist.
   10. Legen Sie die Spinsäule in ein neues Rohr 2 ml Sammelrohr und Pipette 200 l Puffer 4 direkt auf die Membran. 1 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, dann zentrifugieren mit der maximalen Geschwindigkeit für 1 min, um die DNA zu entwerten.
2. 16S-rDNA-Sequenzierung und Datenanalyse
   1. Verwenden Sie 20-30 ng DNA, um Amplicons zu erzeugen.
   2. Verwenden Sie handelsübliche Primer, die für die relativ konservierten Regionen an grenzend an die hypervariablen V3- und V4-Regionen von Bakterien 16S rDNA entwickelt wurden. In der vorliegenden Studie wurden die Vorwärtsprimer mit der Sequenz "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" und Reverse Primer mit der Sequenz "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC" verwendet.
   3. Machen Sie die PCR-Reaktionen mischung, indem Sie 2,5 l Puffer 1, 2 l dNTPs, 1 l jedes Primers, 0,5 l DNA-Polymerase und 20 ng Vorlagen-DNA in einem Rohr hinzufügen. Verwenden Sie ddH₂O, um das Reaktionssystem auf 25 l einzustellen.
   4. Stellen Sie die PCR-Reaktionsparameter wie folgt ein: Führen Sie die Vordenaturierung bei 94 °C für 3 min einmal durch. Denaturierung bei 94 °C für 5 s, Aneal bei 57 °C für 90 s, bei 72°C für 10 s ausdehnen und 24x wiederholen.
   5. Führen Sie die PE250/300-Gekoppeltendsequenzierung gemäß der Anweisung des Herstellers durch und verwenden Sie das QIIME-Datenanalysepaket für die 16S rRNA-Datenanalyse.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurden die DNA-Sequenzierung und Datenanalyse in erster Linie von einem professionellen Sequenzierungsunternehmen durchgeführt.

Ergebnisse

Die Einrichtung von TBI ist in Abbildung 1dargestellt. Nach Anästhesie und Desinfektion wurde die Kopfhaut sagittisch eingeschnitten (Abbildung 1A). Eine Kraniotomie (3 mm Durchmesser) wurde mit einem elektrischen Bohrer über den rechten parietalen Kortex in den Schädel gezerrt, die Dura wurde intakt gehalten (Abbildung 1B, C). Eine Plastikverletzungskanüle wurde über das Knoche...

Diskussion

Hier wird ein einfaches und effizientes Protokoll zur Bestimmung von Veränderungen der cecal microbiota nach TBI bei Mäusen vorgestellt. Die Induktion von Hirnverletzungen und die Entnahme von Caecum-Gehaltsproben sind wichtige Bestandteile des Protokolls.

Obwohl Forscher die Veränderungen der Darmmikrobiota nach TBI untersucht haben, waren die in diesen Studien verwendeten Hirnverletzungen CCI-8 und Gewichtstropfen/Impact-induzierte Modelle⁹....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA isolation kit	QIAGEN	51604	For fast purification of genomic DNA from stool samples
Gene analysis service	GENEWIZ		Gene analyse service
Heating pad	Shanghai SAFE Biotech Co.	TR-200	heating pad
Injector	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		injector
LFPI device	Virginia Commonwealth University	FP302	LFPI device
Micro cranial drill	RWD Life Science	78061	Micro cranial drill
Povidone Iodine	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		Povidone Iodine