Investigando alterações na microbiota de caecum após traumatismo cranioencefálico em camundongos

Resumo

É apresentado aqui um protocolo para induzir ferimento de cérebro traumático difuso usando um dispositivo de percussão fluido lateral seguido pela coleção do índice do cécum para a análise do microbioma do intestino.

Resumo

O aumento da evidência mostra que o eixo microbiota-intestino-cérebro desempenha um papel importante na patogênese das doenças cerebrais. Vários estudos também demonstram que as lesões cerebrais traumáticas causam alterações na microbiota intestinal. No entanto, os mecanismos subjacentes à regulação bidirecional do eixo cérebro-intestino permanecem desconhecidos. Atualmente, existem poucos modelos para estudar as mudanças na microbiota intestinal após lesão cerebral traumática. Portanto, o estudo apresentado combina protocolos para induzir lesão cerebral traumática usando um dispositivo de percussão de fluido lateral e análise de amostras de cécum após lesão para investigar alterações no microbioma intestinal. Alterações da composição da microbiota intestinal após lesão cerebral traumática são determinadas usando o sequenciamento 16S-rDNA. Este protocolo fornece um método eficaz para estudar as relações entre micro-organismos enteric e ferimento de cérebro traumático.

Introdução

A lesão cerebral traumática (TCE) é um problema global de saúde pública e a principal causa de morte e incapacidade em adultos jovens^1,2. O TBI causa muitas mortes a cada ano, e os sobreviventes experimentam uma variedade de deficiências físicas, psiquiátricas, emocionais e cognitivas. Portanto, o TBI é um fardo pesado para os recursos familiares e societais de um paciente. TBI envolve tanto a lesão cerebral primária que ocorre no momento do trauma e quaisquer lesões cerebrais secundárias que desenvolvem horas a meses após a lesão inicial. Lesão cerebral secundária é mediada por várias cascatas bioquímicas, que não são apenas prejudiciais para o cérebro, mas também têm efeitos negativos significativos em vários sistemas de órgãos, incluindo o sistema gastrointestinal³.

Atualmente, existem três modelos para induzir TBI em experimentos com animais: lesão de percussão fluida, controle do impacto cortical (CCI) e aceleração da queda de peso. A lesão de percussão de fluido lateral (LFPI) é o modelo mais comumente utilizado para estabelecer lesão cerebral difusa (DAI)⁴. O dispositivo produz ferimento de cérebro através de um craniectomy aplicando um pulso de pressão fluido breve à dura intacta. Este pulso é criado pela greve do pêndulo. O LFPI é um método de modelagem reprodutível e controlável para pesquisa de TBI.

O microbioma é definido como os genomas coletivos de todos os microrganismos que residem no corpo humano. Micróbios intestinais, em particular, não só desempenham um papel importante na homeostase intestinal e função, mas também regulam muitos aspectos da fisiologia do hospedeiro e do funcionamento de outros órgãos⁵. Nos últimos anos, há uma evidência crescente que indica que a microbiota intestinal regula o desenvolvimento cerebral e função através de eixos cerebrais-intestino⁶. A perturbação da microbiota intestinal tem sido associada a vários distúrbios da função cerebral, incluindo a doença de Parkinson, transtornos do humor e autismo⁷. Recentemente, estudos pré-clínicos também relataram que a lesão cerebral aguda pode induzir alterações na microbiota intestinal^8,9.

Um estudo realizado por Treangen et al.¹⁰ encontrou reduções significativas em três espécies microbianas e aumentos em duas espécies microbianas após TCE induzida por ICC. Essa evidência indica que a modulação da microbiota intestinal pode ser um método terapêutico no manejo da TBI. No entanto, os mecanismos subjacentes às alterações da microbiota intestinal induzida por lesão cerebral permanecem desconhecidos. Por esta razão, um modelo relativamente simples e eficiente de estudar as mudanças na microbiota intestinal após TBI é necessária. Portanto, o presente estudo apresenta um protocolo para examinar alterações na microbiota intestinal após TCE em camundongos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê experimental de ética animal da Universidade de Zhejiang. Todos os instrumentos e materiais utilizados na cirurgia são estéreis. O armazenado de TBI toma aproximadamente 20 minutos.

1. cuidados com os animais

1. Use camundongos masculinos de 5 a 6 semanas de idade C57BL/6J (20-25 g de peso) neste experimento.
2. Manter camundongos em um 12 h/12 h de luz/ciclo escuro, e certifique-se que recebem alimentos e água ad libitum. Forneça as mesmas quantidades de alimento e de água aos grupos do Sham e do TBI durante todo o estudo.
3. Faça todos os esforços para minimizar a dor e o desconforto dos animais.

2. indução de traumatismo cranioencefálico

1. Injetar cetamina (80-100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) IP para anestesia. Teste a profundidade da anestesia usando um reflexo do olho ou reflexo da dor. Use lágrimas artificiais ou pomada de olho lubrificante para manter os olhos de secagem.
2. Após a anestesia, coloque o mouse em posição prona. Use uma almofada de aquecimento temperatura-controlada para manter a temperatura em 37 ° c durante a cirurgia e por 30 minutos após TBI.
3. Raspar o cabelo da área da incisão.
4. Desinfecte o couro cabeludo com 70% de etanol usando três esfrega alternadas e, em seguida, incite o couro cabeludo em um plano sagital.
5. Use fórceps para retrair a incisão em ambos os lados e separar o periósteo ligeiramente.
6. Use um marcador para desenhar um círculo (3 mm de diâmetro) na área parietal direita do crânio, a 2 mm de distância da linha média.
7. Perfure o crânio com uma broca elétrica. Assegure-se de que esta etapa esteja operada com cuidado para proteger o dura de ser danificado.
8. Retire a aba óssea e exponha uma pequena janela óssea (3 mm de diâmetro).
9. Coloque uma cânula de ferimento de plástico (diâmetro interno = 2,5 mm, comprimento = 8 mm) sobre a craniotomia e cimente a cânula para o crânio usando um acrílico dental.
10. Encha a cânula com estéril 0,9% NaCl (soro fisiológico normal) usando uma seringa (5 mL) para garantir que não há bolhas na cânula.
11. Gire sobre o osciloscópio e o amplificador e assegure-se de que o tubo de alta pressão do dispositivo da lesão de percussão do fluido lateral (LFPI) esteja livre de bolhas de ar. Teste o dispositivo entregando aproximadamente 10 pulsos até que dê um sinal constante. Ajuste o ângulo da posição inicial do pêndulo para atingir uma intensidade de pulso de cerca de 2,0 ATM.
12. Ligue a cânula de ferimento ao dispositivo LFPI. Induzir lesão cerebral puxando o gatilho e liberando o pêndulo. Em seguida, obter um pulso e transmiti-lo para a dura através de todo o sistema fechado de tubos cheios de fluido.
13. Opere os camundongos no grupo simulado com o mesmo procedimento cirúrgico. Não execute o LFPI.

3. tratamento pós-cirúrgico

1. Depois de induzir a lesão cerebral, retire a cânula plástica e sutura a incisão. Durante a cirurgia administrar buprenorfina (2mg/kg) SQ ou IP e depois de cada 6-12 h durante três dias.
2. Coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento até que seja ambulatorial. Ajuste a temperatura da almofada de aquecimento a 37 ° c para acelerar a ressuscitação anestésica.
3. Coloque o mouse de volta na gaiola e administrar alimentos e água ad libitum.

4. laparotomia e coleta de amostras do cécum

1. Eutanizar os camundongos por CO₂ seguido de luxação cervical nos pontos temporais correspondentes.
   Nota: neste experimento, os pontos de tempo escolhidos foram de 1 h, 6 h, 1 d, 3 d e 7 d lesão cerebral pós-traumática para analisar a evolução dinâmica da microbiota intestinal.
2. Retire o cabelo da superfície do abdômen. Desinfecte o abdômen com 70% de etanol.
3. Coloque um drapejar estéril sobre o mouse. Faça uma incisão da linha média do abdômen inferior, logo acima do prepúcio nos camundongos machos.
4. Depois que os intestinos são expostos, localize o ceco e gentilmente separou-o de outros tratos intestinais. Evite agarrar o cálio com o fórceps dentado ou afiado. Use fórceps Atraumatic, tal como o fórceps de Adson com serrações.
5. Corte o cécum com tesouras afiadas.
6. Extraia o conteúdo do cécum manualmente no curativo estéril e armazene o conteúdo em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
7. Armazene os índices do cécum em-80 ° c até a análise do microbioma.

5. extração de DNA e sequenciamento 16S-rDNA e análise de dados

1. Isolação do ADN das fezes
   Nota: um kit de isolamento de DNA disponível comercialmente (tabela de materiais) foi utilizado para este experimento.
   1. Use um bisturi para raspar 300 mg de fezes em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e coloque o tubo no gelo.
   2. Adicione 1 mL de inibição de buffer para cada amostra. Vortex continuamente por 1 min ou até que a amostra de fezes seja completamente homogeneizada.
   3. Centrifugue a amostra na velocidade máxima por 1 minuto para pellet as partículas de fezes.
   4. Pipetar 2 μL de proteinase K para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL. Pipet 600 μL do sobrenadante do passo 5.1.3 para o tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo proteinase K. Em seguida, adicione 600 μL de buffer 1 e Vortex por 15 s.
   5. Incubar a amostra a 70 ° c durante 10 min.
   6. Adicionar 600 μL de 100% de etanol ao lisado (1:1 ratio) e misturar por vortexing. Centrifugue na velocidade máxima brevemente para remover gotas do interior da tampa do tubo.
   7. Aplique 600 μL do lisado na coluna de rotação. Centrifugar à velocidade máxima durante 1 min. descarte o fluxo. Repita este passo mais uma vez. Em seguida, transfira a coluna para um novo tubo de recolha de 2 mL.
   8. Abra a coluna de rotação e adicione 500 μL de buffer 2. Centrifugar à velocidade máxima durante 1 min. Retire a coluna e coloque-a num novo tubo de recolha de 2 mL.
   9. Adicione 500 μL de buffer 3 na coluna. Centrifugar à velocidade máxima durante 3 min. descarte o fluxo. Repita o processo de centrifugação uma vez para garantir que o tampão 3 esteja completamente eluído.
   10. Coloque a coluna de centrifugação num novo tubo de recolha de 2 mL de tubo e pipetar 200 μL de tampão 4 directamente para a membrana. Incubar por 1 minuto em temperatura ambiente (RT), em seguida, centrifugar na velocidade máxima por 1 min para eluir DNA.
2. sequenciamento 16S-rDNA e análise de dados
   1. Use 20-30 NG de DNA para gerar amplicons.
   2. Use os primers comercialmente disponíveis projetados para as regiões relativamente conservadas que limitam as regiões da hipervariável v3 e v4 das bactérias 16S rDNA. No presente estudo foram utilizados os primers Forward contendo a seqüência "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" e os primers reversos contendo a seqüência "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".
   3. Faça a mistura de reações de PCR adicionando 2,5 μL de tampão 1,2 μL de dNTPs, 1 μL de cada primer, 0,5 μL de DNA polimerase e 20 ng de DNA de modelo em um tubo. Use ddH₂o para ajustar o sistema de reação a 25 μL.
   4. Ajuste os parâmetros da reação do PCR como segue: Realize a pré-desnaturação em 94 ° c por 3 minutos uma vez. Realize a desnaturação em 94 ° c por 5 s, recoze em 57 ° c para 90 s, estenda em 72 ° c por 10 s, e repita este 24X.
   5. Execute o sequenciamento de fim emparelhado PE250/300 de acordo com a instrução do fabricante e use o pacote de análise de dados QIIME para análise de dados 16S rRNA.
      Nota: neste experimento, o sequenciamento de DNA e a análise de dados foram feitos principalmente por uma empresa de sequenciamento profissional.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

O estabelecimento do TBI é mostrado na Figura 1. Após a anestesia e desinfecção, o couro cabeludo foi incisada sagital (Figura 1a). Uma craniotomia (3 mm de diâmetro) foi trefinado no crânio sobre o córtex parietal direito com uma broca elétrica, a dura foi mantida intacta (Figura 1b, C). Uma cânula de lesão plástica foi colocada sobre a janela óssea e cimentada ao crâni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Aqui apresentamos um protocolo simples e eficiente para determinar alterações na microbiota cecal após TCE em camundongos. A indução de lesão cerebral e a coleta de amostras de conteúdo de cécum são partes críticas do protocolo.

Apesar dos pesquisadores terem estudado as alterações da microbiota intestinal após TCE, a lesão cerebral utilizada nesses estudos foi CCI-⁸ e queda de peso/modelos induzidos por impacto⁹. No entanto, o mode...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA isolation kit	QIAGEN	51604	For fast purification of genomic DNA from stool samples
Gene analysis service	GENEWIZ		Gene analyse service
Heating pad	Shanghai SAFE Biotech Co.	TR-200	heating pad
Injector	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		injector
LFPI device	Virginia Commonwealth University	FP302	LFPI device
Micro cranial drill	RWD Life Science	78061	Micro cranial drill
Povidone Iodine	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		Povidone Iodine