Исследование изменений в Caecum микробиоты после травматического повреждения головного мозга у мышей

Резюме

Представлено здесь протокол, чтобы вызвать диффузную черепно-мозговую травму с помощью боковой жидкости ударные устройства следуют сбор содержания caecum для анализа кишечного микробиома.

Аннотация

Все больше данных свидетельствует о том, что микробиота-кишка-мозг оси играет важную роль в патогенезе заболеваний головного мозга. Несколько исследований также показывают, что черепно-мозговые травмы вызывают изменения в микрофлоре кишечника. Однако механизмы, лежащие в основе двунаправленной регуляции оси мозга и кишечника, остаются неизвестными. В настоящее время существует несколько моделей для изучения изменений в микрофлоре кишечника после черепно-мозговой травмы. Таким образом, представленное исследование сочетает в себе протоколы для индуцирования черепно-мозговой травмы с помощью боковой жидкости ударные устройства и анализа образцов caecum после травмы для исследования изменений в микрофлоре кишечника. Изменения состава микрофлоры кишечника после черепно-мозговой травмы определяются с помощью секвенирования 16S-rDNA. Этот протокол является эффективным методом изучения взаимосвязи между энтерическими микроорганизмами и черепно-мозговой травмой.

Введение

Травматическая черепно-мозговая травма (TBI) является глобальной проблемой общественного здравоохранения и основной причиной смерти и инвалидности у молодых людей^1,2. TBI вызывает много смертей каждый год, и выжившие испытывают различные физические, психиатрические, эмоциональные и когнитивные нарушения. Таким образом, ТБИ является тяжелым бременем для семьи пациента и социальных ресурсов. TBI включает в себя как первичную черепно-мозговую травму, которая происходит во время травмы и любые вторичные травмы головного мозга, которые развиваются часов до нескольких месяцев после первоначальной травмы. Вторичная травма головного мозга опосредована несколькими биохимическими каскадами, которые не только вредны для мозга, но и оказывают значительное негативное воздействие на различные системы органов, в ключая желудочно-кишечную систему³.

В настоящее время существует три модели, чтобы вызвать TBI в экспериментах на животных: травма жидкости ударных, контроль коркового воздействия (CCI), и ускорение падения веса. Боковая травма перкуссия жидкости (LFPI) является наиболее часто используемой моделью для установления диффузной черепно-мозговой травмы (DAI)⁴. Устройство производит черепно-мозговую травму через краниэктомию, применяя краткое давление жидкости импульс анетицирует сяртам. Этот пульс создается ударом маятника. LFPI является воспроизводимым и управляемым методом моделирования для исследования TBI.

Микробиом определяется как коллективные геномы всех микроорганизмов, которые находятся в организме человека. Кишечные микробы, в частности, не только играют важную роль в кишечной гомеостаза и функции, но и регулировать многие аспекты физиологии хозяина и функционирования других органов⁵. В последние годы, есть все больше доказательств того, что указывает на то, что кишечная микробиота регулировать развитие мозга и функции через мозг кишки осей⁶. Нарушение микрофлоры кишечника было связано с несколькими расстройствами функции мозга, включая болезнь Паркинсона, расстройства настроения, и аутизм⁷. В последнее время доклинические исследования также сообщили, что острая черепно-мозговая травма может вызвать изменения в микрофлоре кишечника^8,9.

Исследование Treangen et al.¹⁰ выявило значительное уменьшение трех видов микробов и увеличение двух видов микробов после ТБИ, индуцированного ТБИ. Эти данные свидетельствуют о том, что модуляция кишечной микробиоты может быть терапевтическим методом в управлении TBI. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе черепно-мозговой травмы вызванных кишечника изменения микрофлоры остаются неизвестными. По этой причине требуется относительно простая и эффективная модель изучения изменений в микрофлоре кишечника после TBI. Таким образом, настоящее исследование представляет собой протокол для изучения изменений в микрофлоре кишечника после TBI у мышей.

протокол

Все выполненные процедуры были одобрены Экспериментальным комитетом по этике животных Университета Чжэцзяна. Все инструменты и материалы, используемые в хирургии, являются стерильными. TBI proceudre занимает около 20 минут.

1. Уход за животными

1. Используйте в этом эксперименте мышей C57BL/6J (20-25 г веса) от 5 до 6 недель.
2. Поддерживайте мышей на свет/темном цикле 12 ч/12 ч и убедитесь, что они получают пищу и воду ad libitum. Обеспечить одинаковое количество пищи и воды как для фиктивных, так и для групп ТБИ на протяжении всего исследования.
3. Приложить все усилия, чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт животных.

2. Индукция черепно-мозговой травмы

1. Вводят кетамин (80-100 мг/кг)/ксилазин (10 мг/кг) IP для анестезии. Проверьте глубину анестезии с помощью глазного рефлекса или болевого рефлекса. Используйте искусственные слезы или мазь для глаз, чтобы держать глаза от высыхания.
2. После анестезии, положить мышь в лежачем положении. Используйте температурную грелку для поддержания температуры на уровне 37 градусов по Цельсию во время операции и в течение 30 минут после TBI.
3. Бритье волос области разреза.
4. Дезинфицировать кожу головы с 70% этанола с помощью трех чередующихся скрабы, а затем инициировать кожу головы в сагиттальной плоскости.
5. Используйте щипцы, чтобы утянуть разрез с обеих сторон и немного отделить периостеум.
6. Используйте маркер, чтобы нарисовать круг (3 мм в диаметре) на правой теменной области черепа, 2 мм от средней линии.
7. Просверлите череп с помощью электрической дрель. Убедитесь, что этот шаг работает осторожно, чтобы защитить dura от повреждения.
8. Снимите костной лоскут и разоблачите небольшое костное окно (3 мм в диаметре).
9. Поместите пластиковую канюлу (внутренний диаметр 2,5 мм, длина 8 мм) над краниотомией и цемента канюли к черепу с помощью зубного акрила.
10. Заполните канюлю стерильным 0,9% NaCl (нормальный солен) с помощью шприца (5 мл), чтобы убедиться, что в канюле нет пузырьков.
11. Включите осциллоскоп и усилитель и убедитесь, что трубка высокого давления боковой жидкости ударных травмы (LFPI) устройство не имеет пузырьков воздуха. Проверьте устройство, доставив около 10 импульсов, пока оно не даст устойчивый сигнал. Отрегулируйте угол исходного положения маятника, чтобы достичь интенсивности пульса около 2,0 атм.
12. Подключите канюль травмы к устройству LFPI. Побудить черепно-мозговую травму, нажав на курок и выпустив маятник. Затем получить пульс и передать его в дюру через всю закрытую заполненную жидкостью трубную систему.
13. Оперируйте мышей в фиктивной группе с той же хирургической процедурой. Не выполняйте LFPI.

3. Послеоперационное лечение

1. После индуцирования черепно-мозговой травмы, удалить пластиковые канюли и шов разреза. Во время операции вводят бупренорфин (2 мг/кг) СЗ или ИС, а затем каждые 6-12 ч в течение трех дней.
2. Положите мышь на грелку, пока она не будет амбулаторной. Установите температуру грелки до 37 градусов по Цельсию для ускорения анестезии реанимации.
3. Положите мышь обратно в клетку и управлять пищей и водой объявление libitum.

4. Лапаротомия и коллекция образцов из caecum

1. Эвтаназия мышей CO₂ с последующим вывихом шейки матки в соответствующие временные моменты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, выбранные точки времени были 1 ч, 6 ч, 1 d, 3 d, и 7 d посттравматическая черепно-мозговая травма для анализа динамической эволюции кишечной микробиоты.
2. Удалите волосы с поверхности живота. Дезинфекция брюшной полости с 70% этанола.
3. Поместите стерильную драпировку над мышью. Сделайте разрез из нижней части живота средней линии, чуть выше prepuce у мышей мужского пола.
4. После того, как кишечник подвергается, найти cecum и аккуратно отделил его от других кишечных путей. Избегайте схватив cecum с зубчатыми или острыми щипками. Используйте травматические щипцы, такие как щипцы Adson с serrations.
5. Вырезать caecum с острыми ножницами.
6. Извлеките содержимое caecum вручную на стерильную повязку и храните содержимое в микроцентрифуговых трубках 1,5 мл.
7. Храните содержимое caecum при -80 градусах По Цельсию до анализа микробиома.

5. Извлечение ДНК и секвенирование и анализ данных 16S-rDNA

1. Изоляция ДНК от кала
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступный набор изоляции ДНК (Таблица материалов) был использован для этого эксперимента.
   1. Используйте скальпель, чтобы очистить 300 мг кала в 2 мл микроцентрифуговой трубки и поместите трубку на лед.
   2. Добавьте 1 мл подавляемого буфера к каждому образцу. Vortex непрерывно в течение 1 мин или до тех пор, пока кала образец тщательно гомогенизированы.
   3. Centrifuge образец на максимальной скорости в течение 1 мин, чтобы гранулы частиц кала.
   4. Пипетка 2 л протеиназа K в новую микроцентрифугную трубку 2 мл. Пипет каст 600 л супернатанта от шага 5.1.3 в микроцентрифугную трубку 2 мл, содержащую протеиназа K. Затем добавьте 600 л буфера 1 и вихрь на 15 с.
   5. Инкубировать образец при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
   6. Добавьте 600 л 100% этанола в лизат (коэффициент 1:1) и смешайте путем вихря. Центрифуги на максимальной скорости кратко удалить капли из внутренней крышки трубки.
   7. Нанесите 600 л lysate на колонку спина. Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 мин. Отбросьте поток через. Повторите этот шаг еще раз. Затем перенесите колонку в новую трубку для сбора 2 мл.
   8. Откройте колонку спина и добавьте 500 зл. Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 мин. Снимите колонку и поместите ее в новую трубку для сбора 2 мл.
   9. Добавьте в колонку 500 кл.л. буфера 3. Центрифуга на максимальной скорости в течение 3 мин. Отбросьте поток через. Повторите процесс центрифугации один раз, чтобы обеспечить буфер 3 полностью eluted.
   10. Поместите вращательную колонку в новую трубку 2 мл трубки сбора и пипетка 200 Л. буфера 4 непосредственно на мембрану. Инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре (RT), затем центрифуги на максимальной скорости в течение 1 мин, чтобы elute ДНК.
2. 16S-rDNA секвенирования и анализа данных
   1. Используйте 20-30 нг ДНК для генерации ампиконов.
   2. Используйте коммерчески доступные грунтовки, предназначенные для относительно сохранимых регионов, граничащих с гиперпеременными регионами V3 и V4 бактерий 16S rDNA. В настоящем исследовании были использованы форвардные праймеры, содержащие последовательность "CCTACGGRRCASCASCAGKVRVGAAT" и реверсивные грунтовки, содержащие последовательность "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".
   3. Сделайте смесь реакций ПЦР, добавив 2,5 л буфера 1, 2 зл и dNTPs, 1 зл и l каждой грунтовки, 0,5 л ДНК-полимеразы и 20 нг шаблонДНК в трубке. Используйте ddH₂O, чтобы настроить систему реакции до 25 Л.
   4. Установите параметры реакции ПЦР следующим образом: выполните предденатурацию при 94 градусах по Цельсию в течение 3 мин один раз. Выполните денатурацию при 94 градусах по Цельсию на 5 с, аннеал при 57 градусах по Цельсию на 90 с, расширяйте при 72 градусах по 10 с и повторяйте это 24x.
   5. Выполните секвенирование PE250/300 в паре в соответствии с инструкцией производителя и используйте пакет анализа данных для анализа данных 16S rRNA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте секвенирование ДНК и анализ данных были в первую очередь выполнены профессиональной компанией по секвенированию.

Результаты

Создание TBI показано на рисунке 1. После анестезии и дезинфекции, кожа головы была разрезана sagittally(рисунок 1A). Краниотомия (3 мм в диаметре) была трефина в череп над правой теменной коры с электрической дрелью, dura была сохранена в целости и ...

Обсуждение

Представлен простой и эффективный протокол для определения изменений в микрофлоре цекалы после TBI у мышей. Индукция черепно-мозговой травмы и сбор образцов содержания цекума являются важнейшими частями протокола.

Несмотря на исследователи изучили изменения кишечной м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA isolation kit	QIAGEN	51604	For fast purification of genomic DNA from stool samples
Gene analysis service	GENEWIZ		Gene analyse service
Heating pad	Shanghai SAFE Biotech Co.	TR-200	heating pad
Injector	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		injector
LFPI device	Virginia Commonwealth University	FP302	LFPI device
Micro cranial drill	RWD Life Science	78061	Micro cranial drill
Povidone Iodine	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		Povidone Iodine