Indagare sulle alterazioni nel caecum Microbiota dopo una lesione cerebrale traumatica nei topi

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per indurre lesioni cerebrali traumatiche diffuse utilizzando un dispositivo a percussione fluida laterale seguito dalla raccolta del contenuto di caecum per l'analisi del microbioma intestinale.

Abstract

Sempre più prove dimostrano che l'asse microbiota-gut-cervello svolge un ruolo importante nella patogenesi delle malattie cerebrali. Diversi studi dimostrano anche che le lesioni cerebrali traumatiche causano cambiamenti al microbiota intestinale. Tuttavia, i meccanismi alla base della regolazione bidirezionale dell'asse cervello-gut rimangono sconosciuti. Attualmente, esistono pochi modelli per studiare i cambiamenti nel microbiota intestinale dopo lesioni cerebrali traumatiche. Pertanto, lo studio presentato combina protocolli per indurre lesioni cerebrali traumatiche utilizzando un dispositivo di percussioni fluide laterale e l'analisi di campioni di caecum in seguito alla lesione per studiare le alterazioni nel microbioma intestinale. Le alterazioni della composizione del microbiota intestinale dopo lesioni cerebrali traumatiche sono determinate utilizzando il sequenziamento 16S-rDNA. Questo protocollo fornisce un metodo efficace per studiare le relazioni tra microrganismi enterici e lesioni cerebrali traumatiche.

Introduzione

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è un problema di salute pubblica globale e la principale causa di morte e disabilità nei giovani adulti^1,2. TBI causa molti decessi ogni anno, e i sopravvissuti sperimentano una varietà di disabilità fisiche, psichiatriche, emotive e cognitive. Pertanto, la TBI è un pesante fardello per la famiglia e le risorse sociali di un paziente. TBI coinvolge sia la lesione cerebrale primaria che si verifica al momento del trauma e qualsiasi lesioni cerebrali secondarie che sviluppano ore a mesi dopo la lesione iniziale. Lesione cerebrale secondaria è mediata da diverse cascate biochimiche, che non sono solo dannose per il cervello, ma hanno anche effetti negativi significativi su vari sistemi di organi, tra cui il sistema gastrointestinale³.

Attualmente, ci sono tre modelli per indurre La TBI negli esperimenti sugli animali: lesione da percussione fluida, l'impatto corticale di controllo (CCI) e l'accelerazione della caduta di peso. Lesione di percussioni fluide laterali (LFPI) è il modello più comunemente usato per stabilire lesioni cerebrali diffuse (DAI)⁴. Il dispositivo produce lesioni cerebrali attraverso una craniectomia applicando un breve impulso di pressione del fluido alla dura intatta. Questo impulso è creato dallo sciopero del pendolo. LFPI è un metodo di modellazione riproducibile e controllabile per la ricerca TBI.

Il microbioma è definito come i genomi collettivi di tutti i microrganismi che risiedono nel corpo umano. I microbi intestinali, in particolare, non solo svolgono un ruolo importante nell'omeostasi intestinale e nella funzione, ma regolano anche molti aspetti della fisiologia dell'ospite e del funzionamento di altri organi⁵. Negli ultimi anni, ci sono prove crescenti che indicano che il microbiota intestinale regola lo sviluppo e la funzione del cervello tramite assi cervello-gut⁶. L'interruzione del microbiota intestinale è stata collegata a diversi disturbi della funzione cerebrale, tra cui il morbo di Parkinson, disturbi dell'umore e autismo⁷. Recentemente, studi preclinici hanno anche riferito che la lesione cerebrale acuta può indurre cambiamenti nel microbiota intestinale^8,9.

Uno studio di Treangen et al.¹⁰ ha rilevato diminuzioni significative in tre specie microbiche e aumenti in due specie microbiche dopo il TBI indotto dal CCI. Questa evidenza indica che la modulazione del microbiota intestinale può essere un metodo terapeutico nella gestione TBI. Tuttavia, i meccanismi alla base dei cambiamenti del microbiota intestinale indotti da lesioni cerebrali rimangono sconosciuti. Per questo motivo, è necessario un modello relativamente semplice ed efficiente di studiare i cambiamenti nel microbiota intestinale dopo che è richiesto tè. Pertanto, il presente studio presenta un protocollo per esaminare le alterazioni nel microbiota intestinale dopo la TBI nei topi.

Protocollo

Tutte le procedure eseguite sono state approvate dal Comitato Sperimentale di Etica Animale dell'Università di Hejiang. Tutti gli strumenti e i materiali utilizzati in chirurgia sono sterili. Il processo di proceudre TBI dura circa 20 minuti.

1. Cura degli animali

1. Utilizzare topi C57BL/6J maschi da 5 a 6 settimane (20-25 g di peso) in questo esperimento.
2. Mantenere i topi su un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h e assicurarsi che ricevano cibo e acqua al libitum. Fornire le stesse quantità di cibo e acqua a entrambi i gruppi farsa e TBI durante lo studio.
3. Fai tutti gli sforzi per ridurre al minimo il dolore e il disagio degli animali.

2. Induzione di lesioni cerebrali traumatiche

1. Iniettare Ketamina (80-100 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg) IP per l'anestesia. Testare la profondità dell'anestesia utilizzando un riflesso o dolore. Utilizzare lacrime artificiali o lubrificante unguento per mantenere gli occhi da asciugare.
2. Dopo l'anestesia, mettere il topo in posizione prona. Utilizzare una piastra di riscaldamento a temperatura controllata per mantenere la temperatura a 37 gradi centigradi durante l'intervento chirurgico e per 30 min dopo TBI.
3. Rasare i capelli dell'area di incisione.
4. Disinfettare il cuoio capelluto con il 70% di etanolo utilizzando tre scrub alternati, quindi incise il cuoio capelluto in un piano sagittale.
5. Utilizzare pinze per ritrarre l'incisione su entrambi i lati e separare leggermente il periosteo.
6. Utilizzare un marcatore per disegnare un cerchio (3 mm di diametro) sull'area parietale destra del cranio, a 2 mm di distanza dalla linea mediana.
7. Forare il cranio con un trapano elettrico. Assicurarsi che questo passaggio sia azionato con attenzione per proteggere la dura da essere danneggiata.
8. Rimuovere il lembo osseo ed esporre una piccola finestra ossea (3 mm di diametro).
9. Mettere una cannula di lesione plastica (diametro interno - 2,5 mm, lunghezza 8 mm) sopra la craniotomia e cementare la cannula al cranio utilizzando un acrilico dentale.
10. Riempire la cannula con sterile 0.9% NaCl (normale salina) utilizzando una siringa (5 mL) per garantire che non ci siano bolle nella cannula.
11. Accendere l'oscilloscopio e l'amplificatore e assicurarsi che il tubo ad alta pressione del dispositivo di lesione a percussione del fluido laterale (LFPI) sia privo di bolle d'aria. Testare il dispositivo fornendo circa 10 impulsi fino a quando non dà un segnale costante. Regolare l'angolo della posizione iniziale del pendolo per raggiungere un'intensità dell'impulso di circa 2,0 atm.
12. Collegare la cannula lesione al dispositivo LFPI. Indurre lesioni cerebrali tirando il grilletto e rilasciando il pendolo. Quindi, ottenere un impulso e trasmetterlo alla dura attraverso l'intero sistema di tubing pieno di liquido chiuso.
13. Operare i topi nel gruppo farsa con la stessa procedura chirurgica. Non eseguire il LFPI.

3. Trattamento post-chirurgico

1. Dopo aver indurso la lesione cerebrale, rimuovere la cannula di plastica e suturare l'incisione. Durante l'intervento somministrato buprenorphine (2mg/kg) SQ o IP e successivamente ogni 6-12 h per tre giorni.
2. Posare il mouse su una piastra di riscaldamento fino a quando non è ambulatoriale. Impostare la temperatura della piastra di riscaldamento a 37 gradi centigradi per accelerare la rianimazione anestetica.
3. Rimettere il mouse nella gabbia e somministrare cibo e acqua ad libitum.

4. Laparotomia e raccolta di campioni dal caecum

1. Eutanasia i topi da CO₂ seguiti da lussazione cervicale nei punti temporali corrispondenti.
   NOTA: In questo esperimento, i punti temporali scelti erano 1 h, 6 h, 1 d, 3 d e 7 d lesione cerebrale post-traumatica per analizzare l'evoluzione dinamica del microbiota intestinale.
2. Rimuovere i capelli dalla superficie dell'addome. Disinfettare l'addome con il 70% di etanolo.
3. Posizionare un drappo sterile sul mouse. Fare un'incisione dalla linea mediana dell'addome inferiore, appena sopra il prepuzio nei topi maschi.
4. Dopo che gli intestini sono esposti, individuare il cecum e separarlo delicatamente da altri tratti intestinali. Evitare di afferrare il cecum con pinze dentate o affilate. Utilizzare pinze atraumatiche, come pinze Adson con seghettature.
5. Tagliare il caecum con le forbici affilate.
6. Estrarre manualmente il contenuto di caecum su una medicazione sterile e conservare il contenuto in tubi di microcentrifuga da 1,5 mL.
7. Conservare il contenuto di caecum a -80 gradi centigradi fino all'analisi del microbioma.

5. Estrazione del DNA e sequenziamento e analisi dei dati 16S-rDNA

1. Isolamento del DNA dalle feci
   NOTA: per questo esperimento è stato utilizzato un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio (Tabella dei materiali).
   1. Utilizzare un bisturi per raschiare 300 mg di feci in un tubo di microcentrifuga da 2 mL e posizionare il tubo sul ghiaccio.
   2. Aggiungere 1 mL di buffer di inibizione ad ogni campione. Vortice continuo per 1 min o fino a quando il campione feci è accuratamente omogeneizzato.
   3. Centrifugare il campione alla velocità massima di 1 min per pellet le particelle feci.
   4. Pipette 2 - L di proteinasi K in un nuovo tubo di microcentrifuga da 2 mL. Tubo 600 -L del supernatante dal passo 5.1.3 nel tubo di microcentrifuga da 2 mL contenente proteinasi K. Quindi, aggiungere 600 l di Buffer 1 e vortice per 15 s.
   5. Incubare il campione a 70 gradi centigradi per 10 min.
   6. Aggiungere al lisa (rapporto 1:1) 600 luna del 100% e mescolare mediante vortice. Centrifuga alla massima velocità brevemente per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio del tubo.
   7. Applicare 600 l ofthe alla colonna di spin. Centrifuga alla velocità massima per 1 min. Scartare il flusso attraverso. Ripetere questo passaggio ancora una volta. Quindi, trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta 2 mL.
   8. Aprire la colonna di selezione e aggiungere 500 l of Buffer 2. Centrifuga alla velocità massima per 1 min. Rimuovere la colonna e posizionarla in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL.
   9. Aggiungere 500 l di Buffer 3 nella colonna. Centrifuga alla velocità massima per 3 min. Scartare il flusso attraverso. Ripetere il processo di centrifugazione una volta per assicurarsi che il Buffer 3 sia completamente eluito.
   10. Posizionare la colonna di spin in un nuovo tubo da 2 mL e pipetta 200 -L di Buffer 4 direttamente sulla membrana. Incubare per 1 min a temperatura ambiente (RT), quindi centrifugare alla velocità massima per 1 min per eluire il DNA.
2. Sequenziamento e analisi dei dati 16S-rDNA
   1. Utilizzare 20-30 ng di DNA per generare amplicons.
   2. Utilizzare primer disponibili in commercio progettati per le regioni relativamente conservate confinanti con le regioni ipervariabili V3 e V4 dei batteri 16S rDNA. Nel presente studio sono stati utilizzati i primer a termine contenenti la sequenza "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" e i primer invertiti contenenti la sequenza "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".
   3. Apportare la miscela di reazioni PCR aggiungendo 2,5 l of Buffer 1, 2 - L di dNTP, 1 L di ogni primer, 0,5 l di polimerasi di DNA e 20 ng di DNA modello in un tubo. Utilizzare ddH₂O per regolare il sistema di reazione a 25.
   4. Impostare i parametri di reazione PCR come segue: eseguire la pre-denaturazione a 94 gradi centigradi per 3 min una sola volta. Eseguire la denaturazione a 94 gradi centigradi per 5 s, anneal a 57 gradi per 90 s, estendere a 72oC per 10 s, e ripetere questo 24x.
   5. Eseguire il sequenziamento di estremità accoppiate PE250/300 in base alle istruzioni del produttore e utilizzare il pacchetto di analisi dei dati QIIME per l'analisi dei dati rRNA 16S.
      NOTA: In questo esperimento, il sequenziamento del DNA e l'analisi dei dati sono stati eseguiti principalmente da una società di sequenziamento professionale.

Risultati

La creazione di TBI è illustrata nella Figura 1. Dopo l'anestesia e la disinfezione, il cuoio capelluto è stato inciso sagittally (Figura 1A). Una craniotomia (3 mm di diametro) è stata trafitta nel cranio sopra la corteccia parietale destra con un trapano elettrico, la dura è stata mantenuta intatta (Figura 1B,C). Una cannula di lesione plastica è stata posta sopra la finestra ...

Discussione

Presentato qui è un protocollo semplice ed efficiente per determinare i cambiamenti nel microbiota cecale dopo il TBI nei topi. L'induzione di lesioni cerebrali e la raccolta di campioni di contenuto di caecum sono parti critiche del protocollo.

Nonostante i ricercatori abbiano studiato i cambiamenti del microbiota intestinale dopo la TBI, la lesione cerebrale utilizzata in questi studi era CCI-⁸ e modelli di goccia/impatto indotti⁹. Tuttavia, i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA isolation kit	QIAGEN	51604	For fast purification of genomic DNA from stool samples
Gene analysis service	GENEWIZ		Gene analyse service
Heating pad	Shanghai SAFE Biotech Co.	TR-200	heating pad
Injector	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		injector
LFPI device	Virginia Commonwealth University	FP302	LFPI device
Micro cranial drill	RWD Life Science	78061	Micro cranial drill
Povidone Iodine	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		Povidone Iodine