בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

Summary

מבחינה פיזיולוגית, odorant רצפטורים מופעלים על ידי מולקולות odorant בשאיפה בשלב אדי. עם זאת, ביותר מערכות in vitro לנצל שלב נוזלי odorant גירוי. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטן odorant על odorant גירוי בשלב אדי.

Abstract

תפיסת הריח מתחיל האינטראקציה של odorants עם רצפטורים odorant (או) בא לידי ביטוי על ידי חוש הריח החישה הניריונים (OSN). ריח זיהוי עוקב אחר ערכת קידוד המשתמשת קומבינטורית, או אחד יכול להיות מופעל על ידי קבוצת odorants בהם odorant אחד יכול להפעיל שילוב של ORs. דרך כזאת קידוד קומבינטורית, אורגניזמים יכולים לזהות ולהבחין בין מספר עצום של מולקולות ריח נדיפים. לפיכך, ריח-ריכוז נתון יכולה להיות מתוארת על ידי תבנית ההפעלה של ORs, אשר הוא ספציפי על כל ריח. במובן הזה, פיצוח המנגנונים המשתמשת המוח להבחין ריח דורש את ההבנה odorant-ניתוח אינטראקציות. זו הסיבה מדוע הקהילה חוש הריח מחויבת "דה orphanize" רצפטורים אלו. קונבנציונאלי מערכות in vitro המשמש לזיהוי odorant- או אינטראקציות נעזרו ומוכנסות המדיה הנייד עם odorant, אשר היא נבדלת הגילוי הטבעי של ריחות באמצעות פירוק odorants אדי לתוך רירית האף לפני בחברת ORs. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה מאפשר ניטור בזמן אמת של הפעלת או באמצעות אדים-שלב odorants. השיטה שלנו מתבססת על מדידת שחרור המחנה על ידי הפריה חוץ גופית באמצעות וזמינותו Glosensor. זה גשרים הנוכחי פערים בין גישות ויוו במבחנה ומספק בסיס חיישן כימיים נדיפים ביונים.

Introduction

חוש הריח מאפשר קרקעית חיות לאינטראקציה עם הסביבה כימיים נדיפים שלך כונן התנהגויות ורגשות. ביסודו, מתחיל תהליך זיהוי ריח עם האינטראקציה הראשונה של מולקולות odorant עם מערכת הריח, ברמה של קולטנים (ORs) odorant¹. ביונקים, ORs מבוטאים בנפרד חוש הריח נוירונים סנסוריים (OSNs) ממוקם אפיתל חוש הריח². הם שייכים למשפחת קולטן (GPCR) G-חלבון בשילוב, ליתר דיוק למשפחת אופסין # רודופסין דמוי משנה (המכונה גם מחלקה A). ORs זוג עם מופחתים גרם חלבון G_olf הפעלת אשר מוביל המחנה ייצור ואחריו פתיחת ערוצי נוקלאוטיד מחזורית מגודרת, הדור של פוטנציאל פעולה. מקובל כי ההכרתיות ריח מסתמך על דפוס מסוים של ORs מופעל^3,4 , ולכן זיהוי ריח מלווה ערכת קידוד המשתמשת קומבינטורית, או אחד יכול להיות מופעל על ידי קבוצת odorants בהם odorant אחד יכול להפעיל שילוב של ORs. דרך כזו קידוד קומבינטורית, זה הוא שמהווה אורגניזמים יכולים לזהות ולהבחין בין מספר עצום של מולקולות ריח נדיפים. אחד המפתחות להבנת איך נתפסים ריחות היא להבין איך ואשר ORs מופעלים על ידי ריח נתון.

בניסיון להבהיר odorant- או אינטראקציות, מבחני פונקציונלי במבחנה שיחקו תפקיד חיוני. הזיהוי של אגוניסט ליגנדים מדיף עבור יתום ORs (או דה-orphanization) כבר שדה פעיל מאוד בעשרים השנים האחרונות, באמצעות שימוש שונים במבחנה, ex-vivo ומבחני פונקציונלי ויוו^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17}.

מערכות assay במבחנה הם המתאימים ביותר עבור אפיון פונקציונלי מפורט ORs, כולל זיהוי של תחומים פונקציונליים, ומשקעים קריטי של ORs, כמו גם יישומים הנדסיים פוטנציאליים. עם זאת, בהמשך פיתוח מערכות במבחנה יקר עבור ORs היה אתגר, בין היתר בשל קושי עם culturing OSNs וביטוי פונקציונלי של ORs בתאים heterologous. האתגר הראשון היה להקים פרוטוקולים מותרים עבור הביטוי פני שטח התא של ORs פונקציונלי מיפוי של odorant-ניתוח אינטראקציות. מספר קבוצות עצמאית נעזרו שונים גישות^{5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20}. אחד ההישגים המוקדמים נוצר על ידי Krautwurst et al. ב מתויג N-הסופית של ORs עם רצף מקוצרת של אופסין # רודופסין (Rho-תג) ולצפות ביטוי השטח משופרת ב- תאי כליה אנושית עובריים (HEK)¹³. וריאציות שבוצעו התג המוצמד הרצף או הוא עדיין נתיב חקר לשיפור או ביטוי ופונקציונליות^19,21. סאיטו ואח. ואז זיהו חלבון קולטן-הובלת 1 (RTP1), RTP2 אשר להקל או סחר בסמים. ²² גרסה קצרה יותר של RTP1, שנקרא RTP1S, גם הוכח להיות יעיל יותר מאשר החלבון המקורי²³. הפיתוח של קו תא (Hana3A) stably המבטאת G_olf, REEP1, RTP1 ו- RTP2 ²⁴, בשילוב עם השימוש של אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה) כתבים איפשר זיהוי של odorant-ניתוח אינטראקציות. מנגנון לפיו משפחת RTP של חלבונים מקדמת הבעת פני שטח התא ORs עדיין נקבע.

אזהרה אחת משיטות אלה הוקמה היא כי הם מסתמכים על גירוי odorant בשלב נוזלי, כלומר odorants הם התפרקה מראש לתוך מדיום גירוי לעורר תאים על-ידי החלפת המדיום. . זה מאוד שונה מזו התנאים הפיזיולוגיים שבה מולקולות odorant להגיע האפיתל חוש הריח בשלב אדי, להפעיל ORs על-ידי פירוק לתוך רירית האף. כדי להידמות יותר חשיפה גירוי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, צאנז ואח²⁰ המוצע של assay בהתבסס על אדי גירוי על-ידי החלת טיפת odorant פתרון לתלות מתחת הפנים הפנימי של סרט פלסטיק הניח על ראש תא בארות. הם הקליטו את התגובות סידן על-ידי ניטור קרינה פלואורסצנטית בעוצמה. שיטה זו היה הראשון להשתמש אוויר-שלב odorant גירוי, אבל זה לא התירו הקרנה גדולים או ההפעלה.

. הנה, פיתחנו שיטה חדשה המאפשרת ניטור בזמן אמת של הפעלת או במבחנה באמצעות אדי שלב odorant גירוי על ידי וזמינותו Glosensor (איור 1). Assay הזה שימש בעבר בהקשר של odorant נוזלי גירוי^{18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31}. התא ניטור של luminometer זה equilibrated קודם עם odorant מתאדה לפני הצלחת לקרוא (איור 1א'). Odorant מולקולות הן ואז solvated לתוך המאגר, רחצה Hana3A תאים המבטאים את הניתוח של עניין, RTP1S את החלבונים Glosensor (איור 1B). אם odorant הוא אגוניסט של הניתוח, הניתוח לעבור קונפורמציה מופעל לאגד G_olf, מפעיל את cyclase adenylyl (AC) ו בסופו של דבר לגרום רמות המחנה לעלות. המחנה העולה לאגד ולהפעיל את החלבון Glosensor כדי ליצור הפריה חוץ גופית ותזרז luciferin. הארה זו לאחר מכן נרשם על-ידי luminometer ומאפשרת או הפעלת הפיקוח. שיטה זו היא עניין גבוהה בהקשר של deorphanization או כפי שהיא מביאה מערכות in vitro קרוב התפיסה הטבעית של ריחות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Hana3A אנליזה טרמית

1. להכין M10 (מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 10% v/v עוברית שור סרום (FBS)), M10PSF (M10 פלוס 100 µg/mL פניצילין-סטרפטומיצין, שהוא גוסס 1.25 µg/mL B).
2. התרבות התאים 10 מ"ל של M10PSF בצלחת תרבות תא 100 מ מ בתוך אינקובטור להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני (CO₂).
3. חלוקת התאים כל יומיים ביחס של 20%: כאשר הנהרות 100% של תאים (כ 1.1 x 10⁷ תאים) נצפית במיקרוסקופ ניגוד שלב, aspire התקשורת ולשטוף את התאים בעדינות עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
4. האחות PBS ולהוסיף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין אתילן diamine ב tetraacetic חומצה (EDTA, 0.48 מ"מ). תן פועלים למען כ 1 דקות, עד התאים מביצועם מהצלחת.
5. הוסף 5 מ של M10 להשבית את טריפסין ולנתק בסופו של דבר את התאים עדיין מחוברים לצלחת על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
6. להעביר את אמצעי האחסון (8 מ ל) צינור 15 מ"ל צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע, resuspend את התאים לתוך 5 מ של M10PSF על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי לשבור את כל תא המוני. הימנע מיצירת בועות בצינור.
7. העברת 1 מ"ל של הפתרון resuspended תאים בתבשיל חדש של תרבות תא 100 מ מ ולהוסיף 9 מ של M10PSF טריים. דגירה-CO 37 ° C ו-5%₂.

2. הכנה של התאים תקנים

1. להעריך את המפגש, או את מספר התאים, על ידי התבוננות אותם תחת מיקרוסקופ שלב-ניגודיות. לפחות 10% הנהרות (כ 1.1 x 10⁶ תאים) נדרש עבור לוח אחד.
2. האחות התקשורת ולשטוף את התאים בעדינות עם 10 מ"ל ל- PBS. האחות PBS ולהוסיף 3 מ"ל של EDTA. תן פועלים למען כ 1 דקות בטמפרטורת החדר, עד התאים מביצועם מהצלחת.
3. הוסף 5 מ של M10 להשבית את טריפסין ולנתק בסופו של דבר את התאים עדיין מחוברים לצלחת על-ידי pipetting למעלה ולמטה. להעביר את אמצעי האחסון (8 מ ל) 15 מ"ל ובשעות צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות.
4. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את התאים לתוך 5 מ של M10PSF על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי לשבור את כל תא המוני. הימנע מיצירת בועות בצינור.
5. בהתאם למספר הצלחות כדי להיות transfected, להעביר כמות מספקת של תאים מאגר עם נפח המתאימים ראוי M10PSF. לוח 96-ובכן אחד צריך להיות מצופה 1/10 של תבשיל confluent 100 מ מ 100% (כ 1.1 x 10⁶ תאים) מעורבבת עם M10PSF כדי להגיע הנפח הכולל של 6 מ. עבור לוח 96-ובכן אחד מתחיל עם מנה 100 מ מ 100% הנהרות, להוסיף 500 µL mL 5 תאים resuspended 5.5 מ של M10PSF טריים. מערבבים את התאים ואת M10PSF ללא יצירת בועות אוויר.
6. פיפטה 50 µL של התאים מושעה לבאר כל צלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי. דגירה בין לילה-CO 37 ° C ו-5%₂.

3. פלסמיד תרביות תאים

1. לבחון את הצלחת 96-ובכן במיקרוסקופ ניגוד שלב כדי להבטיח זרימה תא בין 30% ל- 50%.
2. להכין תערובת תרביות תאים הראשון המכיל את פלסמידים נפוצות על הלוח כולו (RTP1S, או חלבון Glosensor, ראה טבלה של חומרים) בעקבות אמצעי האחסון בטבלה1. לב הכמות או מתויג רו יש לחלק במספר ORs אם מספר ORs.
   הערה: אנחנו חריפה עצה כדי להוסיף פקד שלילי וקטור ריק (Rho כאן-pCI) ושליטה חיובי כלשהו (הידועה או להגיב odorant שנבדקו) את תוכנית הניסוי.
3. להכין תערובת תרביות תאים השני המכיל 500 µL של גברת µL 20 של ריאגנט Lipofectamine 2000 (חוקי עבור לוח אחד 96-ובכן, ראה טבלה של חומרים). להוסיף את המיקס השני הראשון, לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 5 מ של M10 ומערבבים בעדינות.
4. להחליף את M10PSF בצלחת 96-ובכן platted בעבר על ידי 50 µL של התקשורת תקנים הסופי. דגירה בערכת חממה 37 ° C ו- 5% CO₂ , ואקום של לשכת הבאות לילה luminometer ההליך המתואר בשלב 6.

4. המצע דגירה

1. לבחון את הצלחת 96-ובכן במיקרוסקופ ניגוד שלב כדי להבטיח זרימה תא בין 60% ל-100%. להכין פתרון גירוי מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק) המכילה 10 מ מ של חומצה piperazineethanesulfonic hydroxyethyl (HEPES) ו- 5 מ מ של D-גלוקוז.
2. לדלל µL 75 מהתרכובת במחנה (ראה טבלה של חומרים) פתרון 2.75 מ של הפתרון גירוי. הסר את המדיום תרביות תאים מהצלחת 96-ובכן, לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 50 של גירוי טריים פתרון טוב לכל.
3. להסיר את הפתרון גירוי ולהוסיף 25 µL של ריאגנט המחנה פתרון מוכן בשלב 4.2 ל מכל קידוח. דגירה לצלחת 96-ובכן בטמפרטורת החדר האפל ונטול ריח בסביבה (לדוגמה, מגירה נקי ריק הרחק מן כימיקלים או כל מקור odorant) כבר שעתיים.

5. Odorant גירוי

1. ראשית, equilibrate תא luminometer עם מולקולות נדיפות odorant. לדלל את odorant הרצוי לריכוז ב 10 מ"ל שמן מינרלי (איור 2א). לפני סוף זמן הדגירה ריאגנט המחנה, להוסיף 25 µL של הפתרון odorant בצלחת 96-ובכן חדש (לא אחד המכיל את התאים). דגירה הצלחת הזו odorant בטמפרטורת החדר בבית הבליעה luminometer במשך 5 דקות (איור 2B) (הקלטה luminometer לא נדרשת כאן).
2. להגדיר את luminometer כדי להקליט את הפריה חוץ גופית עם 0 s של עיכוב במהלך מחזורי 20 יחידות מידה צלחת של 90 s עם 0.7 s של מרווח הזמן בין מחזורים.
3. לפני שקראתי את הצלחת, הסר את לוחית odorant מן החדר. להוסיף 25 µL של odorant בין הבארות של צלחת 96-ובכן המכילות את התאים (אל תוסיף את odorant ב הבארות המכילות את התאים) ולהתחיל במהירות את המידה הפריה חוץ גופית של כל בארות עבור 20 מעגלים בתוך 30 דקות (איור 2C).

6. הסרת odorant הנותרים בפנים Luminometer

1. לפתוח את הדלת של luminometer. הכנס את הצינור מחובר את משאבת ואקום.
2. Odorants ואקום בקריאה קאמרית בהרחבה (לפחות 2 שעות, רצוי למשך הלילה) בין שני odorants למניעת זיהום צולב של שיכללו חומרים נדיפים ריח מהניסוי אחד למשנהו. להחליף אוויר על-ידי שליחת אוויר דחוס במהלך 5 דקות לפני המקננת את odorant הבא.

7. ניתוח נתונים

1. יצא את הנתונים בתוכנת ה-luminometer.
2. ממוצע משכפל את הדבר או עבור כל זמן ההקלטה. לחשב התגובה או מנורמל שליטה בסופו של דבר (למשל, וקטור ריק, איור 3א ו סעיף תוצאות נציג) על-ידי חלוקת הערך שליטה בממוצע לחדר הניתוח בממוצע ערך בכל מועד הקלטה (איור 3B התוצאות נציג מדור).
3. לנרמל את התגובה או כל פעילות הבסיס שלהם על-ידי חלוקת התגובה או בממוצע ב 0 s לכל תשובה זמן הקלטה (ראה איור 3ג' , סעיף תוצאות נציג).
4. לחשב את השטח מתחת העקומה של כל או כדי לקבל ערך יחיד או תגובה. כדי לעשות זאת, לסכם את כל הערכים הפריה חוץ גופית כל זמן ההקלטה עבור כל או.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הוקרנו התגובה של שלושה העכבר ORs, Olfr746, Olfr124, Olfr1093 באמצעות גירוי אדי cinnamaldehyde (איור 3). במקביל, השתמשנו פקד וקטור ריק (Rho-pCI) כדי להבטיח כי פעילות odorant-induced ORs שנבדקו היו ספציפיות (איור 3א). הפעלת בזמן אמת ORs על גירוי odorant אדי היה בפיקוח מדידה מעל 20 מחזורים. הנתו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

התפיסה של ריח תלויה באופן מהותי ההפעלה של ORs. כתוצאה מכך, הבנה של הפונקציונליות שלהם נדרש כדי לפצח את המנגנון מורכבות המשתמשות המוח להבחין סביבתו כימיים נדיפים. עם זאת, ההבנה של תהליך זה יש כבר הקשו על ידי הקשיים בהקמת שיטה חזקה למסך את הרפרטואר או פונקציונליות נגד odorants במבחנה. תא והביט...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/µL plasmid - store at 4 °C