気相で、嗅覚による嗅覚受容体活性化の In Vitro モニタリング リアルタイム

要約

生理的には、嗅覚受容体は匂い分子気相に吸入によってアクティブ化されます。ただし、ほとんどの in vitro システムは、液相嗅覚刺激を利用します。嗅覚刺激による気相匂い物質受容体活性化のリアルタイムでの in vitro の監視を可能にする方法を紹介します。

要約

嗅覚は嗅覚受容体と匂い分子の相互作用で始まる (または) 嗅覚ニューロン (国連) によって表現されます。臭気の認識に続く組合せの符号化方式、1 つまたは一連の匂いによってアクティブにできる、1 つの匂いが嗅覚受容体の組み合わせをアクティブ化できます。このような組合せのコーディング、生物は検出し、揮発性の匂い分子の無数の間で区別できます。したがって、所定濃度の臭気で記述できる、嗅覚受容体の活性化パターン各臭気に固有であります。その意味で、脳を使用して臭気が必要理解匂いを知覚するメカニズムを割れ-または相互作用。これはなぜ嗅覚コミュニティが"デ orphanize"これらの受容器にコミットです。臭気物質を識別するために使用される従来の in vitro システム-相互作用は嗅覚、インキュベーター携帯メディアを利用する ORs と対話する前に鼻粘膜に蒸気匂い解散による悪臭の自然の検出とは異なるであるか。ここでは、気相匂いを経由してまたはアクティベーションをリアルタイムで監視できる新しい手法について述べる。本手法は、Glosensor のアッセイを用いた発光によるキャンプ リリースを測定に依存します。それは生体内および生体外でのアプローチとの間の現在のギャップをブリッジし、バイオミメティック揮発性化学センサーの基礎を提供します。

概要

嗅覚には、ドライブの動作や感情に揮発性化学物質の環境と対話する陸生動物ことができます。基本的に、臭気の検出プロセスは嗅覚受容体 (ORs)¹のレベルで、嗅覚システムと匂い分子の非常に最初の対話から始まります。哺乳類、ORs 個別²嗅上皮にある嗅覚の感覚ニューロン (OSNs) で表されます。彼らは、G タンパク質共役受容体 (GPCR) 家族にロドプシンのような亜科 (クラス A とも呼ばれます) をより正確に属します。ORs のカップル、促進 G 蛋白質 G_olfが活性化 cAMP の産生が続く環状ヌクレオチド ゲート チャネルの開口部と活動電位の発生に 。それが受け入れられる匂い知覚を活性化 Or^3,4の特定のパターンに依存している、従って臭気の認識続く組合せの符号化方式、1 つまたは一連の匂いによってアクティブにできる、1 つの臭気物質をアクティブにできます、ORs の組み合わせ。このような組合せのコーディング、それは生物が検出でき、揮発性の匂い分子の無数の間で区別を仮定したが。匂いを知覚する方法を理解するキーの 1 つは理解する、どのようにと ORs は与えられた臭気によって活性化されます。

臭気物質を解明する試みで- または相互作用、体外機能アッセイは、重要な役割を果たしています。ORs (OR オーファン) の孤児アゴニスト匂いリガンドの同定は、過去 20 年間、様々 な生体内および生体内機能アッセイ^{5,6,7 ex 体外を使用して非常にアクティブなフィールドをされています。 ,8,9,10、11,12,13,14,15,16、 17}。

In vitro アッセイ システムは ORs、機能的なドメインと、ORs として潜在的なエンジニア リング アプリケーションの重要な残基を識別するなどの詳細な機能解析に最適です。しかし、さらに ORs の貴重な培養システムの開発に一部養殖 OSNs の難しさと異種細胞における嗅覚受容体の機能発現のための挑戦をされています。嗅覚のマッピング機能嗅覚受容体の細胞表面発現の許可プロトコルを確立する最初の課題であった-または相互作用。いくつかの独立したグループは、様々 なアプローチ^{5,6,7,8,9,10、11,12を利用して 14,18,19,20}。初期成果の一つは Krautwurst らによって作られたロドプシン (Rho-タグ) の短縮シーケンスと ORs の N 末端タグし、人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 細胞¹³で改善された表面式を観察。またはシーケンスに付属のタグに作られたバリエーションはまだまたは表現と機能^19、21の改善のために探検パスです。斎藤ら.は、受容体輸送蛋白質 1 (RTP1) を識別および RTP2 または人身売買を促進します。²² RTP1、呼ばれる RTP1S の短いバージョンは、元蛋白質²³よりも効果的であることも示されています。開発 G_olfを安定して表現する細胞株 (Hana3A) の REEP1、RTP1、RTP2 ²⁴, 環状アデノシン一リン酸 (cAMP) 記者の使用と相まってが匂いの識別を有効になって-または相互作用。RTP 蛋白質族が嗅覚受容体の細胞表面発現を促進するメカニズムはまだ未定します。

これらの確立された方法の 1 つの警告は、匂い刺激中に分解済み媒体を置き換えることにより細胞を刺激することを意味液体相における嗅覚刺激に依存していることです。これは匂い分子気相の嗅上皮に到達し、溶解することによって鼻粘膜に ORs をアクティブにする生理学的条件から非常に異なります。密接に関連する生理学的刺激の露出のように、サンスら²⁰セル井戸の上に配置プラスチック フィルムの内側の面の下にハングアップする臭気物質溶液の一滴を適用することによって蒸気の刺激に基づくアッセイを提案しました。彼らは、蛍光強度を監視することによってカルシウム応答を記録しました。本法では、気相嗅覚刺激を使用する最初が、それはまたは活性化の大規模なスクリーニングを許可しませんでした。

ここでは、Glosensor の試金 (図 1) によって蒸気相嗅覚刺激を経由して体外またはアクティベーションのリアルタイム モニタ リングを可能にする新しい方法を開発しました。この試金は液体の匂い刺激^{18,19,25,26,27,28,29,}のコンテキストで以前使用されています^30,31. 監視、ルミノ商工はまずプレート (図 1A) を読む前に気化した匂いと平衡に達した。匂い分子が関心、RTP1S と Glosensor 蛋白質 (図 1B) の OR を発現する Hana3A 細胞を入浴、バッファーに溶媒和になります。匂いは OR のアゴニスト、またはバインド G_olfアデニル酸シクラーゼ (AC) を活性化されると最終的に上昇する cAMP のレベルを引き起こす活性構造への切り替えこの上昇のキャンプにバインドし、発光ルシフェリンを触媒を生成する Glosensor 蛋白質をアクティブにします。この発光は、ルミノ メーターで記録し、またはライセンス認証の監視を有効に。このメソッドは、悪臭の自然な知覚に近い生体外でシステムをもたらすそれコンテキストまたは deorphanization の関心が高いのです。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1. Hana3A 細胞培養

1. M10 を準備 (最小必須培地 (MEM) プラス 10 %v/v ウシ胎児血清 (FBS)) と M10PSF (M10 100 μ g/mL ペニシリン-ストレプトマイシンと 1.25 μ g/mL アムホテリシン B プラス)。
2. 37 ° C、5% 二酸化炭素 (CO₂) でインキュベーターで 100 mm 細胞培養皿の M10PSF の 10 mL の細胞を培養します。
3. 20% の比率で 2 日おきのセルを分割: 位相差顕微鏡下で細胞 (約 1.1 × 10 の⁷セル) の 100% 合流点を観測すると、メディアを熱望し、10 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で軽くセルを洗浄しています。
4. PBS を吸引し、0.05% トリプシン - エチレンジアミン四酢酸 (EDTA、0.48 mM) の 3 mL を追加します。セルのプレートから関連付けが解除されるまで、約 1 分間行動をしましょう。
5. 5 mL のトリプシンを不活化し、最終的に上下にピペッティングでプレートに接続されたままセルをデタッチ M10 を追加します。
6. 15 mL チューブにボリューム (8 mL) を転送し 200 x gで 5 分間吸引上澄みで遠心し、M10PSF の 5 mL に上下に任意のセルの質量を破るピペッティングにより細胞を再懸濁します。チューブ内の気泡を作成しないでください。
7. 新しい 100 ミリメートル細胞培養皿の再懸濁細胞溶液 1 mL を転送し、新鮮な M10PSF の 9 mL を追加します。37 ° C と 5% CO₂で孵化させなさい。

2. セルの Transfection のための準備

1. 位相差顕微鏡下で観察することによって、合流やセル数を評価します。少なくとも 1 つのプレートに合流 10% (約 1.1 × 10 の⁶セル) が必要があります。
2. メディアを吸引し、10 mL の PBS で軽く細胞を洗ってください。PBS を吸引し、EDTA の 3 mL を加えます。セルのプレートから関連付けが解除されるまで、常温で約 1 分の行動をしましょう。
3. 5 mL のトリプシンを不活化し、最終的に上下にピペッティングでプレートに接続されたままセルをデタッチ M10 を追加します。15 mL チューブと 200 x gで 5 分間遠心するボリューム (8 mL) を転送します。
4. 上清を吸引し、M10PSF の 5 mL に上下に任意のセルの質量を破るピペッティングにより細胞を再懸濁します。チューブ内の気泡を作成しないでください。
5. トランスフェクションする板の数、に応じて適切な対応する M10PSF 量と貯留層における細胞の適切な量を転送します。1 つの 96 ウェル プレートは、6 mL の容量に到達する M10PSF で希釈した 100% コンフルエント 100 mm ディッシュ (約 1.1 × 10 の⁶セル) の 1/10、めっきする必要があります。100% 合流 100 mm 皿から始まる 1 つの 96 ウェル プレート、新鮮な M10PSF 5.5 mL に再懸濁細胞の 5 mL から 500 μ L を追加します。空気の泡を発生させることがなく細胞と M10PSF をミックスします。
6. マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートの各ウェルに浮遊細胞の 50 μ L をピペットします。37 ° C、5% CO₂で一晩インキュベートします。

3. プラスミド トランスフェクション

1. 96 ウェル プレート 30% と 50% 間セル合流を保証するために位相差顕微鏡下で観察します。
2. プレート全体に共通のプラスミドを含む最初のトランスフェクション ミックスを準備 (RTP1S、または Glosensor タンパク質、材料表を参照してください) 次の表 1のボリューム。通知の数量 Rho タグ OR はいくつか場合、ORs の数で割る必要がある ORs。
   注:我々 強くアドバイスを実験計画に空のベクター ネガティブ コントロール (ここ Rho pCI) と任意の肯定的な制御 (または知られているテストの匂いに対応する) を追加します。
3. MEM の 500 μ L と Lipofectamine 2000 試薬の 20 μ L を含む 2 番目のトランスフェクション ミックスを準備 (1 つの 96 ウェル プレートの有効な材料の表を参照してください)。最初の 1 つ 2 番目のミックスを追加、優しく上下にピペッティングによるミックスし、室温で 15 分間インキュベートします。M10 の 5 mL を加え、軽く混ぜます。
4. 最終的なトランスフェクション メディアの 50 μ L で以前 platted 96 ウェル プレートで M10PSF を交換してください。37 ° C、5% CO₂インキュベーター セットで孵化させなさい、ルミノ一晩次の手順 6 で説明した手順の部屋を掃除します。

4. 基板インキュベーション

1. セル合流の 60% から 100% を保証するために位相差顕微鏡下で 96 ウェル プレートを確認します。準備刺激ソリューションのハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) ヒドロキシエチル piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、D-グルコースの 5 mM 10 mM を含みます。
2. キャンプの試薬の 75 μ L を希釈 (を参照してください材料表) 2.75 mL 刺激ソリューションにソリューション。トランスフェクション媒体を 96 ウェル プレートから外し、新鮮な刺激溶液 50 μ L を各ウェルに追加することによって、細胞を洗浄します。
3. 刺激ソリューションを削除し、各ウェルに 4.2 の手順でキャンプ試薬溶液の 25 μ L を追加します。96 ウェル プレート 2 h の暗く、無臭の環境 (たとえば、化学物質や臭気物質の任意のソースから遠く離れたきれいな空引き出し) に室温で孵化させなさい。

5. 嗅覚刺激

1. まず、ルミノ チャンバー内に揮発性芳香物質分子を平衡します。鉱物油 (図 2A) の 10 mL に望ましい集中に臭気物質を希釈します。キャンプ試薬インキュベーション時間の終わりの前に新しい 96 ウェル プレートで (ないセルを含む 1) 臭気物質溶液の 25 μ L を追加します。5 分 (図 2B) (ルミノ記録は不要ですここ) ルミノ室内の室温でこの匂いプレートを孵化させなさい。
2. 設定 0 で発光を記録するルミノ 90 のプレートの測定 20 サイクル中に遅延の s 0.7 のサイクル間隔の s。
3. プレートを読むと、直前には、商工会議所から匂いプレートを取り外します。(セルを含む井戸で、嗅覚を追加しないでください) セルを含む 96 ウェル プレートのウェル間の匂いを 25 μ l 添加、20 サイクル (図 2C) の 30 分以内のすべての井戸の発光測定をすぐに開始します。

6、ルミノ内残存臭気物質の除去

1. ルミノのドアを開きます。真空ポンプに接続されているチューブを挿入します。
2. 読書で真空匂い部屋広く (少なくとも 2 時間、できれば一晩) 別に 1 つの実験からにおいの揮発性物質のクロス汚染を避けるために 2 つの匂いの間。次の嗅覚を孵化する前に 5 分間圧縮空気を送ることによって新鮮な空気と交換してください。

7. データ解析

1. ルミノ ソフトウェアからデータをエクスポートします。
2. 記録するたびに、同じ複製を平均します。またはコントロールの平均値で除して最終的なコントロール (例えば、空のベクター、図 3A代表の結果セクション) に正規化されたまたは応答各録音時 (図 3B の値の平均を計算します。と代表の結果セクション)。
3. 0 で平均または応答を割ることによって彼らの基底の活動、各または応答を正規化 (参照してください図 3Cと代表の結果セクション) の各録音時間応答する s。
4. 単一または応答値を取得する各または曲線の下の領域を計算します。これを行うには、各 OR の各録音時間の発光値を合計します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

3 マウス ORs、Olfr746、Olfr124、Olfr1093 の応答で仕切った桂皮アルデヒド蒸気の刺激 (図 3) を使用します。テストの嗅覚受容体の匂いによる活動が特定されたことを保証するために空のベクター コントロール (Rho-pCI) を用いて同時に (図 3A)。蒸気嗅覚刺激に ORs のリアルタイム アクティブ化は、監視対象の以上 20 の測定サイクルだった。?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

臭気の認識は根本的に嗅覚受容体の活性化に依存しています。その結果、それらの機能の理解がその揮発性の化学的環境を知覚する脳を使用して、複雑なメカニズムを解読する必要です。しかし、このプロセスの理解は、匂いの in vitro.に対して機能またはレパートリーを選別する手法を確立する難しさによって妨げられています。携帯タグ受容体^13,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/µL plasmid - store at 4 °C