실시간 체 외 Odorant 수용 체 활성화는 Odorant 수증기 단계에서의 모니터링

요약

순수, odorant 수용 체 odorant 분자 수증기 단계에서 흡입에 의해 활성화 됩니다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 시스템 활용 액체 단계 odorant 자극. 여기, 선물이 odorant 자극 기상에 따라 odorant 수용 체 활성화의 실시간 생체 외에서 모니터링 수 방법.

초록

후 각 인식 odorant 수용 체와 odorants의 상호 작용으로 시작 (또는) 후 각 감각 신경 (OSN)에 의해 표현. 냄새 인식 조합 코딩 구성표, 어디 하나 또는 odorants의 세트에 의해 활성화 될 수 있다와 하나의 odorant ORs의 조합을 활성화할 수 있습니다 다음과 같습니다. 이러한 조합 코딩을 통해 생물 감지 하 고 휘발성 냄새 분자의 무수 한 사이 차별 수 있습니다. 따라서, 주어진된 농도에서 냄새는 각 냄새에, ORs의 활성화 패턴으로 설명할 수 있습니다. 그런 의미에서 두뇌를 사용 하 여 냄새 필요 이해 odorant 인식 메커니즘 크래킹-또는 상호 작용. 이 때문에 후각이 지역 사회는 "-orphanize" 이러한 수용 체. 기존의 체 외 시스템 odorant 식별 하는 데 사용-또는 상호 작용 이용 잠복기 셀 미디어 odorant, ORs와 상호 작용 하기 전에 비 강 점 막에 증기 odorants 해산을 통해 냄새의 자연 검색에서 별개입니다. 여기, 우리는 기상 odorants 통해 또는 활성화의 실시간 모니터링을 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 캠프 릴리스 Glosensor 분석 결과 사용 하 여 발광 측정에 의존 합니다. 그것은 현재 간격 vivo에서 그리고 생체 외에서 접근을 다리 고 biomimetic 휘발성 화학 센서에 대 한 기반을 제공 합니다.

서문

냄새의 감각 지상파 동물을 그들의 휘발성 화학 환경 드라이브 행동과 감정에 작용할 수 있습니다. 근본적으로, 냄새 탐지 과정 odorant 수용 체 (ORs)¹의 수준에 후 각 시스템과 odorant 분자의 첫 상호 작용으로 시작 됩니다. 포유류에서 ORs 개별적으로 후 각 감각 신경 (OSNs)²후 각 상피 위치한 표현 됩니다. 그들은 rhodopsin 같은 하위 가족 (클래스 A 라고도 함) 보다 정확 하 게 G-단백질 결합 수용 체 (GPCR) 가족에 속한다. ORs는 물질로 G 단백질 G_olf 의 활성화 캠프 생산 주기적인 뉴클레오티드 문을 단 수로의 개통 및 활동 전위의 발생에 이르게 된 커플. 그것은 허용 냄새 percept 활성화 ORs^,34 의 특정 패턴에 의존 하 고 따라서 냄새 인식와 조합 코딩 체계, 한 또는 odorants의 세트에 의해 활성화 될 수 있다와 하나의 odorant 활성화할 수 있는 ORs의 조합입니다. 그리고 이러한 조합 코딩을 통해 그것은 가정 하는 생물 감지 하 고 휘발성 냄새 분자의 무수 한 사이 차별. 냄새 인식 하는 방법을 이해 하는 열쇠 중 하나를 이해 하는 방법 및 ORs 주어진된 냄새에 의해 활성화 되는.

Odorant 명료 하 게 하려고-또는 상호 작용, 생체 기능 분석은 필수적인 역할을 했다. 고아 ORs (OR 드 orphanization)에 대 한 길 항 제 향기가 ligands의 식별 다양 한 생체 외에서, 비보, vivo에서 기능 분석 실험^{5,6,7 전을 통해 지난 20 년간 매우 활성 필드 되었습니다. ,8,9,10,11,12,13,,1415,16, 17}.

생체 외에서 분석 결과 시스템은 ORs, 식별 기능 도메인 및 ORs, 잠재적인 엔지니어링 응용 프로그램의 중요 한 잔류물 등의 상세한 기능 특성에 가장 적합. 그러나, 추가 ORs 위한 귀중 한 생체 외에서 시스템의 개발 자란 OSNs와 어려움과 분리 셀에서 ORs의 기능적 표현 때문에 부분에 도전이 되었습니다. 첫 번째 도전 odorant의 매핑 기능 ORs의 세포 표면 표현에 대 한 허용 하는 프로토콜 설정 있 었-또는 상호 작용. 다양 한 접근^{5,6,7,,89,10,11,12을 활용 하는 독립적인 그룹 수 14,18,,1920}. 초기 성과 중 하나는 Krautwurst 그 외 여러분에 의해 만들어진에 N-말단 ORs의 rhodopsin (Rho-태그)의 단축 시퀀스를 태그 하 고 인간 미 발달 신장 (HEK) 셀¹³에 향상 된 표면 식을 관찰. 유사 또는 시퀀스에 연결 된 태그를 여전히 OR 표현과 기능^19,21을 향상을 위한 탐험 경로입니다. 사이토 외. 다음 수용 체 수송 단백질 1 (RTP1) 식별 및 RTP2 OR 매매를 용이 하 게. ²² RTP1, RTP1S, 라는의 짧은 버전 원래 단백질²³보다 훨씬 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다 또한. 개발 선의 셀 (Hana3A) G_olf를 안정적으로 표현, REEP1, RTP1, RTP2 ²⁴, 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 기자 들의 사용과 함께 odorant의 활성화-또는 상호 작용. 단백질의 RTP 가족 ORs의 세포 표면 표현 촉진 메커니즘 확인할 수 있다.

이러한 설립된 방법의 하나 주의할 그들이 odorant 자극 액체 단계에서 odorants 자극 매체에 미리 용 해 세포를 자극 하는 매체를 대체 하 여 의미에 의존입니다. 이 생리 적인 조건 odorant 분자 수증기 단계에서 후 각 상피에 도달 하 고 비 강 점 막에 의해 해산 ORs를 활성화 매우 다릅니다. 더 밀접 하 게 닮은 순수 관련 자극 노출, 펠 레 외.²⁰ 플라스틱 필름 셀 웰 스 상단에 배치의 내부 얼굴 아래 걸어 odorant 솔루션의 방울을 적용 하 여 증기 자극에 따라 분석 결과 제안. 그들은 형광 강도 모니터링 하 여 칼슘 응답을 기록 했다. 이 메서드는 공기 단계 odorant 자극을 사용 하 여 처음 하지만 또는 활성화의 큰 심사를 허용 하지 않았다.

여기, 우리는 Glosensor 분석 결과 (그림 1)에 의해 증기 위상 odorant 자극을 통해 생체 외에서 또는 활성화의 실시간 모니터링 하는 새로운 방법을 개발 했다. 이 분석 결과 이전 액체 odorant 자극^{18,19,25,26,,2728,29,} 의 맥락에서 사용 되었습니다. ^{30 , 31}. 모니터링 챔버는 루미 노의 플레이트 (그림 1A)를 읽기 전에 증발된 odorant와 equilibrated 처음 이다. Odorant 분자는 버퍼, 관심, RTP1S 및 Glosensor 단백질 (그림 1B) OR을 표현 하는 Hana3A 세포 목욕으로 solvated. odorant or 주 작동 근 이면 OR 전환 활성화 나 란 하 고 바인딩할 G_olfadenylyl 있고 (AC), 활성화 되며 궁극적으로 캠프 레벨 상승 원인이. 이 상승 캠프 바인딩할 하 고 발광 소 catalyzing를 생성 하는 Glosensor 단백질을 활성화할 것 이다. 이 발광 다음는 루미 노에 의해 기록 되 고 또는 활성화 모니터링. 이 메서드는 또는 deorphanization의 문맥에 높은 관심의 냄새의 자연 인식에 생체 외에서 시스템 가까이 제공로 서.

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프로토콜

1. Hana3A 셀 문화

1. M10 준비 (최소 필수 매체 (MEM) 플러스 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청 (FBS))와 M10PSF (m 10와 100 µ g/mL 페니실린-스 및 1.25 µ g/mL 암포 B).
2. 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO₂)에서 설정 하는 인큐베이터에서 100 mm 셀 문화 접시에 M10PSF의 10 mL에 셀 문화.
3. 분할 셀 20% 비율로 매 2 일: 셀 (약 10⁷ 셀 x 1.1)의 100% 합류 단계 대조 현미경 관찰은, 미디어를 갈망 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL와 함께 부드럽게 세포를 씻어.
4. PBS를 발음 하 고 0.05 %trypsin 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA, 0.48 m m)의 3 mL를 추가 합니다. 셀 접시에서 해리 될 때까지 약 1 분 동안 행동 하자.
5. 하는 트립 신을 비활성화 하 고 결국 아래로 pipetting으로 접시에 여전히 연결 된 셀 분리 M10의 5 mL를 추가 합니다.
6. 15 mL 튜브를 볼륨 (8 mL)를 전송 5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 200 x g 에서 원심 및 위쪽 및 아래쪽을 셀 대량 pipetting으로 M10PSF의 5 mL로 세포를 resuspend. 튜브에 거품을 만들지 마십시오.
7. Resuspended 셀 솔루션 새로운 100 mm 셀 문화 접시에서의 1 mL를 전송 하 고 신선한 M10PSF의 9 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO₂에서 품 어.

2입니다. 세포 Transfection에 대 한 준비

1. 단계 대조 현미경으로 관찰 하 여 합류, 또는 세포의 수를 평가 합니다. 적어도 10% 합류 (약 10⁶ 셀 x 1.1) 한 접시에 필요한.
2. 미디어를 발음 하 고 부드럽게 10 mL의 PBS로 세포를 씻어. PBS를 발음 하 고 EDTA의 3 mL를 추가 합니다. 셀 접시에서 해리 될 때까지 실내 온도에, 대략 1 분 동안 행동 하자.
3. 하는 트립 신을 비활성화 하 고 결국 아래로 pipetting으로 접시에 여전히 연결 된 셀 분리 M10의 5 mL를 추가 합니다. 15 mL 튜브를 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리기 (8 mL) 볼륨을 전송.
4. 상쾌한 발음 하 고 위쪽 및 아래쪽을 셀 대량 pipetting으로 M10PSF의 5 mL로 세포를 resuspend. 튜브에 거품을 만들지 마십시오.
5. 페 수에 번호판의 수에 따라 적당 한 양만큼 저수지에 셀의 M10PSF의 적절 한 해당 볼륨을 전송. 한 96 잘 접시 6 mL의 총 볼륨에 도달 하는 M10PSF에 희석 100% confluent 100 mm 접시 (약 10⁶ 셀 x 1.1)의 1/10으로 도금 한다. 한 96 잘 접시 100% 합류 100 mm 접시로 시작, 신선한 M10PSF의 5.5 mL를 사용 resuspended 셀의 5 mL에서 500 µ L을 추가 합니다. 공기 거품을 생성 하지 않고 셀과 M10PSF를 혼합.
6. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 각 음에 일시 중단 된 셀의 50 µ L 플라스틱. 37 ° C, 5% CO₂에서 밤새 품 어.

3. 플라스 미드 Transfection

1. 30%와 50% 사이 셀 합류 보장 단계 대조 현미경 96 잘 접시를 관찰 합니다.
2. 전체 접시에 일반적인 플라스 미드를 포함 하는 첫 번째 transfection 믹스를 준비 (RTP1S, 또는 Glosensor 단백질, 테이블의 자료를 참조 하 고) 다음 표 1에 볼륨. 통보의 수량 여러 경우로 태그 OR ORs의 수로 분할 되어야 ORs.
   참고: 우리가 강력 하 게 조언 빈 벡터 부정적인 제어 (여기로 pCI) 및 어떤 긍정적인 제어 (테스트 odorant에 응답 또는 알려진) 실험 계획을 추가 하려면.
3. MEM의 500 µ L의 Lipofectamine 2000 시 약 20 µ L을 포함 하는 두 번째 transfection 믹스를 준비 (적합 한 96 잘 접시, 테이블의 자료를 참조). 첫 번째, 두 번째 믹스를 추가 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 섞어 실 온에서 15 분 동안 품 어. M10의 5 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
4. 최종 transfection 미디어의 50 µ L에 의해 이전 platted 96 잘 접시에 M10PSF를 교체 합니다. 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기에서에서 incubate 및 루미 노 하룻밤 다음 6 단계에 설명 된 절차의 챔버를 진공.

4. 기판 부 화

1. 60%와 100% 사이 셀 합류 보장 단계 대조 현미경 96 잘 접시를 관찰 합니다. 자극 솔루션의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 10 mM의 hydroxyethyl piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 및 D-포도 당의 5 mM을 포함 준비.
2. 75 µ L 캠프 시 약의 희석 (참조 테이블의 재료) 자극 솔루션의 2.75 mL 해결책. 96 잘 접시에서 transfection 매체를 제거 하 고 각 음을 신선한 자극 솔루션의 50 µ L을 추가 하 여 셀을 세척.
3. 자극 솔루션을 제거 하 고 25 µ L 캠프 시 약 해결책 단계 4.2 각 영역에서에서 준비의 추가. 실내 온도 2 h에 대 한 어둡고 냄새 없는 환경 (예: 화학 물질 또는 odorant 소스에서 멀리 떨어져 깨끗 한 빈 서랍) 96 잘 접시를 품 어.

5. Odorant 자극

1. 첫째, 휘발성 odorant 분자와 루미 노 챔버 equilibrate. 미네랄 오일 (그림 2A) 10 mL에 원하는 농도에 odorant 희석. 캠프 시 보육 시간 끝나기 전에 추가 25 µ L odorant 솔루션의 새로운 96 잘 접시에서 (아니라 셀을 포함 하는 하나). 실내 온도 5 분 (그림 2B) (루미 노 기록 없음)가 필요 합니다 여기 루미 노 챔버에이 odorant 접시를 품 어.
2. 설정 기록 0 발광을 루미 노 s 90의 격판덮개 측정의 20 주기 동안 지연의 0.7의 주기 사이 간격의 s.
3. 접시를 읽기 전에 바로 상공에서 odorant 플레이트를 제거 합니다. (추가 하지 않으면는 odorant 우물을 포함 하는 셀) 셀에 포함 된 96 잘 접시의 우물 사이 odorant의 25 µ L을 추가 하 고 신속 하 게 30 분 (그림 2C) 이내 20 사이클에 대 한 모든 우물의 발광 측정을 시작.

6. 나머지 odorant는 루미 노 안에 제거

1. 루미 노의 문을 열으십시오. 진공 펌프에 연결 하는 튜브를 삽입 합니다.
2. 독서에 진공 odorants 챔버 광범위 하 게 (적어도 2 h, 선호 하룻밤) 다른 한 실험에서 냄새 휘발성의 교차 오염을 피하기 위하여 두 odorants 사이. 다음 odorant 잠복기 전에 5 분 동안 압축 공기를 전송 하 여 신선한 공기를 바꿉니다.

7. 데이터 분석

1. 루미 노 소프트웨어에서 데이터를 내보냅니다.
2. 녹화 때마다 또는 동일의 복제를 평균. OR 평균 하는 컨트롤 값을 분할 하 여 최종 컨트롤 (예: 빈 벡터 그림 3A , 대표적인 결과 섹션)를 정규화 또는 응답 각 녹화 시간 (그림 3B에 값 평균을 계산합니다 및 대표적인 결과 섹션).
3. 0에서 평균된 또는 응답을 분할 하 여 각 OR에 대 한 응답의 기저 활동을 표준화 각 녹음 시간 응답 (참조 그림 3C 와 대표적인 결과 섹션)에 s.
4. 단일 또는 응답 값을 가져오기 위해 각 OR의 곡선 아래의 영역을 계산 합니다. 이렇게 하려면 각 OR에 대 한 각 녹음 시간의 모든 발광 값을 합계 하십시오.

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결과

우리는 3 개의 마우스 ORs, Olfr746, Olfr124 및 Olfr1093의 응답 상영 cinnamaldehyde 증기 자극 (그림 3)를 사용 하 여. 동시에, 우리는 테스트 ORs의 odorant 유발 활동은 특정 보장 빈 벡터 제어 (Rho-pCI) 사용 (그림 3A). 증기 odorant 자극 시 ORs의 실시간 활성화 모니터링된 20 측정 주기를 했다. 각 데이터 잘 했다 먼저 정규화 빈 벡터 제어 평균 값을 각 주기 (<...

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토론

냄새의 인식을 근본적으로 ORs의 활성화에 따라 달라 집니다. 따라서, 그들의 기능에 대 한 이해는 뇌의 휘발성 화학 환경 인식에 사용 하는 복잡 한 메커니즘을 깰 필요 합니다. 그러나,이 과정의 이해는 생체 외에서 odorants. 에 대 한 기능 또는 레 퍼 토리에 강력한 방법 수립에 어려움에 의해 방해 되었습니다. 셀 태그 수용 체^13,19 의 창조와 발견?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/µL plasmid - store at 4 °C