In-vitro-Überwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung durch einen Geruchsstoff in der Dampfphase in Echtzeit

Zusammenfassung

Physiologisch werden durch Geruchsstoff Moleküle in der Dampfphase eingeatmet Geruchsstoff Rezeptoren aktiviert. Jedoch verwenden die meisten in-vitro-Systeme Flüssigphase Geruchsstoff Stimulation. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die erlaubt, in-vitro-Echtzeitüberwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung bei Geruchsstoff Stimulation in der Dampfphase.

Zusammenfassung

Olfaktorischen Wahrnehmung beginnt mit dem Zusammenspiel von Riechstoffen mit Duftstoff-Rezeptoren (oder) durch olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSN) ausgedrückt. Geruch-Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff kann eine Kombination von Regionen in äußerster Randlage zu aktivieren. Organismen können durch solche kombinatorische Codierung erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. So kann ein Geruch in einer bestimmten Konzentration beschrieben werden durch ein Aktivierungsmuster von Regionen in äußerster Randlage, die ist spezifisch für jeden Geruch. In diesem Sinne knacken die Mechanismen, die das Gehirn benutzt, um Geruch erfordert Verständnis Geruchsstoff wahrnehmen-OR-Interaktionen. Deshalb die Geruchssinn Gemeinschaft verpflichtet "diese Rezeptoren de-orphanize" ist. Konventionellen in-vitro-Systeme zur Identifizierung von Duftstoff- oder Wechselwirkungen verwendet haben Inkubation Zelle Medien mit Duftstoff, die unterscheidet sich von der natürlichen Erkennung von Gerüchen über Dampf Geruchsstoffe Auflösung in Nasenschleimhaut vor Interaktion mit ORs. Hier beschreiben wir eine neue Methode, die ermöglicht die Echtzeitüberwachung der OR-Aktivierung per Dampfphase Geruchsstoffe. Unsere Methode basiert auf Messung cAMP Freigabe durch Lumineszenz unter Verwendung der Glosensor-Assay. Es überbrückt Lücken zwischen in vivo und in-vitro-Ansätzen und bildet die Grundlage für eine biomimetische flüchtiger chemischer Sensor.

Einleitung

Der Geruchssinn ermöglicht terrestrischen Tieren interagieren mit ihren flüchtigen chemischen Umgebung Laufwerk Verhalten und Emotionen. Grundsätzlich beginnt die Geruch-Erkennung mit dem allerersten Zusammenspiel von Geruchsstoff Moleküle mit dem olfaktorischen System auf der Ebene der Geruchsstoff Rezeptoren (ORs)¹. Bei Säugetieren sind individuell olfaktorischen sensorischen Neuronen (Korrelationsmöglichkeiten) befindet sich in der olfaktorischen Epithel²Regionen in äußerster Randlage zum Ausdruck gebracht. Sie gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) Familie und genauer auf die Rhodopsin-ähnliche Unterfamilie (auch als Klasse A). Regionen in äußerster Randlage paar mit der stimulierende G Protein G_Olf deren Aktivierung zu Lager Produktion, gefolgt von der Eröffnung der zyklische Nukleotid geschlossene Kanäle und die Erzeugung von Aktionspotentialen führt. Es wird angenommen, dass ein Geruch der Wahrnehmung stützt sich auf ein bestimmtes Muster von aktivierten ORs^3,4 und deshalb Geruch Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff aktivieren kann ein Kombination von Regionen in äußerster Randlage. Und durch solche kombinatorische Codierung wird postuliert, daß Organismen erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. Ist einer der Schlüssel zum Verständnis, wie Gerüche wahrgenommen werden, zu verstehen wie und die Regionen in äußerster Randlage sind durch einen bestimmten Geruch aktiviert.

In einem Versuch, Geruchsstoff aufzuklären- oder Wechselwirkungen, in-vitro-funktionelle Untersuchungen eine wesentliche Rolle gespielt haben. Die Identifizierung der Agonist duftende Liganden für Waise ORs (OR de Orphanization) ist seit den letzten zwanzig Jahren durch den Einsatz von verschiedenen in-vitro-, ex-Vivo- und in-vivo funktionelle Assays^{5,6,7 ein sehr aktives Feld ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17}.

In-vitro-Test-Systeme eignen sich am besten für die detaillierte funktionelle Charakterisierung der Regionen in äußerster Randlage, einschließlich Ermittlung der Funktionsbereiche und kritische Rückstände von Regionen in äußerster Randlage sowie mögliche technische Anwendungen. Jedoch hat weitere wertvolle in-vitro-Systeme für Regionen in äußerster Randlage eine Herausforderung, im Teil wegen Schwierigkeiten mit der Kultivierung Korrelationsmöglichkeiten und funktionelle Expression von ORs in heterologen Zellen entwickelt. Die erste Herausforderung gewesen, Protokolle zu etablieren, die für die Zelle Oberflächenexpression von funktionalen ORs in der Zuordnung der Geruchsstoff erlaubt-OR-Interaktionen. Eine Reihe von unabhängigen Gruppen haben verschiedene Ansätze^{5,6,7,8,9,10,11,12genutzt, 14,18,19,20}. Eine der frühesten Errungenschaften wurde von Krautwurst Et Al. in der N-Terminus von Regionen in äußerster Randlage mit einem verkürzten Abfolge von Rhodopsin (Rho-Tag) markiert und eine verbesserte Oberflächenexpression in menschlichen embryonalen Niere (HEK) Zellen¹³beobachtet. Variationen gemacht, um den Tag angebracht, die OR-Sequenz ist immer noch ein Weg zur Verbesserung der OR Ausdruck und Funktionalität^19,21erkundet. Saito Et Al. dann Rezeptor-der Transport von Protein 1 (RTP1) identifiziert und RTP2 die OR Handel erleichtern. ²² eine kürzere Version des RTP1, genannt RTP1S, hat auch gezeigt, sogar wirksamer als die ursprüngliche Protein²³sein. Die Entwicklung einer Zelllinie (Hana3A), stabil G_Olfausdrückt, REEP1, RTP1 und RTP2 ²⁴, gepaart mit dem Einsatz der zyklischen Adenosin Monophosphate (cAMP) Reporter ermöglichte Identifizierung der Duftstoff-OR-Interaktionen. Der Mechanismus, durch die die RTP-Familie von Proteinen fördert die Zelle Oberflächenexpression von Regionen in äußerster Randlage bleibt bestimmt werden.

Ein Nachteil dieser etablierten Methoden ist, dass sie verlassen sich auf Geruchsstoff Stimulation in der flüssigen Phase, d.h. Geruchsstoffe werden vorab in einer Stimulation Medium aufgelöst und stimulieren Zellen durch das Medium zu ersetzen. Dies unterscheidet sich sehr von den physiologischen Bedingungen wo Geruchsstoff Moleküle erreichen das Riechepithel in der Dampfphase und ORs durch Auflösung in der Nasenschleimhaut zu aktivieren. Um mehr physiologisch relevanten Reiz Belichtung ähneln, schlug Sanz Et Al.²⁰ einen Assay basierend auf Dampf Stimulation durch die Anwendung eines Tropfen Duftstoff Lösung hängen unter der Innenfläche aus einer Kunststofffolie auf Zelle Brunnen gelegt. Sie nahmen die Kalzium-Reaktionen durch die Überwachung der Fluoreszenzintensität. Diese Methode war die erste Luft-Phase Geruchsstoff Stimulation verwenden, aber es war es nicht möglich eine große Vorführung der OR-Aktivierung.

Hier entwickelten wir eine neue Methode, die es ermöglicht Echtzeit-Überwachung von in-vitro-OR-Aktivierung über Dampf Phase Geruchsstoff Stimulation durch die Glosensor-Assay (Abbildung 1). Dieser Test hat früher im Zusammenhang mit der flüssigen Duftstoff Stimulation^{18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31}. Überwachung Handelskammer die Luminometer ist zunächst equilibriert mit verdampftem Geruchsstoff vor der Platte lesen (Abb. 1A). Duftstoff-Moleküle sind dann solvatisierte in den Puffer, Baden Hana3A Zellen mit dem Ausdruck oder der Zinsen, RTP1S und die Glosensor Proteine (Abbildung 1B). Wenn der Geruchsstoff ein Agonist des OPS ist, wird OP wechseln Sie zu einer aktivierten Konformation G_Olf, Aktivierung der Adenylyl-Cyclase (AC) zu binden und letztlich dazu führen, dass cAMP Stufen zu steigen. Diese steigende Campingplätze zu binden und aktivieren das Glosensor Protein um Lumineszenz katalysieren Luciferin zu generieren. Diese Lumineszenz wird dann durch die Luminometer aufgezeichnet und OR Aktivierung Überwachung ermöglicht. Diese Methode ist von großem Interesse im Rahmen der OR Deorphanization, da es die natürliche Wahrnehmung von Gerüchen in-vitro-Systeme näher bringt.

Protokoll

(1) Hana3A Zellen Kultur

1. Bereiten Sie M10 (Minimum wesentliches Medium (MEM) zuzüglich 10 % V/V fetalen bovine Serum (FBS)) und M10PSF (M10 plus 100 µg/mL Penicillin-Streptomycin und 1,25 µg/mL Amphotericin B).
2. Kulturzellen Sie in 10 mL M10PSF in der Kulturschale 100 mm Zelle in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % Kohlendioxid (CO₂) festgelegt.
3. Alle 2 Tage bei einem Verhältnis von 20 % der Zellen zu teilen: Wenn 100 % Zusammenfluss von Zellen (ca. 1,1 x 10⁷ Zellen) unter dem Phasenkontrast-Mikroskop beobachtet wird, streben die Medien und die Zellen sanft mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu waschen.
4. Aspirieren Sie PBS und 3 mL 0,05 % Trypsin-Ethylen-Diamin-Tetraacetic Säure (EDTA, 0,48 mM). Lassen Sie ca. 1 min einwirken, bis die Zellen von der Platte zu distanzieren.
5. Fügen Sie 5 mL M10 zu inaktivieren die Trypsin und schließlich lösen die Zellen noch durch Pipettieren rauf und runter an der Platte befestigt.
6. Übertragen Sie die Lautstärke (8 mL) auf eine 15 mL-Tube und Zentrifugieren bei 200 X g für 5 min. Aspirat überstand und Aufschwemmen der Zellen in 5 mL M10PSF von oben und unten, um jede Zelle Masse brechen pipettieren. Vermeiden Sie Luftblasen in der Röhre.
7. Überführen Sie 1 mL der Lösung resuspendierte Zellen in eine neue Zelle Kulturschale 100 mm und 9 mL frisches M10PSF. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂.

2. Vorbereitung der Zellen zur Transfektion

1. Bewerten Sie Zusammenfluss oder die Anzahl der Zellen, indem sie unter dem Phasenkontrast-Mikroskop zu beobachten. Mindestens 10 % Zusammenfluss (ca. 1,1 x 10⁶ Zellen) braucht man für eine Platte.
2. Aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen sanft mit 10 mL PBS. Aspirieren Sie PBS und 3 mL EDTA. Lassen Sie für etwa 1 min bei Raumtemperatur, handeln, bis die Zellen von der Platte zu distanzieren.
3. Fügen Sie 5 mL M10 zu inaktivieren die Trypsin und schließlich lösen die Zellen noch durch Pipettieren rauf und runter an der Platte befestigt. Die Lautstärke (8 mL) eine 15 mL Tube und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min zu übertragen.
4. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen in 5 mL M10PSF von oben und unten, um jede Zelle Masse brechen pipettieren. Vermeiden Sie Luftblasen in der Röhre.
5. Abhängig von der Anzahl der Platten zu transfiziert werden übertragen einer entsprechenden Menge an Zellen in einem Stausee mit dem richtigen entsprechenden Volumen des M10PSF. Eine 96-Well-Platte sollte mit 1/10 der 100 % konfluierende 100 mm Platte (ca. 1,1 x 10⁶ -Zellen) in M10PSF zu einem Gesamtvolumen von 6 mL verdünnt plattiert. Fügen Sie für eine 96-Well-Platte mit einer 100 % Zusammenfluss 100 mm Schale ab 500 µL aus 5 mL resuspendierte Zellen 5,5 mL frisches M10PSF hinzu. Mischen Sie die Zellen und M10PSF ohne Luftblasen zu generieren.
6. Pipette 50 µL der suspendierten Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO₂.

(3) Plasmid Transfektion

1. Beobachten Sie die 96-Well-Platte unter dem Phasenkontrast-Mikroskop einen Zelle Zusammenfluss zwischen 30 % und 50 % versichern.
2. Bereiten Sie eine erste Transfektion Mischung, die die Plasmiden üblich, die gesamte Platte enthält (RTP1S, oder und Glosensor Protein, siehe Tabelle of Materials) nach Volumen in Tabelle 1. Beachten Sie, dass die Menge der Rho-Tags OR sollten geteilt durch die Anzahl der Regionen in äußerster Randlage, wenn mehrere Regionen in äußerster Randlage.
   Hinweis: Wir dringend Beratung der Experiment-Plan eine leerer Vektor Negativkontrolle (hier Rho-pCI) und eine Positivkontrolle (OR bekannt reagieren auf den getesteten Geruchsstoff) hinzu.
3. Bereiten Sie eine zweite Transfektion Mischung mit 500 µL MEM und 20 µL des Reagenz Lipofectamine 2000 (gültig für eine 96-Well-Platte, siehe Tabelle der Materialien). Erstens, die zweite Mischung hinzufügen und vorsichtig von oben und unten Pipettieren mischen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. 5 mL M10 hinzugeben und vorsichtig mischen.
4. Ersetzen Sie die M10PSF in die zuvor einengender 96-Well-Platte von 50 µL der endgültigen Transfektion Medien. Brüten in einem Inkubator auf 37 ° C und 5 % CO₂ und Vakuum-Kammer Luminometer Übernachtung folgende in Schritt 6 beschrieben.

(4) Substratinkubation

1. Beobachten Sie die 96-Well-Platte unter dem Phasenkontrast-Mikroskop einen Zelle Zusammenfluss zwischen 60 % und 100 % versichern. Bereiten Sie eine Stimulation Lösung von Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) mit 10 mM Hydroxyethyl Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) und 5 mM D-Glucose.
2. 75 µL des Lagers Reagenz zu verdünnen (siehe Table of Materials) Lösung für 2,75 mL der Lösung Stimulation. Die Transfektion Medium aus der 96-Well-Platte entfernen und Waschen der Zellen durch Zugabe von 50 µL frische Stimulation Lösung in jede Vertiefung.
3. Entfernen Sie die Stimulation-Lösung und fügen Sie 25 µL cAMP Reagenzlösung in Schritt 4.2 in jede Vertiefung vorbereitet hinzu. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur in einer dunklen und Geruchs-Umgebung (z. B. einer leeren Schublade fernab von Chemikalien oder einer beliebigen Geruchsstoff Quelle) für 2 h.

5. Geruchsstoff Stimulation

1. Erstens equilibrate Luminometer Kammer mit flüchtigen Geruchsstoff Moleküle. Verdünnen Sie den Geruchsstoff, die gewünschte Konzentration in 10 mL von Mineralöl (Abb. 2A). Fügen Sie vor dem Ende der Inkubationszeit cAMP Reagenz 25 µL der Duftstoff-Lösung in eine neue 96-Well-Platte (nicht den mit den Zellen). Inkubieren Sie diese Geruchsstoff Platte bei Raumtemperatur in der Luminometer Kammer für 5 min (Abbildung 2B) (keine Luminometer Aufnahme ist hier erforderlich).
2. Setzen die Luminometer aufzunehmen die Lumineszenz mit 0 s Verzögerung während 20 Zyklen der Platte Messung von 90 s mit 0,7 s des Intervalls zwischen den Zyklen.
3. Direkt vor dem Lesen der Plattenrandes, entfernen Sie die Geruchsstoff aus der Kammer. 25 µL Geruchsstoff zwischen den Brunnen von den 96-Well-Platte mit den Zellen (den Geruchsstoff in den Vertiefungen der Zellen nicht hinzufügen) hinzufügen und schnell beginnen die Lumineszenz-Messung alle Brunnen für 20 Zyklen innerhalb von 30 min (Abbildung 2C).

6. Entfernung der restlichen Geruchsstoff innerhalb der Luminometer

1. Öffnen Sie die Tür von der Luminometer. Legen Sie das Rohr an der Vakuumpumpe angeschlossen.
2. Vakuum Geruchsstoffe in der Lesung Kammer ausführlich (mindestens 2 Stunden, am besten über Nacht) zwischen zwei Geruchsstoffe Kreuzkontamination von Volatiles Geruch aus einem Experiment zum anderen zu vermeiden. Ersetzen Sie durch Frischluft per Druckluft während 5 min vor den nächsten Geruchsstoff bebrüten.

7. die Datenanalyse

1. Exportieren Sie die Daten aus der Luminometer Software.
2. Durchschnitt der Wiederholungen desselben oder für jede Aufnahme. Berechnen Sie die normalisierten OR Reaktion auf eventuelle Steuerelemente (z. B. leerer Vektor, Abbildung 3A und repräsentative Ergebnisse Abschnitt) durch Division der gemittelt Kontrollwert in den OP Wert bei jeder Aufnahme (Abbildung 3Bgemittelt und repräsentative Ergebnisse Abschnitt).
3. Normalisieren der einzelnen OR auf ihre basale Aktivität dividiert die gemittelte OR Antwort auf 0 s zu jeder Aufnahme Zeitverhalten (siehe Abbildung 3C und repräsentative Ergebnisse Abschnitt).
4. Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve jeder OP, einen einzelnen Wert oder Antwort zu erhalten. Dazu addieren Sie die Lumineszenz-Werte jedes Aufnahmezeit für jede OP.

Ergebnisse

Wir sehen die Reaktion der drei Maus ORs, Olfr746, Olfr124 und Olfr1093 mit Zimtaldehyd Dampf Stimulation (Abbildung 3). Gleichzeitig verwendet wir eine leere Vektorregelung (Rho-pCI) um sicherzustellen, dass die Duftstoff-induzierten Aktivitäten der getesteten Regionen in äußerster Randlage bestimmte waren(Abbildung 3). Die Echtzeit-Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage auf Dampf Geruchsstoff Reiz war überwachten über 20 Messzyk...

Diskussion

Die Wahrnehmung der Geruch ist wesentlich abhängig von der Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage. Infolgedessen ist Verständnis ihrer Funktionalität erforderlich, um die komplexen Mechanismen, mit denen das Gehirn seine flüchtige chemische Umgebung wahrnehmen zu knacken. Jedoch wurde das Verständnis dieses Prozesses durch die Schwierigkeiten bei der Einrichtung einer robusten Methode der OR-Repertoire für Funktionalität gegen Riechstoffe in-vitro-. auf dem Bildschirm behindert Zelle Oberfläche...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/µL plasmid - store at 4 °C