In tempo reale In Vitro monitoraggio dell'attivazione del recettore Odorant da un Odorant in fase gassosa

Riepilogo

Fisiologicamente, odorant recettori sono attivati da molecole odorant inalati in fase gassosa. Tuttavia, più sistemi in vitro utilizzano stimolazione odorant fase liquida. Qui, presentiamo un metodo che consente il monitoraggio in tempo reale in vitro dell'attivazione del recettore odorant stimolazione odorant in fase vapore.

Abstract

Percezione olfattiva inizia con l'interazione di odorizzazione con recettori odorant (o) espressi dai neuroni sensoriali olfattivi (OSN). Riconoscimento di odore segue uno schema di codifica combinatorio, dove uno o può essere attivato da un set di odorizzazione e una odorant può attivare una combinazione di ORs. Attraverso tale codifica combinatoria, organismi possono rilevare e discriminare tra una miriade di molecole odorose volatili. Così, un odore a una data concentrazione può essere descritto da un modello di attivazione di ORs, che è specifico per ogni odore. In questo senso, i meccanismi che il cervello utilizza per percepire odore richiede la comprensione odorant di cracking-interazioni OR. Ecco perché la comunità di olfatto è impegnata a "de-orphanize" questi recettori. Sistemi in vitro convenzionali utilizzati per identificare odorant- o interazioni hanno utilizzato incubazione delle cellule media con odorant, che è distinto dal rilevamento naturale degli odori tramite dissoluzione odoranti del vapore nella mucosa nasale prima di interagire con ORs. Qui, descriviamo un nuovo metodo che consente il monitoraggio in tempo reale di attivazione OR via odoranti di fase del vapore. Il nostro metodo si basa sul rilascio campo di misura di luminescenza usando l'analisi di Glosensor. E colma le lacune attuali tra approcci in vivo e in vitro e fornisce una base per un sensore chimico volatile biomimetici.

Introduzione

Il senso dell'olfatto permette animali terrestri interagire con il loro ambiente chimico volatile per unità comportamenti ed emozioni. Fondamentalmente, il processo di rilevamento di odore comincia con la prima interazione di molecole odorant con il sistema olfattivo, a livello di odorizzante recettori (ORs)¹. Nei mammiferi, ORs individualmente sono espressi nei neuroni sensoriali olfattivi (OSNs) situati in epitelio olfattivo². Appartengono alla famiglia del ricevitore (GPCR) accoppiati a proteine G e più precisamente alla rodopsina-come Sub-famiglia (anche chiamato classe A). Coppia di ORs con stimolatore G proteine G_olf cui attivazione porta alla produzione di cAMP seguita dall'apertura di canali di gated nucleotide ciclico e la generazione di potenziali d'azione. È accettato che una percezione di odore si basa su un modello specifico di attivato ORs^3,4 e quindi riconoscimento di odore segue uno schema di codifica combinatorio, dove uno o può essere attivato da un set di odorizzazione e una odorant può attivare un combinazione di ORs. E attraverso tale codifica combinatoria, è postulato che gli organismi possono rilevare e discriminare tra una miriade di molecole odorose volatili. Una delle chiavi per comprendere il modo in cui sono percepiti odori è capire come e quali ORs sono attivati da un determinato odore.

Nel tentativo di delucidare odorant- o interazioni, analisi funzionale in vitro hanno giocato un ruolo essenziale. L'identificazione di ligandi odorose agonista per orfano ORs (de-orphanization OR) è stato un campo molto attivo negli ultimi venti anni, attraverso l'uso di vari in vitro, ex vivo e saggi funzionali in vivo^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17}.

Sistemi di analisi in vitro sono più adatti per la dettagliata caratterizzazione funzionale di ORs, inclusa l'identificazione i domini funzionali e residui critici di ORs, nonché potenziali applicazioni di ingegneria. Tuttavia, ulteriore sviluppo di sistemi in vitro preziosi per ORs è stata una sfida, in parte a causa di difficoltà con coltura OSNs ed espressione funzionale di ORs in cellule eterologhe. La prima sfida era stato di stabilire protocolli consentiti per l'espressione di superficie delle cellule di ORs funzionale nella mappatura della odorant-interazioni OR. Un numero di gruppi indipendenti hanno utilizzato vari approcci^{5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20}. Uno dei primi risultati è stato effettuato da Krautwurst et in tag N-terminale di ORs con una sequenza abbreviata della rodopsina (Rho-tag) e osservato una miglioramento espressione di superficie di cellule embrionali umane del rene (HEK)¹³. Variazioni apportate il cartellino attaccato alla sequenza OR è ancora un percorso esplorato per migliorare OR espressione e funzionalità^19,21. Saito et al.. quindi identificato il recettore-il trasporto della proteina 1 (RTP1) e RTP2 che facilitano il traffico di OR. ²² una versione più breve di RTP1, chiamato RTP1S, ha anche dimostrata di essere ancor più efficace che la proteina originale²³. Lo sviluppo di una linea cellulare (Hana3A) che esprime stabilmente G_olf, REEP1, RTP1, RTP2 ²⁴, accoppiato con l'uso di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) reporter ha permesso la identificazione di odorant-interazioni OR. Il meccanismo da cui la famiglia RTP di proteine promuove espressione di superficie delle cellule di ORs rimane essere determinata.

Un avvertimento di questi metodi consolidati è che si basano sulla stimolazione odorant in fase liquida, ovvero odoranti sono pre-disciolti in un mezzo di stimolazione e stimolano le cellule sostituendo il mezzo. Questo è molto diverso dalle condizioni fisiologiche dove molecole odorant raggiungere l'epitelio olfattivo in fase vapore e attivare ORs di dissoluzione nella mucosa nasale. Per assomigliare più molto attentamente l'esposizione stimolo fisiologicamente rilevanti, Sanz et al.²⁰ proposto un test basato sulla stimolazione vapor applicando una goccia di soluzione di odorizzante per appendere sotto la faccia interna di una pellicola di plastica posizionata sulla cima di pozzi di cella. Hanno registrato le risposte di calcio monitorando l'intensità di fluorescenza. Questo metodo è stato il primo ad utilizzare la stimolazione odorant fase di aria, ma non consentiva una grande proiezione di attivazione OR.

Qui, abbiamo sviluppato un nuovo metodo che consente il monitoraggio in tempo reale di attivazione in vitro OR via stimolazione odorant fase di vapore mediante l'analisi di Glosensor (Figura 1). Questo test è stato utilizzato in precedenza nel contesto del liquido odorizzante stimolazione^{18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31}. la sezione monitoraggio del luminometro prima è equilibrata con odorant vaporizzato prima piastra di lettura (Figura 1A). Molecole odorant sono quindi solvatato nel buffer, balneazione Hana3A cellule che esprimono l'OR di interesse, RTP1S e le proteine Glosensor (Figura 1B). Se l'odorant è un agonista dell'OR, OR passare a una conformazione attivata e associare il G_olf, attivando l'adenilato ciclasi (AC) e infine causare livelli di cAMP a salire. Questo cAMP aumentante sarà associare a e attivare la proteina di Glosensor per generare luminescenza catalizzando luciferina. Questa luminescenza viene quindi registrato dal luminometro e consente il monitoraggio di attivazione OR. Questo metodo è di grande interesse nel contesto del deorphanization OR come porta sistemi in vitro più vicino alla naturale percezione di odori.

Protocollo

1. Hana3A cellule di cultura

1. Preparare M10 (Medium essenziale minimo (MEM) più 10% siero bovino fetale di v/v (FBS)) e M10PSF (M10 plus 100 µ g/mL di penicillina-streptomicina e 1.25 µ g/mL amfotericina B).
2. Coltura di cellule in 10 mL di M10PSF in una piastra di coltura cellulare di 100 mm in un incubatore a 37 ° C e 5% di anidride carbonica (CO₂).
3. Dividere le celle ogni 2 giorni con un rapporto di 20%: quando la confluenza del 100% delle cellule (circa 1,1 x 10⁷ cellule) è osservata con un microscopio a contrasto di fase, i media di aspirare e lavare le cellule delicatamente con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS).
4. Aspirare la PBS e aggiungere 3 mL di 0.05% tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 0,48 mM). Lasciare agire per circa 1 min, fino a quando le cellule si dissociano dalla piastra.
5. Aggiungere 5 mL di M10 per inattivare la tripsina e finalmente staccare le cellule ancora attaccate alla piastra pipettando su e giù.
6. Trasferire il volume (8 mL) in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min. aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 mL di M10PSF pipettando su e giù per rompere qualsiasi cellula massa. Evitare la creazione di bolle nel tubo.
7. Trasferire 1 mL della soluzione di sedimento cellule in una piastra di coltura cellulare 100mm nuovo e aggiungere 9 mL di M10PSF fresco. Incubare a 37 ° C e 5% CO₂.

2. preparazione delle cellule per la transfezione

1. Valutare la confluenza, o il numero di celle, osservandoli con un microscopio a contrasto di fase. Almeno 10% confluenza (circa 1,1 x 10⁶ cellule) è necessaria per una piastra.
2. I media di aspirare e lavare le cellule delicatamente con 10 mL di PBS. Aspirare la PBS e aggiungere 3 mL di EDTA. Lasciare agire per circa 1 min a temperatura ambiente, fino a quando le cellule si dissociano dalla piastra.
3. Aggiungere 5 mL di M10 per inattivare la tripsina e finalmente staccare le cellule ancora attaccate alla piastra pipettando su e giù. Trasferire il volume (8 mL) in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min.
4. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 mL di M10PSF pipettando su e giù per rompere qualsiasi cellula massa. Evitare la creazione di bolle nel tubo.
5. A seconda del numero di piastre per essere transfected, trasferire una quantità appropriata di cellule in un serbatoio con il corretto volume corrispondente di M10PSF. Una piastra a 96 pozzetti deve essere placcata con 1/10 di un piatto di confluenti 100 mm 100% (circa 1,1 x 10⁶ cellule) diluito in M10PSF raggiungere un volume totale di 6 mL. Per una piastra a 96 pozzetti a partire con un piatto di 100 mm 100% confluenza, aggiungere 500 µ l dai 5 mL di sedimento centrifuga cellule a 5,5 mL di M10PSF fresco. Mescolare le cellule e M10PSF senza generare bolle d'aria.
6. Pipettare 50 µ l di cellule sospese in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO₂.

3. plasmide transfezione

1. Osservare la piastra a 96 pozzetti con un microscopio a contrasto di fase per assicurare una confluenza di cella tra 30% e 50%.
2. Preparare una miscela di transfezione prima che contiene i plasmidi comuni a tutta la piastra (RTP1S, o Glosensor della proteina, Vedi Tabella materialie) seguendo i volumi nella tabella 1. Si noti che la quantità di Rho-etichetta OR dovrebbe essere diviso per il numero di ORs se diversi ORs.
   Nota: Vi consiglio vivamente di aggiungere un controllo negativo vettore vuoto (qui Rho-pCI) e qualsiasi controllo positivo (OR noto a rispondere per la testata odorant) per il piano di esperimento.
3. Preparare una miscela di transfezione seconda contenente 500 µ l di MEM e 20 µ l di reagente di Lipofectamine 2000 (valido per una piastra a 96 pozzetti, Vedi Tabella materiali). Aggiungere il mix secondo al primo e mescolare delicatamente pipettando su e giù e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Aggiungere 5 mL di M10 e mescolare delicatamente.
4. Sostituire il M10PSF nella piastra 96 pozzetti precedentemente intrecciata da 50 µ l di media finale transfezione. Incubare in un set di incubatore a 37 ° C e 5% CO₂ e vuoto la camera del luminometro durante la notte seguente la procedura descritta nel passaggio 6.

4. incubazione del substrato

1. Osservare la piastra a 96 pozzetti con un microscopio a contrasto di fase per assicurare una confluenza di cella tra 60% e 100%. Preparare una soluzione di stimolazione di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) contenente 10 mM di idrossietil piperazineethanesulfonic acido (HEPES) e 5 mM di D-glucosio.
2. Diluire 75 µ l del reagente cAMP (vedere tabella materiali) soluzione a 2,75 mL della soluzione di stimolazione. Rimuovere il mezzo di transfezione dalla piastra a 96 pozzetti e lavare le cellule aggiungendo 50 µ l di soluzione fresca stimolazione ad ogni pozzetto.
3. Rimuovere la soluzione di stimolazione e aggiungere 25 µ l di soluzione di reagente accampamento preparata al punto 4.2 in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente in un ambiente scuro e inodore (ad esempio, un cassetto vuoto pulito lontano da prodotti chimici o qualsiasi fonte odorant) per 2 h.

5. Odorant stimolazione

1. In primo luogo, equilibrare la camera del luminometro con molecole odorant volatili. Diluire l'odorant fino alla concentrazione desiderata in 10 mL di olio minerale (Figura 2A). Prima della fine del tempo di incubazione di accampamento reagente, aggiungere 25 µ l della soluzione odorant in una nuova piastra a 96 pozzetti (non quello contenente le celle). Incubare la piastra odorant a temperatura nella camera di luminometro per 5 min (Figura 2B) (nessuna registrazione luminometro è necessaria qui).
2. Impostare il luminometro per registrare la luminescenza con 0 s di ritardo durante 20 cicli di misura piastra di 90 s con 0,7 s di intervallo tra i cicli.
3. Proprio prima di leggere la piastra, è necessario rimuovere la piastra odorant dalla camera. Aggiungere 25 µ l di odorizzante tra i pozzetti della piastra 96 pozzetti contenenti le celle (non aggiungere il odorant nei pozzetti contenenti le celle) e rapidamente avviare la misurazione di luminescenza di tutti i pozzetti per 20 cicli entro 30 min (Figura 2C).

6. rimozione del restante odorant dentro il luminometro

1. Aprire la porta del luminometro. Inserire il tubo collegato alla pompa del vuoto.
2. Odoranti vuoto nella lettura dell'alloggiamento estesamente (almeno 2H, preferibilmente durante la notte) tra due odoranti per evitare la contaminazione incrociata di sostanze volatili di odore da un esperimento a altro. Sostituire con aria fresca inviando aria compressa durante 5 min prima incubando la prossima odorant.

7. analisi dei dati

1. Esportare i dati dal luminometro.
2. Media la replica dello stesso o per ogni tempo di registrazione. Calcolare la risposta OR normalizzata a qualsiasi eventuale controllo (ad es., vettore vuoto, Figura 3A e sezione risultati rappresentativi) dividendo il valore di controllo in media in sala operatoria una media di valore in ogni momento di registrazione (Figura 3B e sezione risultati rappresentativi).
3. Normalizzare l'ogni risposta OR alla loro attività basale dividendo la risposta media OR a 0 s per ogni risposta di tempo di registrazione (Vedi Figura 3C e sezione risultati rappresentativi).
4. Calcolare l'area sotto la curva di ogni OR per ottenere un singolo valore di risposta OR. A tale scopo, è necessario sommare tutti i valori di luminescenza di ogni tempo di registrazione per ogni sala operatoria.

Risultati

Abbiamo proiettato la risposta di tre mouse ORs, Olfr746, Olfr124 e Olfr1093 utilizzando la stimolazione di cinnamaldeide vapor (Figura 3). Contemporaneamente, abbiamo utilizzato un controllo di vettore vuoto (Rho-pCI) per assicurare che le attività odorant-indotta delle RUP testate erano specifiche (Figura 3A). L'attivazione in tempo reale delle RUP su stimolo odorant vapor è stato monitorato misura oltre 20 cicli. I dati per ogni bene in pri...

Discussione

La percezione dell'odore è fondamentalmente dipenda l'attivazione di ORs. Di conseguenza, comprensione delle loro funzionalità è necessaria per rompere i complessi meccanismi che utilizzano il cervello a percepire l'ambiente chimico volatile. Tuttavia, la comprensione di questo processo è stata ostacolata dalle difficoltà nello stabilire un metodo affidabile per schermare il repertorio OR per funzionalità contro odoranti in vitro. Cella espressione eterologa e superficie di ORs è stato parzialmente risolt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/µL plasmid - store at 4 °C