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Resumo

Fisiologicamente, odorante receptores são ativados por moléculas odorant inaladas na fase de vapor. No entanto, mais sistemas in vitro utilizam o stimulation de odorante de fase líquida. Aqui, apresentamos um método que permite o monitoramento em tempo real e in vitro da ativação de receptores odorant após estimulação odorant em fase vapor.

Resumo

Percepção olfativa começa com a interação dos odorantes com os receptors odorant (ou) expressas pelos neurônios sensoriais olfativos (OSN). Reconhecimento de odor segue um esquema de codificação combinatório, onde um OR pode ser ativado por um conjunto de odores e um odorante pode ativar uma combinação de ORs. Através de tal codificação combinatória, organismos podem detectar e discriminar entre uma miríade de moléculas voláteis de odor. Assim, um odor em uma dada concentração pode ser descrito por um padrão de ativação do RUP, que é específico de cada odor. Nesse sentido, quebrando os mecanismos que o cérebro usa para perceber odor requer o entendimento odorant-interações OR. Eis porque a comunidade de olfação está empenhada em "de orphanize" estes receptores. Sistemas convencionais in-vitro, usados para identificar o odorant- ou interações têm utilizado a incubação mídia celular com odorante, que é distinta da natural detecção de odores através da dissolução de odores de vapor na mucosa nasal antes interagindo com RUP. Aqui, descrevemos um novo método que permite o monitoramento em tempo real de ativação OR através do vapor-fase odorantes. Nosso método se baseia na medição acampamento lançamento por luminescência usando o ensaio de Glosensor. Ele preenche lacunas atuais entre abordagens in vivo e in vitro e fornece uma base para um sensor de químicos voláteis biomimético.

Introdução

O sentido do olfato permite animais terrestres interagir com seu ambiente químico volátil para unidade comportamentos e emoções. Fundamentalmente, o processo de detecção de odor começa com a primeira interação de moléculas odorant com o sistema olfativo, ao nível da odorant receptores (ORs)1. Nos mamíferos, RUP individualmente são expressos em neurônios sensoriais olfativos (OSNs) localizados no epitélio olfatório2. Pertencem à família de receptores (GPCR) proteína G-acoplada e mais precisamente a rodopsina, como sub da família (também chamado de classe A). Casal de SRO com o estimulatórios G proteína Golf cuja ativação leva à produção de campo seguida a abertura de canais de nucleotídeo cíclico fechado e a geração de potenciais de ação. Aceita-se que um perceptivo de odor se baseia em um padrão específico de ativado ORs3,4 e, por conseguinte, o reconhecimento de odor segue um esquema de codificação combinatório, onde um OR pode ser ativado por um conjunto de odores e um odorante pode ativar um combinação de ORs. E através de tal codificação combinatória, postula-se que os organismos podem detectar e discriminar entre uma miríade de moléculas voláteis de odor. Uma das chaves para a compreensão de como os odores são percebidos é entender como e que RUP são ativadas por um determinado odor.

Na tentativa de elucidar odorant- ou interações, ensaios funcionais in vitro têm desempenhado um papel essencial. A identificação de ligantes odoríferos de agonista para órfão ORs (orphanization de OR) tem sido um campo muito ativo nos últimos vinte anos, através da utilização de vários in-vitro, ex vivo e in vivo de ensaios funcionais5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

Sistemas de ensaio in vitro são mais adequados para a caracterização funcional detalhada das RUP, incluindo a identificação dos domínios funcionais e resíduos críticos das regiões ultraperiféricas, bem como potenciais aplicações de engenharia. No entanto, mais desenvolvimento de sistemas in vitro valiosos para RUP tem sido um desafio, em parte devido à dificuldade com OSNs cultivo e expressão funcional das RUP em células heterólogos. O primeiro desafio foi estabelecer protocolos que permitiu a expressão de superfície celular de SRO funcional no mapeamento de odorante-interações OR. Um número de grupos independentes que utilizaram várias abordagens5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Uma das primeiras realizações foi feita por Krautwurst et al. em tagged N-terminal do RUP com uma sequência curta de rodopsina (Rho-marca) e observaram uma expressão superfície melhorada em células de rim humano embrionário (HEK)13. Variações feitas para a etiqueta colada à sequência de OR é ainda um caminho explorado para melhorar OR expressão e funcionalidade19,21. Saito et al.. , em seguida, identificou a proteína do receptor-transporte 1 (RTP1) e RTP2 que facilitem tráfico de OR. 22 uma versão mais curta da RTP1, chamado RTP1S, também foi mostrada para ser ainda mais eficaz do que a proteína original23. O desenvolvimento de uma linha de celular (Hana3A) que expressa estàvel Golf, REEP1, RTP1 e RTP2 24, juntamente com o uso de repórteres de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) permitiu a identificação de odorante-interações OR. O mecanismo pelo qual a família RTP de proteínas promove a expressão de superfície celular de SRO permanece para ser determinado.

Uma limitação destes métodos estabelecidos é que eles dependem de odorante estimulação na fase líquida, significando que odorantes pre-são dissolvidos em um meio de estimulação e estimulam as células, substituindo o meio. Isto é muito diferente as condições fisiológicas onde moléculas odorant atingir o epitélio olfatório em fase vapor e ativar SRO por dissolução em mucosa nasal. Para mais se assemelham a exposição de estímulo fisiologicamente relevantes, Sanz et al20 propôs um ensaio com base na estimulação vapor aplicando uma gota de solução de odorante para pendurar sob a face interna de um filme plástico colocado no topo de poços de célula. Eles gravaram as respostas de cálcio, monitorando a intensidade de fluorescência. Este método foi o primeiro a usar a estimulação de odorante ar-fase, mas não permitia uma grande seleção de ativação OR.

Aqui, nós desenvolvemos um novo método que permite o monitoramento em tempo real da ativação de OR in vitro através de estimulação de odorante de fase vapor por Glosensor ensaio (Figura 1). Este ensaio tem sido usado anteriormente no contexto do líquido odorant estimulação18,19,25,26,,27,28,29, 30 , 31. a câmara de vigilância do luminómetro primeiro é incubada com odorant vaporizado antes da placa (Figura 1A) de leitura. Odorant moléculas são então solvated o buffer, banhando as células Hana3A, expressando o ou de interesse, RTP1S e as proteínas Glosensor (Figura 1B). Se o odorant é um agonista dos OR, o OR mudar para o uma conformação registrada e vincular o Golf, ativando a adenilato ciclase (AC) e em última análise, causar níveis acampamento a subir. Este acampamento nascente irá vincular a e ativar a proteína Glosensor para gerar luminescência catalisar luciferina. Esta luminescência é então gravada pelo luminómetro e possibilita o monitoramento de ativação OR. Esse método é de grande interesse no contexto do deorphanization OR pois traz sistemas in vitro mais próxima à natural percepção de odores.

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Protocolo

1. Hana3A células de cultura

  1. Preparar M10 (meio essencial mínimo (MEM) mais 10% de soro bovino fetal (FBS) de v/v) e M10PSF (M10 e mais de 100 µ g/mL penicilina-estreptomicina e 1,25 µ g/mL anfotericina B).
  2. Cultura de células em 10 mL de M10PSF em um prato de cultura de célula de 100 mm em uma incubadora a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono (CO2).
  3. Divida as células a cada 2 dias na proporção de 20%: quando a confluência de 100% das células (aproximadamente 1.1 x 107 células) é observada sob um microscópio de contraste de fase, aspire a mídia e lavar as células suavemente com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS).
  4. Aspire PBS e adicionar 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 0.48 mM). Deixe agir por cerca de 1 min, até que as células se dissociam da placa.
  5. Adicione 5 mL de M10 para inactivar a tripsina e eventualmente separar as células ainda ligadas à placa pipetando para cima e para baixo.
  6. Transfira o volume (8 mL) para um tubo de 15 mL e centrifugar a 200 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de M10PSF pipetando acima e para baixo para quebrar qualquer célula em massa. Evite criar bolhas no tubo.
  7. Transferir 1 mL da solução de ressuspensão de células em um novo prato de cultura celular de 100mm e adicionar 9 mL de M10PSF fresco. Incube a 37 ° C e 5% de CO2.

2. preparação das células para transfeccao

  1. Avalie a confluência, ou o número de células, a observá-las sob um microscópio de contraste de fase. Pelo menos 10% confluência (aproximadamente 1.1 x 106 células) é necessária para um prato.
  2. Aspirar a mídia e lavar as células suavemente com 10 mL de PBS. Aspire PBS e adicionar 3 mL de EDTA. Deixe agir por aproximadamente 1 min à temperatura ambiente, até que as células se dissociam da placa.
  3. Adicione 5 mL de M10 para inactivar a tripsina e eventualmente separar as células ainda ligadas à placa pipetando para cima e para baixo. Transferi o volume (8 mL) para um tubo de 15 mL e centrifugar 200 x g por 5 min.
  4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de M10PSF pipetando acima e para baixo para quebrar qualquer célula em massa. Evite criar bolhas no tubo.
  5. Dependendo do número de placas a transfected, transferi uma quantidade adequada de células em um reservatório com adequado volume correspondente de M10PSF. Uma placa de 96 poços deve ser banhada com 1/10 de um prato de 100mm confluente de 100% (aproximadamente 1.1 x 106 células) diluído em M10PSF para atingir um volume total de 6 mL. Para uma placa de 96 poços começando com um prato de 100 mm de confluência de 100%, adicione 500 µ l da 5 mL de células ressuspensa para 5,5 mL de M10PSF fresco. Misture as células e M10PSF sem gerar bolhas de ar.
  6. Pipete 50 µ l de células suspensas em cada poço da placa de 96 poços, com uma pipeta multicanal. Incube durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.

3. plasmídeo Transfection

  1. Observe a placa de 96 poços sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência de célula entre 30% e 50%.
  2. Preparar uma mistura de transfeccao primeira que contém o plasmídeo comum para o prato inteiro (RTP1S, ou e proteína Glosensor, consulte Tabela de materiais) os volumes na tabela 1a seguir. Observe que a quantidade de Rho-tag OR deve ser dividido pelo número de regiões ultraperiféricas se vários ORs.
    Nota: Nós fortemente conselhos para adicionar um controle negativo do vetor vazio (aqui Rho-pCI) e qualquer controlo positivo (OR conhecido para responder para o odorant testado) para o plano de experimento.
  3. Preparar uma mistura de transfeccao segunda contendo 500 µ l de MEM e 20 µ l de reagente Lipofectamine 2000 (válido para uma placa de 96 poços, consulte Tabela de materiais). Adicione a mistura de segunda para o primeiro e misture suavemente pipetando para cima e para baixo e incube por 15 min à temperatura ambiente. Adicionar 5 mL de M10 e misture delicadamente.
  4. Substitua o M10PSF na placa de 96 poços anteriormente platted por 50 µ l da mídia final do transfection. Incubar em um conjunto de incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 e a câmara do luminómetro durante a noite seguinte o procedimento descrito na etapa 6 do vácuo.

4. substrato incubação

  1. Observe a placa de 96 poços sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência de célula entre 60% e 100%. Prepare uma solução de estimulação de Hank está equilibrado sal solução (HBSS) contendo 10 mM de hidroxietil piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) e 5 mM de D-glicose.
  2. Diluir 75 µ l de reagente de acampamento (ver tabela de materiais) solução para 2,75 mL da solução de estimulação. Remova o transfeccao da placa de 96 poços e lavar as células pela adição de 50 µ l de solução fresca de estimulação para cada poço.
  3. Remover a solução de estimulação e adicione 25 µ l de solução de reagente acampamento preparada na etapa 4.2 a cada poço. Incube a placa de 96 poços à temperatura ambiente em um ambiente escuro e odor-free (por exemplo, uma gaveta vazia limpa longe de produtos químicos ou qualquer fonte de odorante) por 2 h.

5. Odorant estimulação

  1. Primeiro, equilibrar a luminómetro câmara com moléculas voláteis odorante. Dilua o odorant para a concentração desejada em 10 mL de óleo mineral(Figura 2). Antes do fim do tempo de incubação do acampamento reagente, adicione 25 µ l da solução odorant em uma nova placa de 96 poços (não aquele que contém as células). Incube a esta placa odorant à temperatura na câmara luminómetro por 5 min (Figura 2B) (nenhuma gravação luminómetro é necessária aqui).
  2. Definir o luminómetro para gravar a luminescência com 0 s de atraso durante 20 ciclos de medição de placa de 90 s com 0,7 s de intervalo entre os ciclos.
  3. Bem antes de ler a placa, remova a placa odorant da câmara. Adicione 25 µ l de odorante entre os poços da placa de 96 poços, contendo as células (não adicione o odorant dos poços contendo as células) e rapidamente começar a medida de luminescência de todas as cavidades por 20 ciclos dentro de 30 min (Figura 2C).

6. remoção de odorante restante dentro o luminómetro

  1. Abra a porta do luminómetro. Introduza o tubo conectado à bomba de vácuo.
  2. Câmara de vácuo odorantes na leitura extensivamente (pelo menos 2 h, de preferência durante a noite) entre dois odorantes para evitar a contaminação cruzada de compostos voláteis de odor de um experimento para o outro. Substitua o ar fresco, enviando ar comprimido durante 5 min antes incubando o odorant próxima.

7. análise de dados

  1. Exporte os dados no luminómetro.
  2. Média de repetições da mesma ou para cada tempo de gravação. Calcular a resposta OR normalizada para qualquer eventual controle (por exemplo, vetor vazio, Figura 3A e seção de resultados representativos) dividindo o valor em média de controle para o bloco a média de valor em cada tempo de gravação (Figura 3B e resultados representativos seção).
  3. Normalizar a cada resposta OR a sua atividade basal, dividindo a resposta OR em média em 0 s para cada resposta de tempo de gravação (ver Figura 3C e seção de resultados representativos).
  4. Calcule a área sob a curva de cada ou para obter um único valor de resposta OR. Para fazer isso, soma todos os valores de luminescência de cada tempo de gravação para cada OR.

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Resultados

Nós selecionados a resposta de três rato RUP, Olfr746, Olfr124 e Olfr1093 usando estimulação vapor de cinamaldeído (Figura 3). Simultaneamente, usamos um controle de vetor vazio (Rho-pCI) para garantir que as atividades de odorante-induzida das RUP testadas foram específicas(Figura 3). A ativação em tempo real das RUP mediante estímulo de vapor odorante foi monitorado ciclos de medição mais de 20. Os dados para cada bem primeiro foram...

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Discussão

A percepção de odor é fundamentalmente dependente da ativação de ORs. Por conseguinte, compreensão de sua funcionalidade é necessária para quebrar os mecanismos complexos que usam o cérebro para perceber seu ambiente químico volátil. No entanto, a compreensão deste processo tem sido dificultada pelas dificuldades em estabelecer um método robusto para o repertório de OR para funcionalidade contra odores in vitro. da tela Célula expressão heteróloga e superfície do RUP foi parcialmente resolvido ...

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Divulgações

Y.F., H. K e H.M entrou com um pedido de patente relevante para este trabalho em 27 de outubro de 2016.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH (DC014423 e DC016224) e o defesa avançada pesquisa Agência RealNose projeto. YF permaneceu na Duke University, com apoio financeiro do programa JSPS para avanço estratégico internacional redes acelerar a circulação de talentosos pesquisadores (R2801). Agradecemos a Sahar Kaleem para edição do manuscrito.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05 % trypsin-EDTAGibco25300-0540.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish BD Falcon353003100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tubeBD Falcon35209917 mm x 120 mm conical tubes
96-well plateCorning384396 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
AmphotericinGibco15290-018Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machineJouanC312Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehoodNUAIRENU-407-500fumehood for cell culturing
FBSGibco16000-044Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP ReagentPromegaE1290GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2Fisher Scientific11-676-604Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagentInvitrogen11668-019Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMABMG LABTECHdiscontinued96 well plate reader for luminescence
Mineral oilSigmaM8410Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)Corning cellgro10-010-CVMinimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/StreptomycinSigma AldrichP4333Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensorPromegaE2301pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscopeLeica090-131.001phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1SH. Matsunami lab-100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

Referências

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