לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשילוב יעיל של פנים בלוקים סדרתיים וקרן יון ממוקדת סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני כדי למקד את אזור העניין. זה מאפשר חיפוש יעיל, בשלושה ממדים, ואיתור אירועים נדירים בתחום השקפה גדול.

Abstract

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה יעילה ויעילה של דגימות תא או רקמה בשלושה ממדים ברמת הרזולוציה של המיקרוסקופיה אלקטרון. במשך שנים רבות מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) נשאר טכניקה דו מימדית מיסודם. עם הופעתו של מיקרוסקופ סדרתי סריקה אלקטרונית טכניקות הדמיה (נפח EM), באמצעות קרן מיקרוטומה או ממוקדת משולבת או לחתוך לאחר מכן להציג רקמות מוטבעות, הממד השלישי הופך נגיש בקלות. בלוק סדרתי הפנים סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SBF-SEM) משתמשת באולטרה מיקרוטומה המצורפת לתא SEM. יש לו את היכולת להתמודד עם דגימות גדולות (1,000 יקרומטר x 1,000 יקרומטר) ותמונה שדות גדולים של תצוגה ב x קטן, Y פיקסל גודל, אבל הוא מוגבל בממד Z על ידי סכין היהלומים. קרן יון ממוקדת SEM (פרפור-SEM) אינו מוגבל ברזולוציה 3D, (isotropic voxels של ≤ 5 ננומטר הם השגה), אבל שדה התצוגה הוא הרבה יותר מוגבל. פרוטוקול זה מדגים זרימת עבודה לשילוב שתי הטכניקות כדי לאפשר מציאת אזורים בודדים של עניין (ROIs) בשדה גדול ולאחר מכן הדמיה של אמצעי האחסון שלאחר היעד ברזולוציה גבוהה isotropic voxel. הכנת תאים קבועים או רקמות תובענית יותר עבור טכניקות EM-volume עקב מנוגדים נוספים הדרושים ליצירת אותות יעילים הדמיה SEM. פרוטוקולים כאלה הם זמן רב ועבודה אינטנסיבית. פרוטוקול זה משלב גם המיקרוגל בסיוע עיבוד רקמות הקלה על חדירת ריאגנטים, אשר מפחית את הזמן הדרוש לפרוטוקול עיבוד מימים לשעות.

Introduction

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה עבור המיקוד היעיל של מיקרוסקופית אלקטרונים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה (EM) לאזור ספציפי של ריבית (ROI). מאז ראשיתה בשנות ה -30, EM הייתה טכניקה דו מימדית במהותה. התמונות הראשונות שפורסמו היו של רקמות או תאים שלמים, אבל במהרה נתן את הדרך למקטעים שנחתכו ביד באמצעות ultramicrotome והתמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM). TEM מייצרת מיקרוגרפים ברזולוציה גבוהה מאוד, שאפילו הקטנים ביותר של מבני הסלולר הם ברורים להבחין. עם זאת, את הקטע של הסעיף הדרוש כדי הרקמה להיות התמונה על ידי קרן האלקטרונים עשה מידע בממד Z מינימלי. מאחר שתאים הם מבנים תלת-ממדיים, יש להסיק אינטראקציות בין מבני תאים ומשטחי תאים מנתונים מוגבלים. זה העלה את הפוטנציאל לפרשנות, במיוחד במבנים שהיו מורכבים. כמה מיקרוסקוסטים הצליחו להשיג מבנים תלת-ממדיים מדויקים יותר על-ידי תאים ורקמות בעלי מבנה טורי ולאחר מכן לשחזר אותם בדקדקנות מתמונות TEM בודדות¹. זה היה תהליך אינטנסיבי מאוד לעבודה ולפני הופעתו של דימות דיגיטלי ועיבוד המחשב התוצאות היו גם קשה לדמיין. בשנים האחרונות הוצגו שתי טכניקות אשר הפכו באופן קולקטיבי המכונה אלקטרון מיקרוסקופ עוצמה (הכרך EM)² שהפכו אותם בשלושה ממדים נגישים למעבדות יותר.

הרעיון של קבלת ערימת תמונות מבלוק מוטבע בתוך מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן לעקוב חזרה 1981 כאשר סטיב לייטון ואלן קוזיריאן בנתה מיקרוטומה זעירים והניח אותו בחדר של מיקרוסקופ אלקטרון סריקה³ (sbf-SEM) . אב-טיפוס זה הועתק והשתפר לאחר 23 שנים על ידי Denk ו הורסטמאן⁴ ולאחר מכן ממוסחר. בערך באותו זמן מדענים ביולוגיים הפכו להיות מודעים לטכנולוגיה אחרת המשמשת בעיקר במדעי החומרים, קרן יון ממוקדת. טכניקה זו משתמשת קרן יון מסוג כלשהו (גליום, פלזמה) כדי להסיר כמות קטנה מאוד של חומר המשטח מתוך מדגם (פרפור-SEM)⁵. שתי הטכניקות מעסיקים בעקבות הדמיה המספקת סדרה של תמונות אשר ניתן לשלב לתוך X, Y, Z, מחסנית. שתי הטכניקות מספקות מידע תלת-ממדי, אך בקשקשים ברזולוציה שונים. SBF-SEM מוגבל על ידי המאפיינים הפיזיים של סכין היהלומים כדי פרוסות דק יותר 50 ננומטר עבור הדמיה סדרתית ארוכה פועל; אולם גודל הבלוק לדוגמה שניתן לשנות הוא גדול, עד 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ. בשל פורמט גדול של רכישה דיגיטלית של האחורי מפוזרים גלאי אלקטרון (32k x 32k פיקסלים) המקבל אות מפני הבלוק , גודלי פיקסלים של תמונה יכולים להיות קטנים כמו ננומטר אחד. התוצאה היא שאינו איזוטרופי voxels שבו הממד X, Y הוא לעתים קרובות קטן יותר Z. בגלל הדיוק של קרן יון, פרפור-SEM יש את היכולת לאסוף תמונות עם isotropic voxels ≤ 5 ננומטר. עם זאת, האזור הכולל שניתן לדימות הוא קטן למדי. טבלת סיכום של דוגמאות וכרכים שונים התמונה עם שתי הטכניקות פורסמה בעבר³.

הכנה לרקמת הדיסק האלקטרומגנטי קשה יותר מאשר עבור התקן TEM או SEM, משום שדגימות חייבות להיות מוכתמות כדי לספק יצירת אותות נאותים ב-SEM. לעתים קרובות, התקנים צריכים להיות ממוטבים לא רק עבור סוג הרקמה מסוים אלא גם עבור הוספה ניגוד מבנים סלולריים מסוימים כדי להפוך זיהוי ושחזור קל. הפרוטוקול המשמש כאן מבוסס על תקן NCMIR⁶. כתמים נוספים בדרך כלל פירושו שלבי פרוטוקול נוספים. כך עבור נפח EM, פרוטוקולים סטנדרטיים צריך להיות מורחב כדי להבטיח זמן מספיק עבור ריאגנטים לחדור את המדגם. מיקרוגל בסיוע בעיבוד יכול להפחית את הזמן הדרוש עבור כתמים משעות לדקות והופך לדוגמה EM נפח ההכנה יעיל יותר⁷. שיטה זו ישימה לכל סוגי תא ורקמות⁸ ולשאלות המחקר שבו החוסר ההומוגניות של הרקמה עושה דגימה של אזור מסוים חיוני⁹.

לאחר מקבל מחסנית נתונים ניתן ליישר את המבנים של עניין מחולק משאר הנתונים והמודל ב-3D. למרות אוטומציה של הדמיה פרוסות רבות של רקמה הפכה את רכישת התמונה פשוטה יחסית, תהליך של שחזור דיגיטלי והמחשה של הנתונים היא משימה גוזלת זמן. תוכנה למטרה זו עדיין אינה משולבת ואינה אוטומטית לחלוטין. מאז הרבה מהעבודה המוקדמת באמצעות אמצעי האחסון EM הונחה לקראת מדעי המוח, הטכניקות לצביעת והוספת מבנים באופן דיגיטלי כגון אקסונים הוא די מתקדם לעומת תאים אחרים ואורגלים. בעוד הספרות על רקמות אחרות שאינן נוירואליות גוברת במהירות, מבנים לא ליניאריים או לא סדיר דורשים קלט ידני יותר.

השימוש הן ב-SBF-SEM ו-d-SEM היא גישה שימושית עבור פילוח והדמיה ספציפיים, לא הומוגנית, רקמות מבנים ברזולוציה גבוהה ב-3D. שילוב זה עם המיקרוגל בסיוע עיבוד רקמות כי במידה מרבית מקטין את הזמן הדרוש להכנה לדוגמא. יחד זרימת עבודה זו תהפוך ליצירת נתונים ברזולוציה גבוהה isotropic voxel התמונה של מבנים משובחים תהליך יעיל ומהיר יותר.

Protocol

1. קיבעון ועיבוד לדוגמא למיקרוסקופיה אלקטרונית

1. תקן שתילים של Arabidopsis thaliana גדל על הצלחות אגר ב 0.5% פאראפורמלדהיד, 2.5% גלוטאלדהיד ב 0.1 M פוספט מאגר (PB) pH 6.8 עבור 2 h בטמפרטורת החדר (RT).
   התראה: אלהידס הם מזירים ומזיגנים ובעלי פוטנציאל סרטני, מוטאנמית וטרטוגניים. כל הפתרונות חייבים להיות מטופלים עם ציוד הגנה מתאים ובמנוע.
2. לגזור את קצות השורש של הצמח גדל בשלב 1.1 ולשים 2-3 טיפים ב 0.5 mL מכיל את אותו קבע לילה ב 4 ° c.
   הערה: כמות הנפח של כל הפתרונות בשלבים הנותרים נקבעת על-ידי אמצעי האחסון לדוגמה; יחס מינימלי של דגימה לפתרון הוא 10:1. דגימות גדול יותר מ-1 מ"מ בכל ממד יהיה קשה להכתים, כך העבודה עם גושי רקמות גדולים יותר קשה. לא לכל הרקמות יש את אותם התכונות; לדוגמה, עלי הצמח וגבעולים יכול להיות קשה להכתים. אם יש צורך בדגימות גדולות או ברקמות קשות, יש לבצע אופטימיזציה של עיבוד לדוגמה לפני המעבר לאיסוף נתונים.
3. הכינו את התמיסה החדשה (TCH), הדרושה טרייה וזמינה לפני שלב 1.7. הוסף 0.1 גרם של טאיוקרבוהיהידרצידה ל-10 מ ל של מים מזוקקים כפולים (ddH₂O) ומתמוסס על-ידי חימום ל 60 ° c בתנור במשך 1 h. לפני השימוש, לסנן את פתרון TCH באמצעות מסנן מזרק 0.22 יקרומטר.
4. הסר קבע מן הצינורות ולהחליף עם 0.1 M PB pH 6.8. לשים את הצינורות על שולחן לרעוד מסלולית ב 100 סל ד ולשטוף עבור 10 דקות. לחזור על הכביסה באמצעות PBS טרי 5 פעמים.
5. פוסט לתקן את עצות השורש על ידי החלפת PB עם 2% אוסמיום tetroxide (OsO₄) ו 0.2% רותניום אדום ב 0.1 M PB pH 6.8. שים את הצינורות במיקרוגל עם העפעפיים פתוחים ולהתחיל תוכנית 9 (טבלה 1).
   התראה: אוסמיום מסוכן מאוד במקרה של בליעה, מסוכנת מאוד במקרה של אינהלציה, ומסוכנת במקרה של מגע העור. תמיד לטפל באמצעות ציוד הגנה מתאים בתוך מכסה המנוע.
   הערה: במהלך הפרוטוקול, עפעפיו של הצינורות פתוחים תמיד במהלך מדרגות המיקרוגל.
6. שטוף את עצות השורש פעמיים עם ddH₂O עבור 5 דקות כל אחד על שחקן הספסל. עבור תוכנית הכביסה השלישית והרביעית לשימוש ברחיצת השולחנות 15 על המיקרוגל (שולחן1). לאחר 40 השנייה הראשונה ddH₂o לשטוף, לקחת דגימות מתוך המיקרוגל ולהחליף את המאגר עם טריים ddh₂O. לשים דגימות במיקרוגל ולהמשיך את התוכנית.
   הערה: המיקרוגל יישמע אזעקה כאשר יש לרענן את המאגר. ודא שהמכסה של תא הוואקום מוחלף כראוי בכל פעם.
7. מודטה דגימות ב-TCH שהוכנו בעבר ב-RT עבור 2 דקות על הספסל ועבור דגירה נוספת להשתמש במיקרוגל תוכנית 8 (שולחן 1). אין לשנות את הפתרון בין הספסל למיקרוגל.
8. שטוף דגימות כמתואר בשלב 1.6.
9. מקום דגימות ב 1% OsO₄ ב ddh₂O עבור תוכנית מיקרוגל 9 (שולחן 1).
10. שטוף דגימות כמתואר בשלב 1.6.
11. דגירה דגימות ב 1% uranyl אצטט ב ddH₂O באמצעות תוכנית מיקרוגל 16 (שולחן 1).
    התראה: uranyl אצטט הוא רעיל, מטרד ויש לו פוטנציאל קרצינוגני, מוטאנמית ו טרטוגניות. תמיד לטפל באמצעות ציוד הגנה מתאים.
12. שטוף דגימות כמתואר בשלב 1.6.
13. להכין את הפתרון המוביל של וולטון לשימוש בשלב 1.14. ראשית להפוך פתרון מניות של חומצה L-aspartic על ידי הוספת 0.998 g של חומצה L-aspartic 250 mL של ddH₂O והתאמת ה-pH ל 3.8 עם 1 M KOH. הבא, לפזר 0.066 g של העופרת חנקתי ב 10 מ ל של L-aspartic חומצה מניות הפתרון ולהתאים את ה-pH כדי 5.5. השאירו את התמיסה בתנור ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    הערה: אסור לזרז להיווצר.
14. מודטה דגימות בפתרון המוביל של וולטון עבור 30 דקות בתנור ב 60 ° c.
15. שטוף דגימות כמתואר בשלב 1.6.
16. הפחתת דגימות באטואה בשלבים מדורגים של 50%, 70%, 90% ב-ddH₂O, ולאחר מכן 2x ב 100% אטוח. שימוש בתוכנית המיקרוגל 10 (טבלה 1) והמיקרוגל יבקש ממשתמשים כל 40 s כדי להחליף את הפתרון עם הצעד השני של ה-אטוב. זה הצעד האחרון. שנעשה במיקרוגל
17. עוד מייבשים ב 100% פרופילן תחמוצת 2x עבור 10 דקות כל אחד ב RT על הספסל, החלפת הפתרון בין השלבים.
    הערה: תחמוצת פרופילן יכול לפזר כמה פלסטיק כגון polystyrenes; או להשתמש בבקבוקונים זכוכית עבור צעד זה או פלסטיק טרום ניסויים עבור התנגדות.
    התראה: תחמוצת פרופילן מאוד דליק. תמיד לטפל באמצעות ציוד הגנה מתאים בתוך מכסה המנוע.
18. התחל הסתננות של טיפים שורש על ידי הדגירה ב 50% שרף של ספאר ב תחמוצת פרופילן (מינימום 2 h).
    התראה: מרכיבי שרף של ספאר הם מתכלים. תמיד לטפל באמצעות ציוד הגנה מתאים בתוך מכסה המנוע.
19. החלף פתרון עם 100% של ספאר ולעזוב את הלילה ב RT.
20. שינוי חדש 100% שרף של ספאר 2 פעמים (מינימום 2 h incubations).
21. מניחים דגימות בתבנית הטבעה, מכילה שוב טרי 100% שרף של ספאר ופולימור בתנור ב-65 ° c עבור 36 עד 48 שעות.
    הערה: תבנית ההטבעה בשימוש תלויה בסוג הרקמה ובגישה המשמשת לדימות. כאן, שימשו עובש הטבעה סיליקון שטוח (איור 1A).

2. הכן דוגמאות מוטבעות להדמיה

1. להסיר דגימות מהתנור, להסיר שרף מתוך עובש הטבעה (איור 1B).
2. באמצעות להב תער, בערך לקצץ את המדגם לבלוק של מקסימום 0.5 מ"מ x 0.5 mm x 0.5 מ"מ (איור 1C).
   הערה: כדי למנוע טעינה ב-SBF-SEM, חשוב לחתוך משם כמו שרף חשוף הרבה ככל האפשר ולהפוך את המדגם כמו שטוח/דק ככל האפשר. באופן אידיאלי כל הצדדים של הבלוק מכילים את הרקמה כבר, אבל החשוב ביותר בצד אשר יהיה מצורף סיכת מתכת (ראה שלב 2.3) יש להכיל רקמות חשופות כך הרקמה היא במגע ישיר עם מתכת מוליך.
3. הסר את המדגם מן שרף חיצוני ולצרף אותו סיכת מתכת (איור 1D) עם שרף אפוקסי מוליך, וודא כי חלק של הרקמה נוגעת סיכת מתכת. תנו לאפוקסי להירפא למשך הלילה בתנור ב-65 ° c.
   הערה: ודא שהמדגם ממוקם במרכז הסיכה, מכיוון שתנועת השלב ב-SB-SEM מוגבלת. הסרת שרף מאוד קטן עטוף מדגם משרף נוסף יכול להיות קשה כמו מדגם קטן תהיה נטייה לעוף משם כאשר מנותקת. פתרון פשוט ואפקטיבי לכך הוא לכסות את המדגם עם גיליון של הסרט פרפין כפי שמוצג בסרט המשלים של התייחסות¹.
4. הדק את המנשא במחזיק האולטרה-מיקרוטומה. השתמש להב גילוח כדי להסיר את כל אפוקסי עודף ולהשתמש ultramicrotome וסכין יהלום להחליק את הפנים והצדדים של הבלוק, יצירת פירמידה. ודא שלפחות חלק מהרקמה כבר נחשפת על פני הבלוק.
   הערה: השלב הנוסף של שימוש בסכין יהלום הוא אופציונלי, אך הוא הופך את הבלוק המתקבל לקל יותר לגישה ב-SBF-SEM מכיוון שהצל של הסכין על פני הבלוק הוא ברור יותר ובכך גורם להערכת המרחק בין סכין לפנים לחסום קל יותר לקבוע.
5. מניחים את הבלוק לדוגמה גזוז בקואטר הציפוי ומעילו את המדגם בשכבה דקה (2-5 ננומטר) של פלטינה (Pt).
   הערה: הפלטינה על פני הבלוק תהיה נחתכת במהלך הגישה ב-SBF-SEM (ראה להלן), אך הפלטינה בצידי הפירמידה תספק מוליכות נוספת. בדוגמה זו, המדגם היה מצופה פלטינה, אבל זהב, או זהב/פלדיום הוא גם יעיל; עם זאת, ציפוי עם זהב הביא פסולת מוגברת על פני הבלוק במהלך לרוץ הדמיה.

3. הדמיה ב-SBF-SEM

1. הכנס את המנשא למיקרוסקופ SBF-SEM והבא את הסכין קרוב למשטח הדגימה. באמצעות סכין היהלומים לקצץ את החלק העליון של המדגם, כך שכבת Pt כבר הוסר ולפחות חלק הרקמה נחשפת.
   הערה: מאז תהליך זה שונה עבור כל מיקרוסקופ SBF-SEM, לא כל צעד מצוין כאן. כל עוד משטח המדגם חופשי מ-Pt ומוכן לדימות, השלבים הבאים יהיו אפשריים.
2. התחל בדימות ברזולוציה נמוכה וזמני שחזור קצרים כדי לקבל סקירה של המדגם ולאתר אזור מעניין (איור 1E).
   הערה: כאן, 512 x 512 פיקסלים ו-1 μs לשכון הזמן שימשו סריקה מהירה ומיקום של הבמה, 2,000 x 2,000 פיקסלים עם 1 μs לשכון זמן שימשו לאופטימיזציה של חלון הדמיה והתאמת פוקוס.
3. באמצעות מתח מואץ של 1.5-2.0 kV בזרם של 80-100 pA, לכידת תמונה של הרקמה.
   הערה: הדוגמה המוצגת כאן הייתה מוצגת על גבי מערכת ואקום גבוהה שבה הזרם צריך להיות מותאם כדי למזער את הטעינה, וזה תלוי במדגם. בדרך כלל, קרן האלקטרונים מוגדרת ל-1.5-2.0 kV אך זה יהיה תלוי לדוגמה. בעלי הגדלה גבוהה (בדרך כלל > 10, 000x) שרף הוא מושפע יותר מדי על ידי הקרן כדי להבטיח החלקה חלק, כך בדרך כלל פיקסל בגודל מוגדר 8-20 ננומטר בגודל תמונה של 8000-10000 x 8000-10000 פיקסלים עם המאגציות המתאימות של 430 – 1, 400x וגודלי שדה של 64 X 64 מ"מ ו 200 x 200 mm בהתאמה.
4. קבע אזור מעניין והחלט כמה מקטעים נחוצים כדי לכסות את כמות הריבית ולהפעיל את ההדמיה, תוך שימוש בגלאי האלקטרונים הפזורים בחזרה.
   הערה: בדוגמה המוצגת כאן, 500 סעיפים של 80 ננומטר הוצגו בתוך 10 פיקסלים ננומטר ו10,000 x 10,000 תמונות פיקסל (להתעכב זמן 1 μs). המיקרוסקופ הוגדר ל 1.6 kV ו 100 pA. באופן כללי, מספר המקטעים תלוי במדגם ובגודל של ה-ROI ויכול להשתנות מ-100 s ל-1,000 s של מקטעים עוקבים. ערכת הנתונים שתיווצר מורכבת מתמונות בודדות של כל מקטע. יש להמיר תמונות אלה למחסנית תלת-ממדית.

4. מעבד נתונים באמצעות SBF-SEM

1. באמצעות פיג'י, בחר ברצף התמונות של ייבוא קבצים ואתר את מחסנית התמונות כדי לטעון את התמונות. בהתאם לגודל של ערכת הנתונים, בדוק את התיבה ' השתמש במחסנית וירטואלית '.
   הערה: אם ערכת הנתונים היא באמת גדולה, ראשית להמיר אותה ל-8 סיביות (אם נאסף ב-16 סיביות) ואם יש צורך בסל הנתונים עד שיהיה לו גודל מעשי.
2. השימוש בלחצן ההפעלה שבתחתית התמונה מגולל דרך ערכת הנתונים כדי לראות אם הפעלת ההדמיה הצליחה. חפש חפצי הדמיה טיפוסיים עבור SBF-SEM, כגון סעיפים הנופלים מהסכין על פני הבלוק, טעינה באזורים של שרף חשוף, פריטים חיתוך של הסכין (קווים אופקיים על התמונה).
3. שימוש בתמונת הפקודה-מאפיינים מתאימים את גודל הפיקסל ואת עומק voxel (כלומר, עובי המקטע) המשמש במהלך ההפעלה. , אם הנתונים כבר מ, בסדר. קחו את זה בחשבון
4. באמצעות הפקודה הפלאגאינים לרישום-התאמה לינארית של מחסנית עם סינון כדי לרשום את הנתונים.
   הערה: יש צורך ברישום של נתוני SBF-SEM מאחר שייתכן שקיימת תנועה לדוגמה קלה במהלך ההדמיה עקב טעינה או הסחף של המדגם. מכיוון שזוהי רק תנועה מינימלית ב-XY, יש צורך רק בתרגום.
5. בדוק את היישור על-ידי גלילה בערכת הנתונים ואם אישור השתמש בפקודה save תחת תפריט הקובץ כדי לשמור את ערכת הנתונים המיושרת כקובץ 3D-tif.
6. נתח את ערכת הנתונים בקפידה כדי לבדוק אם ההחזר כלול ומכיל את המידע הדרוש לשאלה הביולוגית. בתמונה האחרונה של המחסנית (= הפרצוף החסום הנוכחי), בחר ROI חדש לדימות של פרפור-SEM.
   הערה: אם אין אזור טוב עבור הדמיה פרפור-SEM נוכח הנוכחי בלוק-הפנים, מקטעים נוספים ניתן לגזור מן הבלוק (שהוא עדיין ב-SBF-SEM) עד מופיע ROI. קיימת הגבלה לאמצעי האחסון שניתן לדימות עם ה-פרפור. ROI על התמונה sbf-SEM יכול להיות מקסימום X, Y של 30-40 יקרומטר X 15-20 יקרומטר.

5. הדמיה ממוחשבת

1. לקחת תמונות מבט כולל של המדגם ב-SBF-SEM, באופן אידיאלי כולל קצה אחד או יותר של המדגם, כי הם לזיהוי לאחר מכן ב פרפור-SEM (איור 2A, C).
   הערה: בדוגמה זו התמונות במבט כולל SBF-SEM צולמו בגודל 10 ננומטר פיקסל, 8,000 x 8,000 פיקסלים ב 1 μs לשכון זמן. המיקרוסקופ עדיין הוגדר ב 1.6 kV ו 100 pA.
2. הסר את הדגימה מתוך SBF-SEM ומקום בקומד התאים. לעיל את המדגם עם ≥ 20 פלטינה nm עבור הדמיה פרפור-SEM.
3. לטעון מדגם לתוך פרפור-SEM ובאמצעות גלאי אלקטרון משני ב 15 kV, 1 נה לאתר את הROI מזוהה ב-SBF-SEM על פני הבלוק (איור 2B, D).
   הערה: הדמיה ב 15 kV יש צורך לראות דרך ציפוי פלטינה.
4. הביאו את ה-ROI על המדגם לנקודת הצירוף של הקורות ה-פרפור ו-SEM, על ידי הזזת הבמה (איור 3A).
   הערה: העמודה פרפור מותקן בדרך כלל תחת זווית (איור 3A). משמעות הדבר היא שכל דגימה צריכה להיות מוטה באופן כזה שמשטח הדימות והמיתר ממוקם במקביל לאלומת הקרן. המשטח להיות בתמונה מוטה כעת ביחס קרן SEM ותעלה של רקמות צריך להיות מוסר לפני SEM הוא מסוגל לצלם את ROI (איור 3E)
5. באמצעות קרן פרפור ומערכת הזרקת גז, הפקדה 1 מ"מ שכבת הגנה של פלטינה על פני השטח מעל ROI (איור 3C). הבא, באמצעות הטחינה נמוך (50-100 pA), מיל קווים עדינים לתוך התצהיר פלטינה עבור התמקדות אוטומטית ו-3D מעקב במהלך לרוץ הדמיה (איור 3D). באמצעות הטור פרפור ומזרק גז פחמן, לכסות את הקווים האלה עם התצהיר פחמן.
   הערה: גודל ההחזר כאן מתאים לגודל התשואה על התמונה sbf-SEM והגודל המירבי יכול להיות 30-40 יקרומטר x 15-20 יקרומטר. בדוגמה זו ההחזר של 17 יקרומטר x 8 יקרומטר נוצר בתמונה. התצהיר פחמן נדרש להגנה על הקווים כדי ליצור ניגוד שחור לבן בין פחמן פלטינה אשר אידיאלית עבור התמקדות אוטומטית. את זרמי הטחינה המשמשים עבור כל שלב ניתן למצוא בטבלה 2.
6. באמצעות כרסום גבוה, טחנת תעלה של 30 יקרומטר לפני ההחזר, יצירת משטח הדמיה עבור קרן SEM (איור 3e).
   הערה: הקרן של פרפור הוא הרסני ביסודם, אפילו יותר בזרמים גבוהים. הקפד לשמור על הדמיה בזרמים גבוהים למינימום והתמונה בהגדלה נמוכה ומהירות סריקה מהירה כדי למנוע המסת שרף ב-ROI.
7. חלק את משטח ההדמיה עם כרסום הנוכחי קרוב לזרם המשמש במהלך ההדמיה. הפסק ליטוש כאשר כל המיקוד האוטומטי וסימני המעקב התלת-ממדיים גלויים בבירור על משטח ההדמיה (איור 3D). ההתקדמות של פרפור יכול להיות לאחר מכן הדמיה המשטח עם EM (באמצעות גלאי אלקטרונים מפוזרים לאחור) תוך ליטוש.
8. קבעו את האזור לדימות על פני השטח החדש שנוצר וקבעו את פרמטרי ההדמיה. ודאו שקרן האלקטרונים מתמקדת על פני השטח, קבעו את הבהירות והניגודיות וקבעו את עובי הפיקסל והחתך. שמור את זמן ההדמיה מתחת לדקה אחת על ידי התאמת הזמן להתעכב וממוצע קו.
   הערה: חשוב להשתמש במתח נמוך לדימות עם קרן האלקטרונים כדי להבטיח שרק המשטח של הבלוק הוא בתמונה (כלומר, שאין אלקטרונים מתוך המדגם עמוק יותר בתמונה). זה נעשה על ידי שמירה על מתח מתחת 2 kV ושימוש בגלאי אלקטרון מפוזר לאחור עם מתח הרשת, המאפשר אלקטרונים אנרגיה גבוהה רק כדי להיות בתמונה. בדוגמה זו, קרן האלקטרונים הוגדר ב 1.5 kV ו 1 nA עם מתח רשת של 1.2 kV על האחורי מפוזר גלאי אלקטרונים. גם כאן, בגודל פיקסל של 5 ננומטר שימש עם מקטעים 5nm כדי לגרום לערכת נתונים עם isotropic voxels. שטח של 17 יקרומטר x 10 יקרומטר היתה תמונה ב 6.5 μs להתעכב זמן ממוצע קו של 1.0.
9. הגדר את החלונות לכוונון אוטומטי ולמעקב תלת-ממדי, באמצעות אותו גודל פיקסל, שכון זמן וממוצע שורות כפי שנעשה בשימוש עבור ההדמיה.
   הערה: תהליך זה יהיה שונה עבור מערכות שונות, לכן רק השלב מוזכר מבלי לציין את הפעולות השונות.
10. הפעל את ההדמיה ונטר את יציבות התהליך במהלך 50-100 הסעיפים הראשונים. ברגע שהמערכת פועלת בצורה חלקה, עזבו את החדר והקפידו שתהיה הפרעה קטנה לחדר האפשרי.
    הערה: משך ההפעלה ומספר המקטעים יהיה תלוי בגודל ה-ROI ובעובי המקטע. ב פרפור-SEM ציר Z הוא למעשה הגובה של התיבה ROI על התמונה SBF-SEM (מקסימום 15 עד 20 μm; איור 3E).
11. רשום את נתוני פרפור-SEM באותו אופן כפי שמתואר לעיל עבור נתוני SBF-SEM.

תוצאות

תמונות מ-SBF-SEM לספק סקירה של הרקמה, מתן תובנה לכיוון המרחבי של תאים וחיבורים בין-סלולאריים (איור 4A). הדמיה של פרפור שלאחר מכן על אזור חדש, אשר בדרך כלל אזור של עניין נקבע לאחר בדיקה של SBF-SEM לרוץ, מוסיף פירוט ברזולוציה גבוהה של תאים ספציפיים ו/או מבנים (איור 4B).

איור 4C , D להראות את ההבדל בעיבוד של שאינם איזוטרופי voxels של הנתונים sbf-SEM (איור 4c) ואת הנתונים איזוטרופי Voxels-Sem (איור 4c). עובי z המשמש ב-SBF-SEM פירושו שהרינדור מראה בבירור את הסעיפים, וכתוצאה מכך אפקט גרם מדרגות על פני השטח. בנתוני פרפור-SEM את 5 סעיפים ננומטר להבטיח כי הרינדור מופיע הרבה חלקים בודדים מתמזגים לתוך פני השטח לחלוטין.

איור 1: יצירת פנים הבלוק מתוך מדגם שרף מוטבע. (א) קצה שורש המוטבע בשרף. (ב) באמצעות להב גילוח שרף עודף נחתך משם עד בלוק של 0.5 mm² נשאר. (ג, ד) הבלוק החתוך מודבק על סיכת מתכת ולאחר לילה בתנור, הצדדים של הבלוק מגזומים והמשטח מsmoothened עם סכין יהלום באמצעות בדיקת אולטרה-מיקרוטום. (ה) בתוך sbf-SEM, המדגם מונחה כך את פני הבלוק ואת ROI ניתן לזהות, סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מתאם בין SBF-sem ופרפור-sem. סקירה תמונות של הפרצוף בלוק באמצעות SBF-SEM (A) ואת שקר-SEM (ב), סרגל קנה מידה = 5 μm. (ג, ד) זום על ההחזר. התיבה האדומה מתארת את האזור להיות בתמונה עם פרפור-SEM, סרגל קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ערכת פרפור-SEM וצעדי הכנה. (א) ערכה המציגה את הכיוון של קרן פרפור, קרן SEM ומדגם. המדגם צריך להיות ממוקם לנקודה צירוף מקרים של קורות ו SEM להיות מסוגל טחנת ותמונה באותו אזור. (ב) שרטוט סכמטי של התעלה הדרושה לדימות SEM של הסעיפים שהוסרו על-ידי ה-פרפור. (ג) תמונה נלקח עם קרן שקר מראה פלטינה התצהיר על התשואה, סרגל בקנה מידה 5 μm. (ד) תמונה נלקח עם קרן שקר מראה את הקווים המשמשים למיקוד אוטומטי ו-3d מעקב. הקווים באמצע משמשים למיקוד אוטומטי והקווים החיצוניים מספקים מעקב תלת-ממדי. הפחמן בתצהיר על גבי הקווים מספק את הניגודיות הנדרשת (פלטינה לעומת פחמן) כדי לבצע משימות אלה, scalebar 5 μm. (E) תמונה נלקח עם קרן פרפור לאחר כרסום של התעלה, scalebar 5 μm. (F) תמונה צולמה עם קרן SEM מראה את ה אזור התמונה של הריבית במהלך הפעלת פרפור-SEM, סרגל בקנה מידה 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: SBF-sem ו פרפור-sem תוצאות לפני ואחרי פילוח. (A) צפיית תלת מימד של קבוצת נתונים של sbf-SEM (100 x 100 x 40 יקרומטר, סרגל בקנה מידה = 10 יקרומטר), (ב) תצוגה תלת ממדית של קבוצת הנתונים של פרפור-SEM (17 x 10 x 5.4 יקרומטר, סרגל קנה מידה = 2 יקרומטר), (ג) שניתנו לאורך הנתונים מחולקת מנתוני sbf-sem על ידי סף, סרגל קנה מידה = 2 יקרומטר D. מעבד גרגירים שעברו מ פרפור-SEM נתונים על ידי סף, סרגל קנה מידה = 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול לעיבוד מיקרוגל
תוכנית #	תיאור/	בקשת משתמש (הופעל/כבוי)	זמן (שעה: דקות: שניות)	כוח (ווטס)	טמפ ' (° צ')	טען מצנן (כבוי/אוטומטי/on)	ואקום/משאבה בובלר (off/bubb/מחזור vac/vac on/vap)	טמפ ' קבועה
								משאבה (הלאה/כיבוי)	טמפ ' (° צ')
8	כשפות	את	0:01:00	150	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:01:00	0	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:01:00	150	50	את	מחזור ואקום	על	30
9	אוסמיום	את	0:02:00	100	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:02:00	0	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:02:00	100	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:02:00	0	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:02:00	100	50	את	מחזור ואקום	על	30
10	50%	על	0:00:40	150	50	את	את	על	30
	70%	על	0:00:40	150	50	את	את	על	30
	90%	על	0:00:40	150	50	את	את	על	30
	100%	על	0:00:40	150	50	את	את	על	30
	100%	על	0:00:40	150	50	את	את	על	30
15	0.1 מטרים לשעה	על	0:00:40	250	50	את	מחזור ואקום	על	30
	0.1 מטרים לשעה	על	0:00:40	250	50	את	מחזור ואקום	על	30
15	ddH2O	על	0:00:40	250	50	את	מחזור ואקום	על	30
	ddH2O	על	0:00:40	250	50	את	מחזור ואקום	על	30
16	Uranyl אצטט	את	0:01:00	150	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:01:00	0	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:01:00	150	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:01:00	0	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:01:00	150	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:01:00	0	50	את	מחזור ואקום	על	30
		את	0:01:00	150	50	את	מחזור ואקום	על	30

. שולחן 1 . פרוטוקול מפורט לעיבוד מיקרוגל

צעד	נוכחי	זמן משוער
פלטינה תצהיר	3n א	10-15 דקות
כרסום אוטומטי וסימני מעקב	50-100	4-6 דקות
התצהיר של פחמן	שלושה מבעלי מבנה	5-10 דקות
שקע כרסום גס	15-30 nA	30-50 דקות
משטח ליטוש	1.5-3 נה	15-20 דקות
הדמיה-הפעלה	700 הרשות הפלסטינית-1.5 nA	שעות ימים

. שולחן 2 זרמים הטחינה המשמשים להכנת דגימה והדמיה לרוץ

Discussion

מיקרוסקופ אלקטרוני של אמצעי אחסון הוא מאתגר יותר וזמן רב יותר מאשר המקובלת SEM או TEM. בגלל הצורך להכתים רקמות או תאים בגוש, שלבי העיבוד חייב להיות מספיק זמן כדי להבטיח חדירה של ריאגנטים לאורך המדגם. שימוש באנרגיה מיקרוגל כדי להקל על החדירה גורמת לעיבוד קצר יותר, יעיל יותר ומשפר את הצביעת. מאחר וההכנה עבור EM היא הרבה יותר מחמירה מאשר עבור מיקרוסקופ אור כל הפתרונות ריאגנטים חייב להיות מבוקרת איכות בקפדנות. שינויים ב-pH, טונגניות, השימוש של ריאגנטים טמא, והקדמה של מזהמים עקב טכניקה ירודה יכול להיות כולם השפעות מזיקות על התמונה הסופית.

אמצעי אחסון EM מחייב גם פרוטוקולים מותאמים אישית עבור כל סוג דגימה שונה. רקמות מממיות מסוגים שונים: צמחים, תאים בודדים כגון שמרים, טריאנוזומים, בעלי כליות וכו ', כולם זקוקים לווריאציות משלהם כדי להשיג תוצאות אופטימליות. קיבוע וכתמים חייב להיות מתוכנן כדי לשמר את השלמות המבנית ולשמור את המדגם קרוב שלה בvivo מורפולוגיה ככל האפשר. קיבוע של רקמות בטמפרטורה פיזיולוגית, pH ו-גמישותו היא קריטית כדי להפוך את המדגם כמו חיים כמו שהוא יכול להיות. בלחץ גבוה הקפאת (hpf) של דגימות עשוי לסייע לשמר מצב חיים כמו יותר, (או אולי רק להניב חפצים שונים), אבל עבור אחרים מאשר תאים ורקמות דק מאוד hpf ייכשל כמו קרח אינדקטור יכול להיווצר רק בכמויות קטנות. לכן עבור שאלות רבות קיבעון כימי הוא האפשרות היחידה. לא משנה אם הקיבעון הוא HPF או כימי, בכל ניסוי EM התוצאות המבבניות צריך להיות בזהירות לעומת תוצאות דומות של תא חי או הדמיה רקמות כדי לראות אם הם עקביים. הצביעת חייב להיות ממוטבת גם בהתחשב בשאלה הספציפית שצריך לקבל תשובה ואת הפרוטוקול שישמש להדמיה של התמונות הדיגיטליות.

לאחר שני מערכת SBF-SEM ו פרפור בסמיכות הוא יתרון גדול בניסויים רבים. השדה הגדול של תצוגה גבוהה X, רזולוציה Y של SBF-SEM הופך מבנים בודדים/תאים/אירועים ישירה ומספק כללית מרחבית של תאים ברקמות. בנוסף, יכולתה לאפשר הדמיה באמצעות מדגם Z היא רבת עוצמה; עם זאת, שחזורים הדורשים פירוט גיאומטרי עדין יכול להיכשל או לייצר חפצים באמצעות טכניקה זו בשל הvoxels לא איזוטרופי שהוא מחולל. פרפור הוא מוגבל על ידי הפיזיקה של התהליך לשדה הדמיה קטן יותר אבל הרזולוציה 3D שלו מספיקה עבור שחזורים מדויקים מאוד. שילוב שתי הטכניקות הוא פשוט כמו דגימות יכול לעבור מ-SBF-SEM אל פרפור ללא עיבוד או הכנה נוספת. אנו מכירים בכך שהשימוש ב-SBF-SEM עבור חיפוש דרך מדגם כדי למצוא אזור מסוים הוא שימוש יקר מאוד בכלי הרבה יותר מוכשר. עם זאת, היכולת לראות באופן מיידי את פני הבלוק החדש ולקבוע אם הROI הגיע הוא יתרון גדול. בנוסף, את החלופות של שימוש בסעיפים סידוריים חצי דקה (0.5 μm) מקטעים LM יכול להסיר מבנים קטנים לפני שהם מזוהים, ובדיקת בלוק באמצעות מקטעים TEM יחיד אשר צריך לגזור, לשים על רשת ולאחר מכן מוצג TEM יקר באותה מידה אינו כמו יעילה כשיטה המוצגת.

מאחר שקיימות תוכניות רבות לפלח ולעיבוד הנתונים, והצרכים של מבנה נתון לא מוגשים בדרך כלל על-ידי יישום יחיד, לא ניתן להציע זרימת עבודה סטנדרטית. כמה מבנים פשוטים עשויים להיות מחולקת עם אלגוריתם סף אם הם נופלים בתוך ערכי סולם אפור צר מאוד. מבנים עצביים יכולים להיות semi-באופן אוטומטי מקוטע באמצעות תוכנית כגון Ilastik¹¹ אבל זה יהיה פחות שימושי בצורה אקראית או מורכבת יותר בצורת אורגלים כגון ER. תמונת מיקרוסקופיה דפדפן היא תוכנית גמישה מאוד שיכולה ליישר, פלח, ולעבד נתונים EM הנפח, אך דורש אינטראקציה משמעותית משתמש¹². ככלל הזמן הדרוש כדי להמחיש באופן דיגיטלי את התוצאות יעלה במידה רבה את הזמן להכנת המדגם והדמיה.

טכניקות ה-EM של אמצעי אחסון פתחו את הממד השלישי לניתוח בדיקת אולטרה-מבנית. שיטות אחרות של קבלת 3D EM יש מגבלות בנפח שלהם (הטומוגרפיה TEM), או היעילות שלהם (סעיף סדרתי TEM). למרות ששיטות הנפח הרב ביותר מורכבות ויקרות ליישום במעבדות בודדות, מספר מתקני הליבה המשותפים המציעים אותם גדל ומספר סוגי המדגם שנוצר בהצלחה הגדילו את התמונה במהירות. עבור אלה עם שאלה ספציפית ורקמות מסוים זה סביר להניח שמישהו יוכל להציע ייעוץ והוראות על ההכנה וההדמיה. ניתן לשפר את הציוד האלקטרו-ממדי כדי לכלול את הקיבולת לטיפול בדגימות גדולות יותר ב-SBF-SEM וביכולת הטחינה הגדולה יותר עם ה-פרפור. תוכנה אשר מסוגלת לחלק את המבנים של עניין בצורה אוטומטית יותר יהיה לפשט במידה רבה את תהליך ניתוח הנתונים ושיפורים במהירות המחשוב תפחית את הזמן הדרוש כדי לעשות זאת. למרות המגבלות הנוכחיות שלה, אמצעי האחסון EM הוא עדיין כלי שימושי ושילוב SBF-SEM ו פרפור-SEM מספק זרימת עבודה יעילה לזיהוי אירועים נדירים והדמיה שלהם ברזולוציה גבוהה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3View 2XP	Gatan	NA	In chamber ultramicrotome for SBFI
Cacodylate buffer 0.2M solution	EM Sciences	11652
Conductive epoxy resin (circuit works)	RS components	496-265
Diatome Histo 4.0mm diamond knife	EM Sciences	40-HIS
Digitizing tablet	Wacom	DTV-1200W	No longer available
Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.094
Flat Embedding Mold	EM Sciences	70900
Gluteraldehyde 25% solution	EM Sciences	16220
High MW Weight Tannic Acid	EM Sciences	21700
Lead Citrate	Sigma-Aldrich	22861
NaCl	Sigma-Aldrich	746398
Osmium Tetroxide 4% solution	EM Sciences	19170
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pelco Biowave Pro +	Ted Pella	36700
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P3289
Quorum Q150T ES sputter coater	Quorum Technologies	27645
Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome	NA	NA	No longer available
Sodium Cacodylate 0.2M	EM Sciences	11653
Spurrs Resin kit	EM Sciences	14300
Uranyl Acetate	EM Sciences	22400