בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

Summary

הפרוטוקול הזה משמש כדי לבודד פרפור לב בודד מהלב של העכבר המבוגר באמצעות הגישה העיכול קטע. גישה זו משמשת כדי לבודד את הפרפור הימני או השמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את פרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה במחקרים הדבקת מהדק.

Abstract

התכונות האלקטרופיזיולוגיות של פרפור מיאלוציטים משפיעות על תפקוד הלב הכללי. שינויים בזרמים יוניים הבסיסיים האחראים לפוטנציאל הפעולה יכול לגרום מצעים הפרו-בקצב הפרעות הפרעה במצבי הקצב, כגון פרפור פרוזדורים, אשר נפוצים מאוד במצבים רבים ובמצבי מחלה. בידוד פרפור מבוגרים עכבר למבוגרים לשימוש בניסויים תיקון מהדק התקדם מאוד את הידע שלנו והבנה של מכשירים אלקטרופיזיולוגיה הסלולר ב שריר הלב פרפור בריא ובקביעת פרפור פתופסיולוגיה. בנוסף, מחקרים באמצעות מודלים העכבר הגנטי הובהר את התפקיד של מגוון רחב של חלבונים בוויסות פרפור אלקטרופיזיולוגיה. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד של קרדיומיקוציטים מן התוספות של העכברים למבוגרים באמצעות שילוב של עיכול אנזימטי ודיסוציאציה מכנית של רקמות אלה. גישה זו בעקביות ובאופן אמין מניב מבודד פרפור לב שניתן להשתמש בו לאפיון אלקטרופיזיולוגיה הסלולר על-ידי מדידת פוטנציאל הפעולה וזרמים יוניים בניסויים מהדק התיקון תחת מספר ניסיוני תנאים.

Introduction

האטריה, שהם הקירות הדק, הלחץ נמוך של הלב המקבלים דם מעולה והנבוב התחתון, כמו גם ורידים הריאתי, הם בלתי נפרד פיזיולוגיה לב נורמלי. כמו אזורים אחרים של הלב, האטריה מכילה מספר סוגי תאים, כולל קרדיוציטים, פיברובמות, תאים אנדותל, תאי שריר וסקולריים חלקים ואחרים. פרפור מייציטים הם תאים מתרגש לחשמל כי לשחק תפקיד חיוני הולכה של אותות חשמליים דרך הלב, ובכך להבטיח התכווצות ההתכווצות הנכונה במהלך כל פעימות לב¹. בעיות בתפקוד החשמלי של האטריה יכול להוביל למספר פרפור שבויי הפרעות בקצב מסוים כגון פרפור התעוררות פרפור פרוזדורים^2,3. אלה הם שכיחה מאוד, עדיין מובן למדי, פרפור הפרעות שיובילו לתחלואה ותמותה משמעותיים. פרפור פרוזדורים יכול להתרחש בשיתוף עם מוטציות גנטיות, בשיתוף עם הזדקנות או במסגרת של צורות רכש של מחלות לב, כולל יתר לחץ דם, אי ספיקת לב וסוכרת^{2,4,5 ,6}. תנאים אלה יכולים לשנות את התכונות החשמליות של פרפור מייציטים אשר יכול ליצור מצע המגביר את השכיחות של קצב מוגנזה^1,2.

תפקוד חשמלי נורמלי ב atria, כמו גם פרפור קצב מוגנזה, מושפעים חשוב על ידי המבנה של פוטנציאל הפעולה (AP) המיוצרים פרפור מיאלוציטים. הפרפור AP נוצר מן הפעילות של מספר זרמים יוניים, כולל הזרם נתרן (אני_Na, נישא על ידי na_V1.5 ערוצים), L-סוג סידן הנוכחי (אני_{Ca, L}, נישא על ידי Ca_v1.2 ו-ca_v1.3 ערוצים ), ומספר זרמים אשלגן כולל מיישר מהיר מאוד האשלגן הנוכחי הנוכחית (אני_Kur, נישא על ידי k_v1.5 ערוצים), הזרם החולף החוצה אשלגן (אני, נישא על ידי k_v4.2 ו-k_v4.3 ערוצים), המצב יציב אשלגן הנוכחי (אני_kss, שנישא על ידי K_V2.1 ערוצים), ואת המתקן הפנימי אשלגן הנוכחי (אני_K1, נישא על ידי K_ir2.1 ערוצים)^{1,7, שמונה}. למרות שהם לא משחקים תפקיד מרכזי ב atria העכבר, את הרכיבים המהירים והאיטיים של המתקן המושהה K⁺ הנוכחי (אני_Kr ו-i_Ks) גם לתרום להיות רה-פולריזציה במינים מסוימים⁷. שינויים באחד או יותר של זרמים יוניים אלה יכול לשנות באופן משמעותי את תכונות החשמל של פרפור מייציטים, אשר יכול להוביל פרפור הפרעות. לדוגמה, הפחתה ב-I_Na יכול להאט הולכה מהירות על פני אטריה על ידי הפחתת מהירות AP upstroke. מצד שני, ירידה בזרמים אשלגן או עלייה בשני אני_{Ca, L} או מאוחר אני_Na יכול לגרום להתפתחות של הקיטוב האחר שיכול להפעיל פעילות ספונטנית ב אטריה^{1, 2,9}.

חשוב להכיר בכך שיש הבדלים במבנה AP בחלקים שונים של שריר הלב, שעלולים לנבוע מהבדלים בביטוי או בוויסות ערוצי היונים המשמשים כבסיס. לדוגמה, הבדלים במשך AP בין ימין לשמאל בשיתוף עם הבדלים I לדחיסות הנוכחית תוארו היטב^10,11,12,13. גם, לאחרונה הוכיחו כי יש דפוסים ברורים של שיפוץ חשמלי בימין ושמאל של העכברים עם יתר לחץ דם כרונית^6,14. הקיר פרפור האחורי הימני גם מכיל את הצומת sinoatrial, אשר יש דפוסים ברורים משלה של מורפולוגיה AP ודפוסי ירי¹⁵. מאפיינים ברורים של מיוציטים בכל אחד מאותם חלקים שונים של האטריה ניתן לחקור בפרוטרוט באמצעות מבודד מבודדים מכל אחד מהאזורים האלה.

ישנן גישות שונות שניתן להשתמש בהן כדי לבודד פרפור מיציטים עבור לימודי מהדק-מלחציים לפיזיולוגיה של¹⁶. אפשרות אחת היא להשתמש בגישה של הפרזיה מנסיגה שבה הלב מתקרב דרך העורקים להעברת אנזימים. אמנם זוהי גישה קיימא, זה יכול לייצר שינויים באיכות פרפור myocyte בשל חוסר עקביות בפרזיה של atria. אימצנו את גישת העיכול "קטע" לבידוד של פרפור מתאי, המבטל את הצורך בפרזיה של הלב. הגישה שלנו משתמשת בשילוב של העיכול אנזימטי ודיסוציאציה מכנית של רקמת פרפור, כי בעקביות ובאמינות מניב מספר גדול של פרפור מבודדים מיאלואידית המתאימים לבדיקות טלאי-מהדק. בעוד אנו מתארים את הגישה שלנו כאן באמצעות רקמת פרפור, הגישה יכולה לשמש על כל אזור של שריר הלב הפרפור (קרי, ימין או שמאל תוספות, קירות ללא תשלום, קירות אחוריים) כי החוקר בוחר. גישה זו היא אידיאלית עבור מחקרים של פרפור מייציט אלקטרופיזיולוגיה בעכברים ששונו גנטית, בדגמי העכבר של מחלות לב וכלי דם, או ללמוד את ההשפעות של תרכובות תרופתי^{5,6,17 ,} מיכל ^{בן 18 ,} . ^{בן 19}

Protocol

כל הליכים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של קלגרי והשתמש ונערכו בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. פרפור מייציט בידוד, תמונות, ותוצאות הנציג המתואר להלן התקבלו מ 15 שבוע בן זכר מסוג wildtype/6 העכבר. אנו משתמשים באופן שגרתי בפרוטוקול זה כדי לבודד פרפור מייציטים מ עכברים wildtype^17,18, עכברים נושאת מוטציות גנטיות^19,20 ומודלים העכבר של מחלה כגון לחץ דם כרונית^6, . ^{ארבע עשרה} ניתן להשתמש בפרוטוקול באופן דומה לעכברים זכריים או נקביים. אנו גם מנוצל גירסה דומה של הליך זה בידוד כדי לבודד את הצומת sinoatrial מתוך הלב של העכבר^17,21,22,23. תרשים זרימה של פרוטוקול ניסיוני זה ממוקם באיור 1.

1. הכנת פתרונות מניות וציוד

1. הכינו מבתר 1 על ידי הוספת אלסטומר סיליקון על פי הוראות היצרן. מוסיפים מספיק מתחם אלסטומר מסיליקון כדי לכסות את החלק התחתון של צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ לעומק של 1 ס מ. אפשר לרפא ואז להכניס 6 פינים חרק לתוך המנה.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר במנה זו באמצעות הסיליקון במשך חודשים ולאחסנו בטמפרטורת החדר.
2. להכין 3 אש מלוטש ברטט פסטר עם פתח של 1 מ"מ (קטן נשא), 3 מ"מ (בינוני), או 5 מ"מ (גדול נשא) בקוטר כפי שמוצג באיור 2A. כדי להפוך את הפיפטות האלה, הניקוד של הפיפטה הפסטר ולאחר מכן הצמד לאורך סימן הניקוד כדי ליצור פתח שהוא גדול מעט יותר מהגודל הרצוי. השתמש בקובץ מתכת כדי להחליק את המשטח ולאחר מכן אש-להבריק את הפתיחה באמצעות להבה פתוחה.
   הערה: הדבר יפיק קצה מלוטש וחלק עם פתח של הקוטר הרצוי. חשוב שהפתח חופשי מסדקים ומשטחים קשים. אלה בקרת אש-מלוטש יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר ושימוש חוזר במשך חודשים.
3. הכנת פתרונות מלאי של הפתרון pH 6.9 של Tyrode ו-7.4 pH של Tyrode של הפתרון כמפורט בטבלה 1. גם להכין 10 מ ל כל אחד מ 1 M Gcl₂, 1 m cacl₂, ו 100 mM cacl₂. השתמש במים באולטרסאונד לכל הפתרונות והחנות ב -4 ° c עד 2 חודשים.
4. הכן 1 L של הפתרון השונה של קראפט-ברוהוא (KB) כפי שמצוין בטבלה 2. . תשתמש במים באולטרטהורים לחלק את הפתרון ל 20 מ ל ולאחסן ב-20 ° c עד 2 חודשים.

2. הכנת פתרונות ובידוד הגדרת בידוד פרפור מיציט

1. הכינו 50 mL של הפתרון ה-pH 7.4 של Tyrode שונה כפי שמתואר בטבלה 3 ב 125 ML erlenmeyer אייר בקבוקון, באמצעות 1 m cacl₂ ו 1 m mgcl₂ פתרונות מניות. מניחים את הבקבוקון של ארלמייר באמבט מים של 35 ° c עד השימוש, כפי שמוצג באיור 2B.
2. הכינו את הפתרון ה-pH 6.9 המתוקן של Tyrode כמתואר בטבלה 4 בצינור 50 mL, באמצעות הפתרון 100 MM cacl₂ מניות. Aliquot 2.5 mL של פתרון זה לתוך כל אחד שלושה 5 מ ל שפופרות התחתון עגול. מניחים את הצינורות האלה במתלה תיל שהונחו באמבט מים 35 ° c עד השימוש, כפי שמוצג באיור 2B.
3. הכינו את פתרון האנזים כמתואר בטבלה 5 בצינור התחתון באורך 14 מ ל. כדי להפוך את הפתרון פרוטאז, להוסיף 1 מ"ג של פרוטאז לכל 100 μL של מים באולטרטהורים. מניחים את הצינור המכיל את התמיסה האנזים הזה במתלה התיל והדגירה באמבט מים ב35 ° c עד השימוש.
4. הפשרת מונה אחד של פתרון KB שהשתנה באמבט מים ב35 ° c. Aliquot 2.5 mL של פתרון KB לתוך כל שלושה 5 מ ל שפופרות התחתון עגול ו 2.5 mL לתוך הצינור התחתון 14 mL עגול. מניחים את הצינורות האלה במתלה התיל ואת הדגירה באמבט מים 35 ° c עד השימוש, כפי שמוצג באיור 2B.
5. הניחו את לוחית הניתוח, הכלים המבתר, הפיפטה הפסטר, ואת הפיפטות לכיבוי האש כמתואר באיור 2B.

3. חיתוך של העכבר בנספח (s)

1. הכנס את העכבר עם 0.2 מ ל של הפארין (10 000 USP U/10 mL) באמצעות הזרקת הצפק והמתן 5 דקות לספיגה.
2. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה ומורדם על ידי שאיפת isofלאנה (3-4%). איזואופלוראן וחמצן מועברים באמצעות מכונת הרדמה ופסולת גז הרדמה היא הותכה. לאחר העכבר מורדם, ולא מפגין רפלקס הבוהן, המתת החסד של העכבר על ידי פריקה מהירה צוואר הרחם. מניחים את העכבר על מגבת נייר או קרש שעם ומדביק את הכפות כלפי מטה כדי להחזיק את העכבר במקומו.
3. להרטיב את החזה של העכבר עם 70% אתנול. הסר את הפרווה ואת העור המכסה את החזה באמצעות מספריים מעוקלים. הבא, להשתמש מלקחיים שן חולדה להרים את עצם החזה ולאחר מכן לחתוך את הסרעפת לאורך קצה הצלעות. הסר את כל כלוב הצלעות באמצעות מספריים מעוקלים כדי לחשוף את הלב.
4. כדי להסיר את התוספת פרפור (ימינה או שמאלה), להרים בעדינות את התוספת באמצעות מלקחיים מחתך עדין ולחתוך אותו עם מספריים האביב. מיד להעביר את התוספת פרפור לכלי מצופה סיליקון המכיל 20 מ ל של הפתרון pH 7.4 שונה מחומם של Tyrode המתואר בשלב 2.1.
5. מניחים סיכה אחת בראש וסיכה אחת בתחתית הפתח של התוספת פרפור. שימוש בפיפטה מספוא, ריקון האטריה עם הפתרון ה-pH 7.4 התחמם שונה של Tyrode כדי להסיר דם. פתח את התוספת פרפור ידי חיתוך לאורך הקצה העליון והתחתון של התוספת פרפור. הבא, להצמיד את הפינות של התוספת פרפור למטה כדי ליצור שטוח, פיסת מלבנית של רקמה, כפי שמוצג באיור 3A.

4. בידוד של פרפור מייציטים

הערה: השלבים בסעיף זה מתבצעים ב-35 ° c, עם צינורות שקועים באמבט מים בעלות של 35 ° c. להיזהר בעת העברת רצועות רקמות בין צינורות התחתון עגול כדי להבטיח שרק את הרקמה (ולא את הפתרון) מועבר בין צינורות.

1. חותכים את התוספת פרפור לתוך כ 8-10 רצועות בגודל שווה (כ 0.7 מ"מ ברוחב) באמצעות מספריים האביב מלקחיים עדינים. דוגמה של רצועות של רקמת פרפור מוצג באיור 3B. שים לב כי החוזה רצועות ברגע שהם נחתכו חינם מתוך פיסת הרקמה הראשית. באמצעות הצינורות הקטנים נשא אש מלוטש, להעביר את רצועות הרקמה לתוך הצינור הראשון המכיל את הפתרון pH 6.9 מחומם שונה של Tyrode המתואר בשלב 2.2. . חכה 5 דקות
2. לשטוף את רצועות הרקמה על ידי העברת אותם לשני ולאחר מכן את הצינור התחתון בסיבוב השלישי המכיל את הפתרון pH 6.9 שונה של Tyrode מוכן בשלב 2.2 באמצעות המדיום נשא מלוטש אש.
   1. כדי לשטוף את רצועות הרקמה, מכסה את הצינור 5 מ"ל התחתון עגול בעדינות להפוך את הצינור 3 פעמים. תן את רצועות הרקמה להתיישב בתחתית הצינור לפני העברת רצועות הרקמה לצינור הבא באמצעות המדיום נשא אש מלוטשת צינורות.
3. העבר את רצועות הרקמה לתוך פתרון האנזים המתואר בשלב 2.3 באמצעות בינוני נשא מלוטש אש מלוטשים ו דגירה עבור 30 דקות. מערבולת הצינור כל 3-5 דקות כדי למנוע את רצועות הרקמה מתוך שמירה יחד.
   הערה: בתחילת העיכול האנזימטי, מפצלי הרקמה מתפשרים במהירות בעקבות מתערבל. במשך כ -20 דקות של עיכול, רצועות הרקמה מתחילות לצוף בתמיסה האנזימטית לאחר התערבטת. במהלך הזמן הזה, מפצלי רקמת פרפור גם לשנות את המראה ורוד חיוור ללבן כפי שהם מתעכלים.
4. לאחר העיכול אנזימטי, לבצע שלוש שוטף באמצעות 2.5 mL של פתרון KB ב 5 מ"ל התחתון עגול צינורות מוכן בשלב 2.4. עבור כל כביסה, בעדינות להפוך את הצינור 3 פעמים לפני הזזת הרקמה לצינור הבא באמצעות המדיום נשא אש מלוטשת צינורות. בעקבות השטיפה הסופית, להעביר את הרצועות לתוך הצינור התחתון 14 mL המכיל 2.5 mL של פתרון KB. . חכה 5 דקות
5. בעדינות קצוצות את הרקמה עבור 7.5 דקות באמצעות לרוחב ונשא אש מלוטש צינורות. זה יהיה מכני הנתק את רצועות הרקמה ולהניב פתרון מעונן מלא פרפור המיציטים הפרט.
   הערה: במהלך הטריטורציה, הרקמה הופכת ללבנה והפתרון הופך להיות מעונן. כוח הטריטורציה, שהושג על ידי שינוי התדר והמהירות של סילוק רצועות הרקמה מתוך הפיפטה הרחב והמלוטש, צריך להיות מותאם לבידוד הפרטני. אם הטריטורציה עדינה מדי, תפוקת התאים תהיה נמוכה, בעוד שטריטורציה שהיא קשה מדי תניב תאים רבים ומתים. להימנע בועות בזמן triturating.
6. למלא את הצינור 14 מ"ל התחתון עגול המכיל רצועות רקמה triturated עם פתרון KB לנפח הסופי של 7-10 mL בהתאם לצפיפות הרצויה של תאים לשימוש ניסיוני. הניחו את השפופרת בטמפרטורת החדר במשך 1 h. בעקבות תקופת דגירה זו, ניתן להשתמש בתאים עבור מגוון של ניסויים עד 7 h. תאים יכולים גם להיות מאוחסנים ב 4 ° צ' עד 7 h.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול זה יכול לשמש כדי לאפיין את המאפיינים האלקטרולוגיים של תאים אלה באמצעות טכניקת טלאי-מהדק. בנוסף, ניתן להוסיף לחדר ההקלטה של מכשיר מהדק-מלחציים סטנדרטי ומחובר לפתרונות המתאימים לסוג ההקלטה של הרצון הנסאליסטי לבצע. פרפור משתמשים מבודדים באמצעות פרוטוקול זה משמשים הטובים ביותר עבור מחקרים אלקטרולוגיים בתוך 6-7 h של בידוד. התיקון הנציג-מהדק נתונים מהמעבדה שלנו מוצג להלן.

איור 4 ממחיש דוגמאות של פרפור בודד מיאלואידית מפני עכברים נורמליים שהוכנו באמצעות הפרוטוקול לעיל. מבודד פרפור שתאי מבודדים הם בדרך כלל על סדר של 100 יקרומטר באורך ו 10 יקרומטר ברוחב עם סטריציות ברורות. קיבוליות של פרפור מבודד מייציטים הוא בדרך כלל 40-70 pF.

איור 5a ממחיש דוגמה של פרפור מיציט AP הוקלט באמצעות טכניקת מחורר התיקון הנוכחי במצב קלאמפ, כפי שתיארנו בעבר^6,19,20. נתוני סיכום המדגימה פרמטרים טיפוסיים של מיציט AP מסופקים בטבלה 6. באופן ספציפי, אנו מציגים נתוני סיכום עבור מדידות של פוטנציאל ממברנה הנחה (rmp), מהירות upstroke מקסימלית (V_max), אוברשוט (OS) ו-AP משך ב 50% (apd₅₀), 70% (apd₇₀) ו-90% (apd₉₀) רה-פולריזציה זמן (טבלה 6). גישה יכול גם להיות מוקלט בתצורת תא כולו¹⁴. פתרונות הסופרפיוז והפיפטה להקלטת גישה זמינים בטבלה 7 ובטבלה 8.

איור 5B ממחיש משפחה ייצוגית של Na⁺ זרמים (אני_Na) נרשם בתצורת התא כולו של טכניקת מלחציים טלאי. זרמים אלה נרשמו באמצעות 50 ms מתח מהדק צעדים בין-100 ו 10 mV מ הפוטנציאל המחזיק-120 mV. יש לנו לתאר גישות ופרוטוקולים עבור הקלטה אני בעבר^6,14,20. סיכום I_נה הרביעי היחסים מוצגים גם באיור 5b. פתרונות המשמשים לרישום I_Na מוצגים בטבלה 7 ובטבלה 8.

איור 5C ממחיש משפחה ייצוגית של Ca^{2 +} זרמים (אני_{Ca, L}) נרשם בתצורת התא כולו של טכניקת מלחציים טלאי. זרמים אלה נרשמו באמצעות 250 ms מתח מהדק צעדים בין-60 ו + 80 mV מתוך הפוטנציאל המחזיק של-70 mV. התנאים הניסיוניים שניתן להשתמש בהם כדי למדוד I_Ca, כבר תוארו בעבר^17,18,20. תקציר I_Ca, הקשר L IV מוצג גם באיור 5c. הפתרונות המשמשים לרישום I_{Ca, L} זמינים בטבלה 7 ובטבלה 8.

איור 5D ממחיש משפחה ייצוגית של K⁺ זרמים (אני_K) הקליט בתצורת התא כולו של טכניקת מלחציים טלאי. זרמים אלה נרשמו מתוך פוטנציאל החזקה של-80 mv באמצעות 500 ms מתח שלבים ההדק בין-120 mv ו + 80 mV, כפי שתיארנו בעבר^6,14. הסכם היחסים הרביעי עבור סך I_K מוצג גם באיור 5d. הפתרונות המשמשים לרישום I_K זמינים בטבלה 7 ובטבלה 8.

באמצעות גישות אלה כדי להקליט נקודות גישה ומשפחות גדולות של זרמים יוניים, כולל Na⁺, Ca^{2 +} ו-K⁺ זרמים (כפי שמודגם לעיל), מאפשר לחוקר לחקור בקפדנות את הפרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה ב שפע של תנאים ניסיוניים. המעבדה שלנו העסיקה באופן שגרתי את הטכניקות הללו כדי לחקור פרפור מייציט אלקטרופיזיולוגיה בעכברים נורמליים, בדגמי העכבר של מחלת לב, ועכברים ששונו גנטית^{6,14,17,18 ,19,20}.

איור 1: תרשים זרימה עבור פרוטוקול הבידוד של הפרפור מיציט. סיכום השלבים המשמשים לבידוד מיציטים באמצעות פרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: כלים ניסיוניים לכיוונון וחיתוך לבידוד של פרפור מיציט. (א). הפיפטה הקטנה והמלוטשת, עם הפתיחה 1 מ"מ בקוטר (משמאל), משמשת להעברת רקמות בעקבות הניתוח, בינוני נשא את הצנרת המלוטשת באש עם פתח בקוטר 3 מ"מ (האמצעי) משמש להעברת רצועות הרקמה במהלך ה בידוד, ומלא מלוטש בקוטר אש עם פתיחה של 5 מ"מ (מימין) משמש לטריטורציה של רקמת פרפור. (ב). התקנה ניסיונית לבידוד של פרפור מיציט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: התמונה של הקרע פרפור הנספח. (א). הנציג של השדה הבוהק של הנספח שנחתך והוצמד. (ב). נציג של השדה הבהיר של הנספח לחיתוך לרצועות רקמות של כ 0.7 מ"מ ברוחב. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תמונות של פרפור מבודדים מיאלואידית. (א). ברייטפילד דימוי של פרפור מבודד מיציטים מיד לאחר בידוד. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב). דימוי ברייטפילד של מיכל מבודד אחד. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: טלאי הנציגה-מהדק נתונים שהתקבלו מתוך פרפור מבודדים מיאלואידית. (א). נציג מעורר הקלטה AP מתוך פרפור מבודדים מוציט. סיכום פרמטרי AP מוצג בטבלה 6. אמפוריטיצין B (200 μg/mL) נוספה לפתרון הפיפטה כדי לחדור את הקרום התאי. (ב). נציג i_na הקלטות (משמאל) וסיכום i_na הרביעי עיקול (מימין) מתוך פרפור מבודדים מיציט. Nifedipine (10 μM) נוספה לפתרון של Tyrode שהשתנה כדי לחסום אני_{Ca, L} בעת הקלטת i_Na. ג. נציג I_ca, הקלטות l (משמאל) וסיכום אני_{ca, l הרביעי} עיקול (מימין) מתוך פרפור מבודד מ, מיציט. (ד). נציג הקלטות i_k (משמאל) וסיכום i_k עקומת הרביעי (מימין) מתוך פרפור מבודד מתוך מיציט. הפתרונות המשמשים לרישום כל אחד מזרמים אלה רשומים בטבלה 7 ובשולחן 8. עקומות סיכום IV הם מדידות ממוצעים מ 10 פרפור מייציטים מבודדים מ 15 שבוע בן מסוג wildtype C57Bl/6 עכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

	מניות של הרכב pH 6.9	מניות של הרכב pH 7.4
כימי	ב ממ	ב ממ
מיכל שלמה	140	140
אשלגן כלורי	5.4	5.4
KH2פו4	1.2	1.2
מיכל ביטון	מיכל 5	מיכל 5
נפח סופי	500 מ ל	1 ליטר
PH סופי עם NaOH	6.9	7.4

טבלה 1: ה-ph של מניות של tyrode 7.4 ו-ph של מניות של Tyrode של פתרונות 6.9. הרכב של מניות הפתרונות של Tyrode (pH 7.4 ו-pH 6.9) כי ניתן לעשות מראש ומאוחסן ב 4 ° צ' עד 2 חודשים.

כימי	ב ממ
גלוטמט K	100
ק-אספרטט	10
אשלגן כלורי	25
KH2PO4	10
MgSO4	2
טאורין	20
קראטין	מיכל 5
מיכל בגין	0.5
גלוקוז	20
מיכל ביטון	מיכל 5
BSA	0.10%
נפח סופי	1 ליטר
הסופי pH עם קו	7.2

טבלה 2: פתרון KB שהשתנה. מתכון לפתרון KB שהשתנה שניתן לעשות מראש, מצוטט ומאוחסן ב-20 ° c עד 2 חודשים.

כימי	כמות
גלוקוז	5.55 ממ '
מיכלהשני	1 ממ '
מיכל2	1.8 ממ '
מניות של הרכב pH 7.4	50 מ ל
פארין	250 מיקרומטר

שולחן 3:7.4 המתוקן של Tyrode של הפתרון עם גלוקוז, מגנזיום, סידן, הפארין. הרכב של ה-pH 7.4 שונה של הפתרון של Tyrode המשמש לניתוח פרפור הרקמות. פתרון זה צריך להיות טרי ומוחזק באמבט מים 35 ° c עד השימוש.

כימי	כמות
גלוקוז	18.5 ממ '
טאורין	49.96 ממ '
BSA	15 מ ג
מיכל2	0.066 ממ '
מניות של הרכב pH 6.9	15 מ ל

שולחן 4: ה-pH 6.9 של השתנה הפתרון של Tyrode המכיל גלוקוז, טאורין, BSA, ו סידן נמוך. הרכב של ה-pH 6.9 שונה של הפתרון של Tyrode המשמש לבידוד פרפור מיציט. פתרון זה צריך להיות טרי ומוחזק באמבט מים 35 ° c עד השימוש.

כימי	כמות
קולגנאז	1,064 יו
אלסטסה	9 יו
פתרון פרוטאז	65.2 מיקרומטר
ה6.9 שונה של ה-pH של טירכב	5 מ ל

שולחן 5: תמיסה אנזימטית. הרכב הפתרון האנזימטי המשמש לתקציר מנתחי רקמת פרפור. פתרון זה צריך להיות טרי ומוחזק באמבט מים 35 ° c עד השימוש.

פרמטר	ממוצע
RMP (mV)	-74.2 ± 0.7
Vmax (V/s)	144.6 ± 5.8
מערכת הפעלה (mV)	71.9 ± 3.0
APD50 (אלפיות שלמה)	11.1 ± 1.7
APD70 (אלפיות שלמה)	23.0 ± 4.6
APD90 (אלפיות שלמה)	54.7 ± 7.8

טבלה 6: סיכום פרמטרי AP מתוך מבודד פרפור מיאלואידית. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM, n = 10 פרפור מייציטים מבודדים מ 15 שבוע הזכר Wildtype C57Bl/6 עכבר.

	זרמים אשלגן ו-APs	זרמים נתרן	זרמי סידן
כימי	ב ממ	ב ממ	ב ממ
מיכל שלמה	140	מיכל 5
אשלגן כלורי	5.4
MgCl2	1	1	1
CaCl2	1	1	2
מיכל ביטון	10	10	10
גלוקוז	5.5	5.5	5.5
מיכל שיבוץ		130
תה-קלרנית		5.4	145.5
pH	7.4 עם NaOH	7.4 באמצעות CsOH	7.4 באמצעות CsOH

טבלה 7: הרכב של הפתרונות של Tyrode המשמשים במהלך ניסויים מלחציים טלאי. הרכב של הפתרונות של Tyrode השתמשו כדי להקליט APs, אני_Na, אני, אני,_L, ואני_K מ בודד פרפור מייציטים.

	זרמים אשלגן ו-APs	זרמים נתרן	זרמי סידן
כימי	ב ממ	ב ממ	ב ממ
מיכל שלמה	מיכל 5	מיכל 5	מיכל 5
אשלגן כלורי	140
MgCl2	1	1	1
CaCl2	0.2	0.2	0.2
מיכל ביטון	10	10	10
מיכל בגין	מיכל 5		מיכל 5
Mg-ATP	4	מיכל 5	4
Na-GTP	0.3	0.3	0.3
נה-פוספוליקראטין	6.6		6.6
מיכל שיבוץ		130	135
מיכל בלטה		מיכל 5
pH	7.2 עם קו	7.2 באמצעות CsOH	7.2 באמצעות CsOH

טבלה 8: הרכב של פתרון פיפטה פנימי המשמש במהלך ניסויים מלחציים טלאי. הרכב של הצנרת מילוי פתרונות משמש כדי להקליט APs, אני_Na, אני, אני,_L, ואני_K מ פרפור מבודד מיציטים.

Discussion

המעבדה שלנו באופן שגרתי משתמשת בפרוטוקול זה כדי לבודד פרפור משתמשים בעכבר לשימוש בניסויים תיקון-קלאמפ כדי לחקור את ההשפעות של צורות שונות של מחלות לב וכלי דם, מוטציות גנטיות, או תרכובות פרמקולוגית על פרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה. למרות שאיכות הנתונים שמתקבלת מהפרפור המבודד מאוד תלויה באיכות הבידוד. בנוסף, מבוא מחדש של סידן בעקבות בידוד פרפור מייציט יגרום מוות תאים עבור אוכלוסיה של מיוציטים מבודדים בשל פרדוקס הסידן¹⁶. בהתאם לכך, הבידוד של פרפור משתמשים בגישה זו דורש תרגול ואופטימיזציה בנקודות מרובות לאורך כל הבידוד. לאחר אופטימיזציה, ההערכה היא כי בין 70-90% הכולל מבודד מייסציטים מבודדים באמצעות גישה זו יהיה שניהם עמידים בפני סידן וגם מוט בצורת. השלבים המחייבים את התרגול והמיטוב ביותר נדונים להלן.

המהירות והיעילות של הניתוח יהיו השפעות במורד הזרם על איכות התאים הבודדים. חשוב לקחת זמן כדי להבטיח את כל הדם מוסר מרקמת פרפור ושרצועות רקמה חתוכים בגודל דומה. זה צריך לקחת כ 5 דקות כדי להסיר את התוספת פרפור, לחתוך את הרקמה לתוך רצועות, ולהעביר את רצועות הרקמה לתוך הצינור הראשון של הפתרון pH 6.9 שונה של Tyrode. עם זאת, אם צעד זה נמשך זמן רב מדי, ניתן להתפשר על איכות הרקמה.

חשוב גם שרצועות רקמה יחתכו לגודל אחיד בתוך בידוד ובין לבבות. אם רצועות הרקמה גדולות מדי או קטנות מדי, או אם הן לא אחידה בתוך בידוד, הדבר עלול לגרום לבעיות במהלך העיכול האנזימטי והטריטורציה. הסיבה לכך היא רצועות קטנות יהיה מתעכל ביסודיות ורצועות גדולות יהיה תחת מתעכל. זה חשוב באותה מידה לשקול את גנוטיפ ואת הגדרת המחלה למדו כגודל של התוספת פרפור יכול להשתנות בין בעלי חיים. לדוגמה, לבבות יפרטרופית יש תוספות גדול יותר לעומת לבבות בריאים, ולכן הניסויים יכולים לחתוך רצועות יותר יפרטרופית לבבות לעומת לבבות בגודל נורמלי. בהתאם, אופטימיזציה של גודל מפצלי רקמות לחתוך להחיל את הממדים האלה על כל תוספת פרפור לפרט יהיה מאוד לשפר את השגות של מיציט מבודדים בין התנאים ניסיוני.

האיזון העדין בין העיכול האנזימטי לבין דיסוציאציה מכנית הוא המפתח לבידוד מוצלח של פרפור משתמשים באמצעות פרוטוקול זה. אם הרקמה אינה מסתחרעת בצורה מספקת במהלך העיכול האנזימטי, מפצלי הרקמה הבודדים נוטים לסבך ולדבוק יחד, דבר שיגביל את האפקטיביות של העיכול האנזימטי. אם הוא נסער בתדירות גבוהה מדי או במרץ, זה יכול להזיק לרקמת פרפור, אשר תגרום לבידוד של תאים שאינם קיימא. דיסוציאציה מכנית של פרפור מבודדים מיציטים מרצועות רקמה במהלך נשחקו הוא הצעד הקריטי ביותר לתרגל ולמטב באמצעות גישה זו כדי לבודד פרפור מיאלוציטים. , אם הטריטורציה עדינה מדי. תפוקת התאים תהיה נמוכה מצד שני, אם נשחקו הוא קשה מדי, אז שפע של מיוציטים שאינם קיימא יהיה מבודד, ואת איכות הנתונים שהושגו במהלך ניסויים מלחציים התיקון יהיה בסכנה. בנוסף, הרכב האטריה יכול להשפיע על הבידוד. לדוגמה, אם הרקמה הינה פיברוטית, ייתכן שיהיה צורך לשנות את העיכול האנזימטי ואת שלבי הטריטורציה. לכן חשוב לקחת את הזמן כדי לפתח את הכישורים הדרושים כדי להשיג תאים באיכות גבוהה במהלך נשחקו כי ניתן להשתמש בניסויים תיקון-קלאמפ.

כמו בכל הטכניקות הנסיוניות יש מגבלות. טכניקה זו דורשת תרגול כדי לבודד לבידוד קיימא, באיכות גבוהה myocytes, אשר בתורו ישפיע על הכדאיות של כל הניסויים להתבצע באמצעות אלה מיאלוציטים. גישה זו היא גם מסוף ו פרפור תאי מבודדים באמצעות גישה זו ניתן להשתמש ביום הבידוד בלבד. המעבדה שלנו משתמשת בתאים. בתוך 6-7 שעות של בידוד

לגישה הזאת לבידוד של. פרפור לב יש מספר יישומים לדוגמה, גישה זו יכולה להיות שונה כדי לבודד פרפור מייציטים (כמו גם פיברוהפיצוצים) ממינים אחרים כולל ביופסיה של רקמת האדם. בנוסף, יתרון לשימוש בשיטת הקטע הזאת עבור בידוד פרפור (בניגוד לפרזיה הנסיגה של הלב) הוא שניתן לשנותה כדי לבודד את הקרדיוציטים מאזורים אחרים של הלב, כגון צומת הסינניפרפור או אזורים ספציפיים אחרים של השריר שריר הלב, או להקיף את כל האזור לנו כולו של לב. המעבדה שלנו משתמשת פרפור לב עבור ניסויים מלחציים תיקון כדי למדוד פוטנציאל פעולה זרמים יוניים, למרות גישה זו לא צריך להיות מוגבל לטכניקה זו. לדוגמה, ניתן להשתמש במיציטים מבודדים כדי לחקור שינויים בארעיות הסידן ובהגדרותיו במגוון הגדרות נסיוניות. ניתן להשתמש בו גם במחקרים אימונוללואונטיים כדי ללמוד את המיקום של חלבונים או מבנים של עניין. לכן, גישה זו היא מאוד תכליתי עם יישומים רבים אפשריים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98%	Sigma	A4926-1G
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial	Sigma	A7699-1G
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial	Sigma	A9187-1G
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder	Sigma	A4888-500 MG
Bovine serum albumin	Sigma	A3059-50G
Calcium chloride dihydrate	Sigma	223506-500G
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9%	Sigma	289329-100G
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis	Sigma	562505-1KG
Collagenase Type 2	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Creatine anhydrous	Sigma	C0780
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
DL-Aspartic acid potassium salt	Sigma	A2025-100G
Elastase suspension	Worthington Biochemical Corporation	LS002279
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0%	Sigma	E4378-25G
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder	Sigma	G8877-250MG
Heparin 10 000 USP units/10mL	SANDOZ	10750
HEPES > 99.5% (titration)	Sigma	H3375-500G
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder	Sigma	G1501-500G
Magnesium sulfate	Sigma	M2643-500G
Nifedipine > 98% (HPLC), powder	Sigma	N7634-1G
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98%	Sigma	P7936-5G
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5%	Sigma	P3911-500G
Potassium hydroxide	EM Science	PX1480-1
Potassium phosphate monobasic	EMD	PX1565-1
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder	Sigma	P5147-1G
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0%	Sigma	S9888-2.5KG
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent	Sigma	221465-500G
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments Inc	SYLG184
Taurine	Sigma	T0625-100G
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration)	Sigma	T2265-100G