מודל חזק המושרה לקשירה של חניכיים Murine להערכת הנויטרופילים אוראלי

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול להקמת מודל המושרה לקשירה של חניכיים מורטין מעורבים טוחנות הלסת הכפולה מרובים, וכתוצאה מכך אזורים גדולים יותר של רקמת חניכיים מעורב ועצם עבור ניתוח עוקבות, כמו גם השימוש מופחת בעלי חיים. טכניקה להערכת נויטרופילים אוראלי באופן אנלוגי לנושאים אנושיים מתואר גם.

Abstract

היתרונות העיקריים של לימוד פתופסולוגיה של מחלת חניכיים ניצול מודלים murine הם עלות מופחתת של בעלי חיים, מערך של זנים מהונדסים גנטית, המספר המכריע של ניתוחים שניתן לבצע על שנקטפו ברקמות רכות וקשות. עם זאת, רבות ממערכות אלה כפופות לביקורות פרוצדורליות. כחלופה, המודל המושרה לקשירה של מחלת חניכיים, מונע על ידי פיתוח ושמירה של מיקרובידום אוראלי בלתי מהימן, יכול להיות מועסק, אשר המושרה במהירות ואמין יחסית. למרבה הצער, הווריאציות של פרוטוקול חניכיים murine הנגרמת לקשירה מבודדים לאזורים מוקד של החניכיים ובכפוף לציון בטרם עת של החיבור המותקן. זה ממזער את כמות הרקמה הזמינה לניתוחים הבאים ומגבירה את מספר בעלי החיים הנדרשים למחקר. פרוטוקול זה מתאר את המניפולציות המדויקות הדרושות כדי למקם ליגטורות טוחנת מורחבת עם שמירה ושימוש משופר של טכניקת לשטוף רומן לשחזר נויטרופילים אוראלי בעכברים עם גישה חלופית המשקל את השערים לעיל אתגרים טכניים.

Introduction

מחלת חניכיים (PD) היא מחלה אוסטאופתית הקשורה בתחלואה מארח משמעותי ונטל כלכלי, אשר מתבטא על ידי דלקת חניכיים ואובדן של שתי מצורף רקמה רכה ו osseous תמיכה עבור שיניים מושפעות^1,2,3,4. תהליך זה נשלט על ידי אינטראקציות בין מיקרוביוטה אוראלי לבין המערכת החיסונית הטבועה של המארח. הוא קשור גם עם החרפה של מחלות דלקתיות אחרות כולל סוכרת, מחלות לב וכלי דם, סרטן^5,6,7,8. מבחינה היסטורית, זה היה שיערו כי הפתוגנזה המשטרה תלויה בכמויות גדולות של חיידקים ספציפיים כגון פוררומונס חניכיים מסוים⁹. עם זאת, ראיות שאירעו לאחרונה מצביעות על כך שרכיב החיידקים של המשטרה מתווך על-ידי השימוש בסוגי השיניים. הביוilm היא קהילה מאורגנת ומורכבת של מיקרואורגניזמים רבים, שיכולים להתקיים במצב שיתופי והרסני בלתי-מצבי^10,11. המבנה האוראלי מעניק בדרך כלל עמידות למחשב המארח על ידי מניעת הקמתה של החיידק הפתוגניים ומקדם את מבנה רקמת חניכיים אידיאלי ותפקוד באמצעות רגולציה של התגובה החיסונית מארח^12,13. רטבאליות של היחסים equilibrious בין אורגניזמים בתוך חלל הפה ואת המערכת החיסונית מארח עלול להוביל שינויים בהומאוסטזיס רקמות, וכתוצאה מכך ההתפתחות של הופעות המחקר הקליני והרדיוגרפיה של המשטרה^{5,10,12,13,14}.

מעניין, הקמת הדיסקטאוזיס אוראלי, בעוד הנדרש ליזום של PD, אינו מספיק כדי לנהוג במשטרה בכל האנשים, הימנעות לקראת היכולת של התגובה החיסונית מארח לחתור במעבר של microbiota בין שיתופי ודיסביוטית מדינות¹⁵. זה מציב זרקור מסוים על האמצעים שבהם המשטרה משפיעה על אחד הדמויות המובילות של מערכת החיסון המולדת, כלומר הפולימיוולוייט (pmn), או נויטרופילים, מתוך פרספקטיבות מקומיות מערכתית^16,17.

בבני אדם, PMNs מגויסים מהמחזור בקצב של ~ 2 x 10⁶ תאים/h ברקמות החיבור חניכיים בריאים, שם הם האוכלוסייה הלוקוציט בעלת הדירוג. כאן, הם גורשו לאחר מכן מן החניכיים sulcus לתוך חלל אוראלי כרכיב של נוזל חניכיים crevicular. בנוכחות המשטרה, נויטרופילים מתבטא בתוך מחזור הדם וחלל הפה, שבו התאים האלה אפקטור להחזיק פנוטיפ היפרסטרומה שמוביל להרס הנ ל של החניכיים^{17,18,19,20,21,22}. לכן, הבנת התפקיד של PMNs ב PD ומצבים דלקתיים אחרים מערכתית הוא בעל חשיבות עליונה.

למרות שהוא מקובל שמחלות כרוניות מקושרות באופן הדדי למשטרה, המנגנונים הבסיסיים עדיין לא הגיעו לידי בקשה, ותורמים לקשיים בניהול התנאים הללו והקטלניים. מספר מודלים בעלי חיים ניסיוניים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות ייחודיים, כבר נוצל לחקור את הפתופסולוגיה של PD^23,24. התמקדות ספציפית על דגמי murine, ישנם מגוון של פרוטוקולים שדרכם לימוד של PD הוא הקלה; עם זאת, הם בעלי מספר חסרונות טכניים ופיזיולוגיים^{25,26,27,28,29,30,31}.

הראשון, gavage אוראלי מודל העכבר דורש רבים אוראלי החיסונים של פתוגנים חניכיים אנושיים כדי ליצור דלקת חניכיים ואובדן העצם. בנוסף, הוא בדרך כלל לפניו על ידי תקופה של טיפול אנטיביוטי כדי לחתור תחת המודר מורלין פלורה אוראלי²⁵. מודל זה דורש לעתים קרובות הכשרה מיוחדת לבצע בבטחה את gavage אוראלי, משתמשת רק חלק קטן של פתוגנים חניכיים מתוך microbiome האנושית מורכבים יותר, ודורש מספר חודשים כדי ליצור אובדן העצם מכתשיים.

לעומת זאת, המושרה כימית מודלים murine לנצל את מסירת אוראלי של חומצה sulfonic בנזן (TNBS) או הנתרן דטרן סולפט (DSS), סוכני בשימוש נפוץ בהקמת מודלים murine של קוליטיס על פני תקופה של מספר חודשים כדי לגרום לאובדן העצם חניכיים²⁶. מודלים מבוססי פנים וחוץ לפנים הינם זמינים, אשר כרוכים בחותכות murine ורקמות של dorsum, כמו גם calvarium, בהתאמה. במודל מורסה לשעבר, כמה זריקות של חיידקים מנוהלים, יצירת אבצס חניכיים מרובים ומחסור של אובדן העצם מכתשיים, הגבלת השימוש שלהם במחקר של PD. הדגמים האחרונים מורסה מתאים יותר באופן משמעותי כדי ללמוד התקפה בקטריאלי, דלקת, וספיגת עצם באתרים מחוץ לחלל הפה, אשר מבטלת את ההערכה של החניכיים ומיקרובידום בעל פה^{27,28,29,30,31}.

באמצעות מודל המושרה לקשירה של חניכיים, תפר ממשי קלוע הותקנה בדרך כלל סביב הטוחנת השנייה. כחלופה, מקטע ליניארי אחד של חומר תפר ניתן להוסיף בין הראשון והשני טוחנות^32,33. המטרה של מיקום לקשירה היא להקל על הצטברות חיידקים וליצור דיסביוזיס בתוך חניכיים sulci, וכתוצאה מכך דלקת חניכיים והשמדת הרקמות ההלחנה של החניכיים. בעיקר, מודל זה מסוגל לייצר משמעותית יותר מכתשיים אובדן העצם בהשוואה לgavage הנפוץ יותר בשימוש אוראלי דגם³⁴. עוד מסבך את השימוש במודל gavage אוראלי הוא ההתנגדות הטבעית על ידי מספר זנים של עכברים (כלומר, C57BL/6) כדי לפתח אובדן העצם מכתשיים. זה גם בעייתי, כמו זן זה הוא הנפוץ ביותר בתחום מחקר בעלי חיים מבוסס מורלין³⁵.

הליכים קיימים המתוארים על-ידי מרצ ואח ' ואייב והאג שנגלי המציאו כדי לפשט את הפעולה הטכנית של הצבת ליגטורה^33,36. למרבה הצער, הפרוטוקול לשעבר דורש מיוחדות 3D ציוד מודפס, בעלי פוטנציאל אובדן לקשירה מוקדמת, ובכך להגדיל את השימוש בעלי חיים ואת העלויות הקשורות בזמן נוסף שהושקע בחדר הניתוח. יתר על כן, שני הפרוטוקולים מייצרים רק אזורים קטנים של החניכיים החולים זמין למחקר.

היתרונות הטמונים בטכניקה זו מבוססים על מחקר סימולטני של ביוביוזיס ואימונולוגיה ששולטים על החניכיים, ניצול של בעלי חיים בעלי עלות נמוכה עם רקעים גנטיים מגוונים, ושיטות דיור פשוטות ובעלי גידול. ככאלה, על המטרות להיות מגדילים את הכרכים של הרקמה החולה, ובניסיונות לתרגל את עקרונות הירידה במחקר בעלי חיים, לצמצם את צריכת החיות לרמה נמוכה ככל האפשר. זה דורש להבטיח כי כל בעלי החיים מסוגלים להיכלל בניתוח ניסיוני³⁷. עם זאת, יש לציין כי לא משנה איזה מודל בעלי חיים של מחלת חניכיים מנוצל, אין מודל יחיד המקיף את כל האלמנט של משטרת האנושות pathפסיולוגיה.

פרוטוקול חדש זה מפעיל את המיקום של ליגטורה סביב שיניים מרובות מקסימום הלסת הטוחנת באמצעות מיכשור וחומרים שנמצאים ברוב המעבדות. זה מאפשר כמות מספקת של זמן בקלות ובביטחון להתקין ליגטורה כי סביר avulse בטרם עת. בסופו של דבר, כמו PMNs לבצע את ההרס של החניכיים במשטרה, מתודולוגיה הרומן לשחזר נויטרופילים אוראלי באופן אנלוגי לבני אדם מוצג גם.

Protocol

כל מחקרים מורטין נענו לתקנות המוסריות הרלוונטיות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת טורונטו ומועצת האתיקה של המחקר (פרוטוקול 20011930).

1. התקנת קשירה

הערה: זהו נוהל כירורגי לא סטרילי שניתן לבצע באולם הפעלה רגיל. השימוש בבעלי חיים ללא חיידקים (לא מכוסה כאן) מנדטים טיפול בתוך הקבינט אבטחה, שימוש במכשירים סטרילי, והחיסון של חלל הפה עם פתוגנים חניכיים כדי לגרום לביטויים הקליניים של חניכיים.

1. לנהל את ההרדמה התוך הצפק ל 8 – 12 שבוע בן זכר C57BL/6 עכברים, אשר צריך להיות הסתגלות למתקן הדיור שלהם, באמצעות 0.5 "26 גרם מחט תת-עורית סטרילי ו 1 מזרק mL על פי מאושר טיפול בעלי חיים מוסדיים ולהשתמש הוועדה (IACUC) הנחיות.
   הערה: שילוב של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) הרדמה במהירות ובאופן אמין משרה את רמת ההרדמה המתאימה במשך ההליך.
2. להעריך את עומק ההרדמה לפני ו כל 15 דקות במהלך ההליך כפי שמעידים על ידי אובדן של רפלקס הדוושה.
3. מקמו את העכבר על מצע כירורגי מחומם (איור 1א). ייצוב לסת והלסת התחתונה במצב פתוח באמצעות להקות אלסטיים והשען את הצוואר עם גליל כותנה כדי לשמור על לסת בכיוון אופקי יותר (איור 1B). מכסים את הגוף ואת הזנב של בעל החיים כדי לרכך את אובדן החום במהלך ההליך.
4. מקמו את המיקרוסקופ הכירורגי על ההגדלה הרצויה והתאורה (אם לא רכוב ישירות על המיקרוסקופ) על חלל הפה עבור ויזואליזציה של שיניים. בעוד ההגדלה הרצויה היא תלוית המפעיל, הדמיה אופטימלית של חלל הפה מתקבל ב 16x.
5. התקנת לתפור מ5-0 סטרילית משי קלועה סביב הראשון (M1) ושנית (M2) מקסלסת טוחנות בתוך חניכיים sulcus באמצעות מלקחיים קיסם.
   הערה: התפרים ממשי קלוע של מד קטן יותר ניתן להשתמש למטרה זו כדי להקל על התקנה מהירה יותר ולהפחית את האפשרות של נזק רקמות רכות רך.
   1. מקמו את הזנב המרוחק של התפר בצד החכי של השיניים והכניסו את הקטע הטוב ביותר בין המגע של M2 ו-M3 (איור 2א).
   2. לעטוף את התפר סביב משטח בוצ של M2 ולהכניס אותו בין המגע של M1 ו-M2. ודא כי שני הקצוות של תפר משכו היטב כדי לנהוג תפר לתוך חניכיים sulcus ולהסיר את כל המרווח (איור 2ב).
   3. לעטוף את מקטע תפר הטוב ביותר סביב M1, מתחת לגובהו של קונטור, ולהוסיף אותו בין המגע של M1 ו-M2. משוך את הזנב האבובי של תפר הדוק כדי לנהוג תפר לתוך חניכיים sulcus ולהסיר את כל המרווח (איור 2ג).
      הערה: אם ההתנגדות נצפתה בעת הכנסת תפר בין M1 ו-M2 או M2 ו-M3, איש הקשר עשוי להיות פתוח במקצת באמצעות שיניים סטנדרטיות אקספלורר.
   4. לקשור את קצות תפר עם קשר של מנתח לקצץ את זנבות קצר ככל האפשר. מניחים את הקשר בתוך החניכיים בטוח בין M1 ו-M2 בצד השני של שיניים מקסימום הלסת (איור 2ד).
      הערה: צעדים 1.4.1 – 1.4.4 ניתן לחזור על הצד השני, במידת הצורך.
   5. מחטא את כלי הניתוח בתוך מעקר הזכוכית החמה בין כל נושא בעל חיים.
      התראה: קצות המלקחיים חדים מאוד ויכולים בקלות לגרום לטראומה אוראלית ולדימום משמעותי. הכינו קטעים קטנים של גזה כדי להסיר דם מחלל הפה ולהפעיל לחץ על פצעים מדממים פעיל.
6. לאחר התקנת ליגטורה, להסיר את העכבר ממנגנון כירורגי, מקום לכלוב נקי תחת מנורת חום לצג עד התאושש לחלוטין.
7. הבית בנפרד כל עכבר עם העשרה הסביבה המתאימה ולאפשר גישה מודעות למים מסוננים ומחית האוכל רגיל בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולחות (12-h אור/12-h מחזור כהה) במשך 7 – 11 ימים.
   הערה: מחית האוכל מקטינה את הכוחות הנדרשים להסטיק ובכך מפחיתה את הכאב הקשור להזנה, ומסייעת למנוע אובדן מוקדם של החיבור המותקן.

2. אוסף דוגמאות

1. המתת חסד על פי ההנחיות המאושרות IACUC.
   הערה: המתת חסד אישית באמצעות תא CO₂ ולאחריה פריקה צוואר הרחם היא השיטה המועדפת עבור פרוטוקול זה. הדבר עשוי להשתנות בהתאם לניסויים הדורשים קצירת רקמות נוספות.
2. באמצעות הפיפטה, מיד לשטוף את חלל הפה עם 100 μL של עיקור 4 ° c מפוספז-מלוחים באגירה (PBS) ללא סידן ומגנזיום עבור 10 s.
3. חזור על השלב 2.2 2x ולמקם כל אחד לשטוף 15 mL במבחנה אחת של פוליפרופילן בדיקה סטרילית.
4. להעביר את התוכן למבחנה 50 mL של פוליפרופילן בדיקה סטרילית על-ידי הפעלת אותם באמצעות מסנן רשת הפעלה 40 של שינוי.
5. העבר את התכנים הללו למבחנה חדשה של פוליפרופילן 5 מ ל במבחנה סטרילית.
   הערה: ההעברה הסופית של המדגם לצינורית קטנה יותר מאפשרת את ההדמיה המשופרת של הגלולה הסלולרית בשלבים הקרבים.
   1. אם תרצה, להסיר את הקשירה טוחנת (s) ומקום לתוך 300 μL של מעוקר 1x PBS (4 ° צ', ללא סידן ומגנזיום) ב 15 מ"ל שפופרת של פוליפרופילן בדיקה וסטרילי בנפרד. מתפרעים בעדינות ומסירים. את התפר מהצינור מדגם זה מטופל באופן זהה לדגימת השטיפה האוראלית מנקודה זו והלאה.
6. הוסף 33.3 μL של 16% פאראפורמלדהיד (בתחתית) כדי להקל על קיבוע המדגם.
7. וורטקס את הדגימות מיד. ומכאן על הקרח במשך 15 דקות
8. ממלאים את הצינור כדי 15 mL עם PBS 1x כדי לדלל את המשחק, ואז צנטריפוגה ב 1000 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
9. מפני שהוא מאחר ומשהה את הגלולה ב-1 מ ל של מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית (FACS) ב -4 ° c. ספירת תאים על מונה הומוציטוטומטר או תא אוטומטי.
10. צנטריפוגה את המדגם שוב ב 1000 RCF ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
11. מזף את supernatant ולהשעות את הגלולה בנפח מתאים של מאגר FACS עבור ריכוז סופי של 0.5 – 1.0 x 10⁶ תאים/50 μl של מאגר facs.

3. מכתים נוגדנים לניתוח ציטומטלי זרימה

הערה: סמן והכה את כל צינורות ה-FACS הנדרשים לפני השימוש.

1. הוסף 1 μL של סרום חולדה 2 μL של נוגדן IgG אנטי עכבר כדי 50 μL של המדגם, מערבולת מיד, ולחסום על קרח עבור 20 דקות.
2. הוסף את הנוגדנים המתאימים לכל מדגם, מערבולת מיד, ו הדגירה על הקרח 30 דקות בחושך.
   הערה: בחירה וכמויות של נוגדנים תלויות בניסויים של טייס מיטוב מוקדם המותאמים לטכניקה ספציפית זו.
3. שטוף דגימות עם 1 מ ל של מאגר FACS, vortexing בקצרה ותפרידו עבור 5 דקות ב 1000 x g ו 4 ° c. חזור על שלב 2x זה.
4. השהה דגימות מחדש ב-250 μL של מאגר FACS, כיסוי צינורות עם סרט פרפין, עטוף ברדיד אלומיניום ומחזיק ב -4 ° צ' עד לניתוח.
   הערה: הוא אידיאלי לנתח דגימות תוך שעות של השלמת הפרוטוקול עקב אובדן של אות פלורסנט במשך פרקי זמן ארוכים של אחסון. עם זאת, ניתן לנתח דגימות 2 – 3 ימים לאחר מכן אם נדרש בהחלט.

תוצאות

זרם הנציג cy, לנסות נתונים מדגימות לשטוף אוראלי של נאיבי (איור 3a) ו מודלק (איור 3ב) חלל הפה מוריין משני המושרה לקשירה חניכיים מסופקים. התאוששות של PMNs מתוך ליגטורה מותקן הפגינו גם (איור 3ג). זרם cytometer ערוץ המתח מכויל באו...

Discussion

האלמנט הקריטי ביותר המשויך לשימוש של מודל המושרה לקשירה murine של חניכיים ממורכז סביב שמירה של ליגטורה עד לזמן ההקרבה או הסרה מכוונת. החיבור המותקן-רגיש פרטים-הקשירה מסוגל לגרימת אובדן משמעותי של גובה העצם מכתשיים כמו 6 ימים, את בין 11 – 16 תקופת היום³⁹. ההחלטה להקריב נושאי בעלי חיי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL