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요약

이 문서는 여러 상악 골치와 관련된 뮤린 치주염의 합자 유발 모델을 확립하기위한 프로토콜을 제시, 후속 분석뿐만 아니라 감소 동물 사용에 대한 관련 치은 조직과 뼈의 더 큰 영역의 결과. 인간 피험자와 유사한 방식으로 경구 호중구를 평가하는 기술도 설명되어 있다.

초록

뮤린 모델을 활용한 치주 질환의 병리생리학을 연구하는 주요 장점은 동물의 비용 절감, 유전자 변형 균주의 배열, 수확 된 부드럽고 단단한 조직에서 수행 할 수있는 방대한 수의 분석입니다. 그러나 이러한 시스템 중 상당수는 절차적 비판을 받습니다. 대안으로, 치주 유발 모델인 치주 질환은 국부적으로 개발 및 보유되는 이영양성 경구 미생물군유전체의 개발 및 보존에 의해 구동되며, 이는 급속히 유도되고 비교적 신뢰할 수 있는 것으로 채택될 수 있다. 불행히도, 합자 유도 뮤린 치주염 프로토콜의 변이체는 치주암의 초점 영역으로 격리되고 설치된 합자의 조기 avulsion을 받습니다. 이것은 후속 분석에 사용할 수 있는 조직의 양을 최소화하고 연구에 필요한 동물의 수를 증가시킵니다. 이 프로토콜은 앞서 언급한 것을 완화하는 대안적인 접근을 가진 마우스에 있는 경구 호중구를 복구하기 위하여 새로운 헹구 기술의 향상한 보유 그리고 사용으로 확장한 몰 합자를 두는 것을 요구하는 정확한 조작을 기술합니다 기술적 과제에 대한

서문

치주질환(PD)은 현저한 숙주 이환율 및 경제적 부담과 관련된 골용해 질환으로, 이는 치은 염증 및 연조직 부착 및 골변 지지체 모두의 손실로나타나며,1, 2,3,4. 이 프로세스는 경구 microbiota와 호스트의 타고난 면역 계통 사이 상호 작용에 의해 지배됩니다. 또한 당뇨병, 심혈관 질환 및 암5,6,7,8을포함하는 다른 전신 염증성 질환의 악화와 관련이 있다. 역사적으로, PD 병인은 포르피로모나스 치은염9와같은 특정 박테리아의 다량에 의존한다는 가설을 세웠다. 그러나, 최근의 증거는 PD의 미생물 성분이 치과 생물막에 의해 매개된다는 것을 시사한다. 생물막은 건강한 공생 및 파괴적인 이영양제 상태10,11에존재할 수 있는 수많은 미생물의 조직적이고 복잡한 공동체이다. 경구 생물막은 일반적으로 병원성 박테리아의 초점의 확립을 방지함으로써 숙주에게 내성을 부여하고 숙주 면역 반응의 조절을 통해 이상적인 치은 조직 구조 및 기능을촉진한다(12,13). 구강 내의 공생 유기체와 숙주 면역 계통 사이의 평형 관계의 교란은 조직 항상성의 변경으로 이어질 수 있으며, PD5,10,12,13,14의특징적인 임상 및 방사선 학적 외관의 기능 장애 및 개발의 결과로 이어질 수 있습니다.

흥미롭게도, PD의 개시에 필요한 동안 경구 디스박테리아증의 확립은, 공생및 이영양상태 사이의 미생물의 전이를 전복시키기 위한 숙주 면역 반응의 능력을 배제하는 모든 개인에서 PD를 구동하기에 충분하지 않다15. 이는 PD가 선천성 면역 계통의 주요 문자 중 하나, 즉 다형성 핵 과립구(PMN) 또는 호중구에 영향을 미치는 수단에 특히 주목하는 데, 국소 및 전신적 관점에서16,17.

인간에서는, PMN은 건강한 치주 결합 조직에서 ~ 2 x 106 세포/h의 비율로 순환에서 모집됩니다, 여기서 그들은 지배적 인 백혈구 인구입니다. 여기에서, 그(것)들은 이후에 치은 crevicular 액체의 분대로 구강으로 치은 황액에서 추방됩니다. PD의 존재에서 호중구는 순환 및 구강 내에서 나타나며, 여기서 이러한 이펙터 세포는 치주17, 18,19,20,21,22의전술 한 파괴로 이어지는 과염증성 표현형을 가지고 있습니다. 따라서 PD 및 기타 전신 염증 조건에서 PMN의 역할을 이해하는 것이 가장 중요합니다.

만성 질환이 PD에 호혜적으로 연결된다는 것은 널리 인정되지만, 근본적인 메커니즘은 아직 해명되지 않았으며, 이러한 병적 이고 잠재적으로 치명적인 전신 질환의 관리에 어려움을 겪고 있습니다. 여러 실험 동물 모델, 각각 독특한 장점과 단점을 갖는, PD23,24의병리생리학을 연구하기 위해 활용되어 왔다. 특히 뮤린 모델에 초점을 맞추고, PD의 연구가 촉진되는 다양한 프로토콜이 있다; 그러나, 그들은 몇 가지 기술적, 생리적 단점을 가지고25,26,27,28,29,30,31.

첫째, 경구 형체 마우스 모델은 치은 염증과 뼈 손실을 생성하기 위해 인간의 치주 병원균의 수많은 경구 접종을 필요로한다. 부가적으로, 일반적으로 뮤린 코멘탈 경구식물군(25)을전복시키는 항생제 치료 기간에 선행된다. 이 모델은 종종 경구 관력을 안전하게 수행하기 위해 전문 교육을 필요로하며, 보다 복잡한 인간 구강 미생물군유전체에서 치주 병원균의 작은 부분만을 사용하며 폐포 뼈 손실을 확립하는 데 몇 개월이 필요합니다.

대조적으로, 화학적으로 유도된 뮤린 모델은 치주골손실을유도하기 위해 수개월에 걸쳐 대장염의 뮤린 모델을 확립하는데 일반적으로 사용되는 제제인 트리트리트로벤젠 설포닉산(TNBS) 또는 덱스트론 설페이트 나트륨(DSS)의 경구 전달을 이용한다. 구강 내 및 외 농양 기반 모델을 사용할 수 있습니다., murine 앞니와 도르섬의 조직 뿐만 아니라 calvarium, 각각 포함. 이전 농양 모델에서, 박테리아의 여러 주사를 관리, 여러 치은 농양과 폐포 뼈 손실의 땅을 만드는, PD의 연구에서 사용을 제한. 후자의 농양 모델은 구강 외부의 부위에서 세균 독성, 염증 및 뼈 흡수를 연구하는 데 훨씬 더 적법하며, 치주 및 구강 미생물군유전체27,28,29,30,31의평가를 제거합니다.

치주염의 합자 유도 모델을 사용하여, 편조 실크 봉합사는 일반적으로 두 번째 대구치 주위에 둘레에 설치되었습니다. 대안으로, 봉합사 재료의 단일 선형 세그먼트는 제 1 및 제 2 대구치(32,33)사이에 삽입 될 수있다. 합자 배치의 목표는 치은 황치 내에서 박테리아 축적을 촉진하고 이영양증을 생성하여 치주 조직을 구성하고 치주 조직을 파괴하는 것입니다. 가장 주목할 만한 것은, 이 모델은 보다 일반적으로 사용되는 구강 관위모델(34)에비해 훨씬 더 많은 폐포 뼈 손실을 생성할 수 있다. 경구 위장 모델의 사용을 더욱 복잡하게 하는 것은 폐포 골 손실을 개발하는 마우스의 여러 균주 (즉, C57BL/6)에 의한 자연적인 저항이다. 이것은 또한 문제가, 이 균주는 가장 자주 뮤린 기반 동물 연구에서 사용으로35.

마르케산 외 및 아베 와 하지셴갈리스가 기술한 기존 절차는 합자33,36을배치하는 기술적 행위를 단순화하기 위해 고안되었다. 안타깝게도, 이전 프로토콜은 전문적인 3D 프린팅 장비를 필요로 하며 조기 합자 손실 가능성을 가지고 있어 동물 사용과 수술실에서 소요되는 추가 시간과 관련된 비용을 증가시게 됩니다. 더욱이, 두 프로토콜 모두 연구에 사용할 수 있는 병에 걸린 치주소의 작은 영역만생성한다.

이 기술로 거짓말하는 이점은 치주체를 지배하는 경구 dysbiosis 및 면역학의 동시 연구, 다양한 유전 적 배경을 가진 저비용 동물의 활용, 간단한 주거 및 축산 관행에 근거를 두었습니다. 따라서, 목표는 병에 걸린 조직의 양을 최대화하고, 동물 연구에서 감소의 원리를 실천하기 위해, 가능한 한 낮은 수준으로 동물 소비를 감소시키는 것이어야한다. 이를 위해서는 모든 동물이 실험 분석37에포함될 수 있도록 보장해야 합니다. 그러나 치주 질환의 동물 모델이 활용되더라도 인간 PD 병리생리학의 모든 요소를 포괄하는 단일 모델은 없다는 점에 유의해야합니다.

이 새로운 프로토콜은 대부분의 실험실에서 발견되는 계측 및 재료를 사용하여 여러 상악 몰 치아 주위에 합자의 배치를 사용합니다. 그것은 쉽고 자신있게 조기에 avulsss 가능성이 합자를 설치하는 충분한 시간을 허용합니다. 마지막으로, PMN이 PD에서 치주체의 파괴를 조정함에 따라, 인간과 유사한 방식으로 경구 호중구를 회복하는 새로운 방법론도 제시된다.

프로토콜

모든 뮤린 연구는 관련 윤리 규정을 준수하고 토론토 동물 관리 위원회와 연구 윤리 위원회 (프로토콜 20011930)에 의해 승인되었습니다.

1. 합자 설치

참고 : 이것은 표준 수술실에서 수행 할 수있는 비 멸균 수술 절차입니다. 세균이없는 동물 (여기에 포함되지 않음)의 사용은 생체 안전 캐비닛 내에서 의 취급, 멸균 기구의 사용 및 치주 병원균과 구강의 접종을 의무화하여 치주염의 임상 증상을 유발합니다.

  1. 승인 된 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 0.5 "26 G 멸균 피하 바늘과 1 mL 주사기를 사용하여 8-12 주 된 남성 C57BL / 6 마우스에 복강 내 마취를 투여하십시오.
    참고: 케타민(100 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)의 마취제를 조합하여 시술 기간 동안 적절한 수준의 마취를 신속하고 안정적으로 유도합니다.
  2. 페달 반사의 손실에 의해 입증 된 바와 같이 절차 동안 이전과 매 15 분 마취 깊이를 평가합니다.
  3. 가열된 수술 플랫폼에 마우스를 놓습니다(그림1A). 탄성 밴드를 사용하여 열린 위치에서 상악골과 하악을 안정시키고 목롤로 목을 소품으로 하여 상악을 보다 수평 방향으로 유지합니다(그림1B). 시술 중에 열 손실을 완화하기 위해 동물의 몸과 꼬리를 덮습니다.
  4. 수술용 현미경을 원하는 배율 및 조명(현미경에 직접 장착하지 않은 경우)에 구강 위에 배치하여 치열을 시각화합니다. 원하는 배율은 작업자에 의존하지만 구강의 최적 시각화는 16x로 얻어집니다.
  5. 스플린터 집게를 사용하여 치은 황액 내의 제 1(M1) 및 제2(M2) 상악골 주위의 멸균 5-0 편조 실크 봉합사를 설치한다.
    참고: 더 작은 게이지의 편조 실크 봉합사는 빠른 설치를 용이하게하고 일생성 연조직 손상의 가능성을 줄이기 위해이 목적을 위해 사용될 수있다.
    1. 봉합사의 말단 꼬리를 치열의 구석면에 놓고 M2와 M3의 접촉 사이에 근위 세그먼트를 삽입합니다(그림2A).
    2. M2의 볼 표면 주위에 봉합사를 감싸고 M1과 M2의 접촉 사이에 삽입합니다. 봉합사의 양쪽 끝이 단단히 당겨지도록 하여 봉합사를 치은 황액으로 유도하고 모든 여유를 제거하십시오(그림2B).
    3. 근위 봉합사 세그먼트를 윤곽선 높이 아래M1 주위로 감싸고 M1과 M2의 접촉 사이에 삽입합니다. 봉합사의 근위 꼬리를 단단히 당겨 봉합사를 치은 황액으로 유도하고 모든 여유를 제거하십시오(그림 2C).
      참고: M1과 M2 또는 M2와 M3 사이에 봉합사를 삽입할 때 저항이 관찰되면 표준 치과 탐색기를 사용하여 접촉이 약간 열릴 수 있습니다.
    4. 봉합사의 끝을 외과 의사의 매듭으로 묶고 꼬리를 가능한 한 짧게 다듬습니다. 맥기벌 마모에 매듭을 골악치극의 구석면에놓고(그림 2D).
      참고: 1.4.1-1.4.4 단계는 필요한 경우 반대측에서 반복할 수 있습니다.
    5. 각 동물 대상체 사이에 뜨거운 유리 비드 소독기에 수술 기구를 살균하십시오.
      주의: 집게의 끝은 매우 날카롭고 쉽게 구강 외상과 중요한 출혈을 일으킬 수 있습니다. 구강에서 혈액을 제거하고 적극적으로 출혈 상처에 압력을 적용하기 위해 거즈의 작은 세그먼트를 준비합니다.
  6. 합자 설치 후, 수술 장치에서 마우스를 제거하고, 열램프 아래에 깨끗한 케이지에 넣고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오.
  7. 각 마우스를 적절한 환경 농축물로 개별적으로 보관하고 7-11일 동안 온도 및 습도 제어 환경(12-h 빛/12-h 다크 사이클)에서 여과된 물과 으깬 표준 차우에 대한 광고 리비텀 액세스를 허용합니다.
    참고 : 으깬 차우는 매스틱에 필요한 힘을 감소시켜 수유와 관련된 통증을 줄이고 설치된 합자의 조기 손실을 방지하는 데 도움이됩니다.

2. 샘플 수집

  1. 승인된 IACUC 지침에 따라 마우스를 안락사시.
    참고:CO2 챔버를 사용한 개별 안락사 후 자궁 경부 탈구가 이 프로토콜에 바람직한 방법입니다. 이 추가 조직의 수확을 필요로 하는 실험에 따라 변경 될 수 있습니다.
  2. 파이펫을 사용하여 10s동안 칼슘과 마그네슘없이 멸균 된 4 °C 1x 인산완충 식염수 (PBS)로 100 μL로 구강을 즉시 헹구고.
  3. 2.2x 단계를 반복하고 단일 15 mL 원소 폴리 프로필렌 멸균 시험 튜브에 각 헹구를 놓습니다.
  4. 40 μm 나일론 메쉬 필터를 통해 이를 실행하여 50 mL 원점 폴리프로필렌 멸균 시험관으로 내용물 전달.
  5. 이러한 내용물들을 새로운 15 mL 원소 폴리프로필렌 멸균 시험관으로 옮김.
    참고 : 더 작은 튜브에 샘플의 최종 전송은 곧 단계에서 세포 펠릿의 개선 된 시각화를 허용합니다.
    1. 원하는 경우, 몰 합자(들)를 제거하고 별도의 15 mL 원추형 폴리프로필렌 멸균 시험관에서 멸균된 1x PBS(4°C, 칼슘 및 마그네슘 제외)의 300 μL로 놓습니다. 부드럽게 교반하고 튜브에서 봉합사를 제거합니다. 이 샘플은 이 시점부터 경구 헹구 샘플과 동일하게 처리됩니다.
  6. 시료 고정을 용이하게 하기 위해 16% 파라포름알데히드(PFA)의 33.3 μL을 첨가합니다.
  7. 샘플을 즉시 소용돌이시키고 15 분 동안 얼음에 배양하십시오.
  8. 튜브를 15 mL로 1x PBS로 채우고 PFA를 희석한 다음 1000 x g및 4 °C에서 원심 분리기를 5 분 동안 채웁니다.
  9. 상월체를 흡인하고 4°C에서 형광 활성화 세포 선별(FACS) 완충제의 1 mL에서 펠릿을 재중단시켰다. 혈세포계 또는 자동화 된 세포 카운터에 세포를 계수.
  10. 샘플을 1000 RCF 및 4°C에서 다시 5분 동안 원심분리합니다.
  11. 상월체를 흡인하고 FACS 버퍼의 0.5-1.0 x 106 μL의 최종 농도에 대한 FACS 완충액의 적절한 부피에서 펠릿을 재중단한다.

3. 유세포 분석용 항체 염색

참고: 사용하기 전에 필요한 모든 FACS 튜브에 라벨을 부착하고 식힙니다.

  1. 래트 혈청 1 μL과 2 μL의 항 마우스 IgG 항체를 시료의 50 μL에 넣고, 즉시 소용돌이를 넣고, 얼음을 20분 동안 차단한다.
  2. 각 샘플에 적절한 항체를 추가하고, 즉시 소용돌이를 넣고, 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양하십시오.
    참고: 항체의 선택 및 부피는 이 특정 기술에 맞춘 선행 최적화 파일럿 실험에 달려 있습니다.
  3. 1 mL의 FACS 버퍼로 샘플을 세척하고 1000 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 간략하게 소용돌이치며 원심 분리합니다. 이 단계를 2x 반복합니다.
  4. FACS 버퍼 250 μL에서 시료를 다시 일시 중단하고, 파라핀 필름으로 튜브를 덮고, 알루미늄 호일에 싸서 분석될 때까지 4°C에서 유지합니다.
    참고: 장기간 보관하는 동안 형광 신호가 손실되어 프로토콜을 완료한 후 몇 시간 내에 샘플을 분석하는 것이 이상적입니다. 그러나, 절대적으로 필요한 경우 2-3일 후에 샘플을 분석할 수 있다.

결과

나이브(도3A)와염증(도3B)뮤린구강이 합자 유발 치주염에 이차적인 경구 헹구 샘플로부터의 대표적인 유동 세포분석 데이터가 제공된다. 설치된 합자로부터의 PMN의 회수도입증된다(도 3C). 유동 세포계 채널 전압을 수동으로 보정하고 단일 스테인드 보정 비드로 보정을 수행하였다. PMN은 Ly6G

토론

치주염의 뮤린 합자 유발 모델의 사용과 관련된 가장 중요한 요소는 희생 또는 의도적 제거의 시간까지 합자의 보존을 중심으로한다. 설치된 생물막-리텐션 합자는 11-16일 기간39일사이에 고원, 6일 만에 폐포골 높이의 상당한 손실을 유도할 수 있다. 뼈 손실의 최대 기간 전에 동물 대상자를 희생하기로 결정, 이 합자 유발 치주염의 훨씬 짧은 모델을 렌더링, 더 조기 합자 avulsion?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

J. W. C. 건강 연구의 캐나다 학회에 의해 지원 됩니다 (CIHR). 저자는 트라이판 블루 염색을 수행하는 그녀의 도움에 대한 박사 춘샹 태양에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse F4/80 AntibodyBioLegend123131BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G AntibodyBD560602PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male MiceCharles River8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge TubeFroggaBioTB15-50015 mL
Conical Centrifuge TubeFroggaBioTB50-50050 mL
FACS BufferMultiple1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDivaBDv8.0.1
Fibre-LiteDolan-JennerModel 180
FlowJoTree Starv10.0.8r1
Heat Therapy PumpHallowellHTP-1500
Hot Glass Bead SterilizerElectron Microscopy Sciences66118-10Germinator 500
Iris ScissorsAlmedic7602-A8-684Straight
KetamineVetoquinol100mg/mL
LSRFortessaBDX-20
Mouse SerumSigmaM5905-5ML
Nylon Mesh FilterFisher Scientific22-363-54740 µm
ParaformaldehydeFisher Scientific2890816% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered SalineSigmaD1408-500MLWithout CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable SyringesBD3096591 mL
Rat SerumSigmaR9759-5ML
Silk SutureCovidienSS652C13 USP 5-0
Splinter ForcepsAlmedic7726-A10-700#1
Splinter ForcepsAlmedic7727-A10-704#5
Stereo Dissecting MicroscopeCarl Zeiss28865Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic NeedleBD30511126G X 1/2"
SyringeBD3096591 mL
XylazineRompun20mg/mL

참고문헌

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