Robust osufilazione modello di Murine Periodontitis per la valutazione dei neutrofili orali

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo per stabilire un modello di parodontite indotta da legatura di parodontite murina che coinvolge molari maxillari multipli, con conseguente aree più grandi del tessuto gengivale e dell'osso coinvolti per l'analisi successiva, nonché l'uso ridotto degli animali. Viene descritta anche una tecnica per valutare i neutrofili orali in modo analogo ai soggetti umani.

Abstract

I principali vantaggi dello studio della fisiopatologia della malattia parodontale utilizzando modelli murini sono la riduzione del costo degli animali, la gamma di ceppi geneticamente modificati, il gran numero di analisi che possono essere eseguite su tessuti molli e duri raccolti. Tuttavia, molti di questi sistemi sono oggetto di critiche procedurali. In alternativa, può essere impiegato il modello di malattia parodontale indotta dalla legatura, guidata dallo sviluppo localizzato e dalla ritenzione di un microbioma orale disbiotico, che è rapidamente indotto e relativamente affidabile. Purtroppo, le varianti del protocollo di parodontite murina indotta dalla legatura sono isolate nelle regioni focali del parodonto e soggette ad avulsione prematura della legatura installata. Questo riduce al minimo la quantità di tessuto disponibile per le analisi successive e aumenta il numero di animali necessari per lo studio. Questo protocollo descrive le manipolazioni precise necessarie per inserire legature molare estese con una migliore ritenzione e l'uso di una nuova tecnica di risciacquo per recuperare i neutrofili orali nei topi con un approccio alternativo che mitiga i suddetti sfide tecniche.

Introduzione

La malattia parodontale (PD) è una condizione osteolitica associata a una significativa morbilità dell'ospite e onere economico, che si manifesta con infiammazione gengivale e perdita sia dell'attaccamento dei tessuti molli che del supporto osseo per la dentizione interessata^1,2,3,4. Questo processo è regolato dalle interazioni tra il microbiota orale e il sistema immunitario innato dell'ospite. È anche associato con esacerbazione di altre malattie infiammatorie sistemiche tra cui il diabete, malattie cardiovascolari, e il cancro^5,6,7^,8. Storicamente, è stato ipotizzato che la patogenesi della PD dipende da grandi quantità di batteri specifici come Porphyromonas gingivalis⁹. Tuttavia, prove recenti suggeriscono che la componente microbica della PD è mediata dal biofilm dentale. Il biofilm è una comunità organizzata e complessa di numerosi microrganismi che possono esistere in sani stati simbiotici e distruttivi disbiotici^10,11. Il biofilm orale normalmente offre resistenza all'ospite impedendo la creazione di foci di batteri patogeni e promuove la struttura e la funzione del tessuto gengivale ideale attraverso la regolazione della risposta immunitaria dell'ospite^12,13. Le perturbazioni della relazione equilibriosa tra gli organismi commensali all'interno della cavità orale e il sistema immunitario ospite possono portare ad alterazioni dell'omeostasi dei tessuti, con conseguente disbatteriosi e sviluppo del segno distintivo delle comparse cliniche e radiografiche di PD^{5,10,12,13,14}.

È interessante notare che la creazione di una disbatteriosi orale, sebbene necessaria per l'avvio della PD, non è sufficiente per guidare la PD in tutti gli individui, eludendo verso la capacità della risposta immunitaria dell'ospite di sovvertire la transizione del microbiota tra stati simbiotici e disbiotici¹⁵. Questo pone un particolare riflettore sui mezzi attraverso i quali la PD influenza uno dei principali caratteri del sistema immunitario innato, vale a dire il granulocito polimorfonucleare (PMN), o neutrofilo, da prospettive locali e sistemiche^16,17.

Nell'uomo, le PNN vengono reclutate dalla circolazione ad un tasso di 2 x 10⁶ cellule/h nei tessuti connettivi parodontali sani, dove sono la popolazione di leucociti predominante. Qui, vengono successivamente espulsi dal solco gengivale nella cavità orale come componente del liquido crevicolare gengivale. In presenza della PD, la neutrofilia si manifesta all'interno della circolazione e della cavità orale, dove queste cellule eftori possiedono un fenotipo iperinfiammatorio che porta alla suddetta distruzione del parontium^17,18,19,20^,21,22. Pertanto, comprendere il ruolo delle PMN nella PD e in altre condizioni infiammatorie sistemiche è della massima importanza.

Anche se è ampiamente riconosciuto che le malattie croniche sono reciprocamente legate alla PD, i meccanismi sottostanti devono ancora essere chiariti, contribuendo a difficoltà nella gestione di queste condizioni sistemiche morbose e potenzialmente fatali. Diversi modelli animali sperimentali, ciascuno con vantaggi e svantaggi unici, sono stati utilizzati per studiare la fisiopatologia del PD^23,24. Concentrandosi in particolare sui modelli murini, ci sono una varietà di protocolli attraverso i quali lo studio della PD è facilitato; tuttavia, essi possiedono diverse carenze tecniche e fisiologiche^{25,26,27,28,29,30,31}.

In primo luogo, il modello di topo gavage orale richiede numerose inoculazioni orali di patogeni parodontali umani per generare infiammazione gengivale e perdita ossea. Inoltre, è generalmente preceduto da un periodo di trattamento antibiotico per sovvertire la flora orale murina^{commensale 25}. Questo modello spesso richiede una formazione specializzata per eseguire in modo sicuro il gavage orale, utilizza solo una piccola frazione di patogeni parodontali dal più complesso microbioma orale umano e richiede diversi mesi per stabilire la perdita ossea alveolare.

Al contrario, i modelli murini indotti chimicamente utilizzano la consegna orale di acido solforico trinitrobenzene (TNBS) o sodio solfato dextran (DSS), agenti comunemente utilizzati nella creazione di modelli murini di colite per un periodo di diversi mesi per indurre la perdita ossea periodoontale²⁶. Sono disponibili modelli a base di ascesso intraorale ed extraorale, che coinvolgono rispettivamente gli incisivi murini e i tessuti del dorsum e il calvario. Nel modello precedente di ascesso, vengono somministrate diverse iniezioni di batteri, creando ascessi gingivali multipli e una carenza di perdita ossea alveolare, limitando il loro uso nello studio della PD. Questi ultimi modelli di ascesso sono significativamente più adatti allo studio della virulenza batterica, dell'infiammazione e del riassorbimento osseo in siti al di fuori della cavità orale, che elimina la valutazione del paroto e del microbioma orale^27,28,29^,30,31.

Utilizzando il modello indotto dalla legatura della parodontite, una sutura di seta intrecciata è stata comunemente installata ciferenzialmente intorno al secondo molare. In alternativa, è possibile inserire un singolo segmento lineare di materiale di sutura tra il primo e il secondo molari^32,33. L'obiettivo del posizionamento della legatura è quello di facilitare l'accumulo batterico e generare disbiosi all'interno del sulci gengivale, con conseguente infiammazione del tessuto parodontale e distruzione dei tessuti che compongono il parodonto. In particolare, questo modello è in grado di produrre significativamente più perdita ossea alveolare rispetto al modello di gavage orale più comunemente usato³⁴. A complicare ulteriormente l'uso del modello di gavage orale è la resistenza naturale da parte di diversi ceppi di topi (cioè C57BL/6) allo sviluppo della perdita ossea alveolare. Questo è anche problematico, in quanto questo ceppo è il più frequentemente utilizzato nella ricerca animale a base di murini³⁵.

Le procedure esistenti descritte da Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis sono state ideate per semplificare l'atto tecnico di collocare la legatura^33,36. Purtroppo, il primo protocollo richiede attrezzature specializzate stampate in 3D e possiede il potenziale per la perdita prematura delle legature, aumentando così l'uso degli animali e i costi associati al tempo aggiuntivo trascorso in sala operatoria. Inoltre, entrambi i protocolli generano solo piccole regioni del parodonto malato disponibili per uno studio.

I vantaggi che si trovano con questa tecnica sono radicati nello studio simultaneo della disbiosi orale e dell'immunologia che governano il parodonto, l'utilizzo di animali a basso costo con diversi background genetici e semplici pratiche abitative e allevamento. Come tale, gli obiettivi dovrebbero essere di massimizzare i volumi di tessuto malato e, nel tentativo di praticare i principi di riduzione della ricerca animale, ridurre il consumo di animali a un livello il più basso possibile. Ciò richiede che tutti gli animali siano in grado di essere inclusi nelle analisi sperimentali³⁷. Tuttavia, va notato che non importa quale modello animale della malattia parodontale viene utilizzato, non esiste un singolo modello che comprenda ogni elemento della fisiopatologia della PD.

Questo nuovo protocollo impiega il posizionamento di una legatura intorno a più denti molari mascellare utilizzando strumentazione e materiali che si trovano all'interno della maggior parte dei laboratori. Permette una quantità sufficiente di tempo per installare facilmente e con sicurezza una legatura che è improbabile che si amvulsi prematuramente. Infine, poiché le PMN coordinano la distruzione del parodonto nella PD, viene presentata anche una nuova metodologia per recuperare i neutrofili orali in modo analogo agli esseri umani.

Protocollo

Tutti gli studi murine rispettavano i pertinenti regolamenti etici e sono stati approvati dall'Università di Toronto Animal Care Committee e dal Research Ethics Board (Protocollo 20011930).

1. Installazione della legatura

NOTA: Questa è una procedura chirurgica non sterile che può essere eseguita in una sala operatoria standard. L'uso di animali privi di germi (non qui trattato) impone la manipolazione all'interno di un armadio di biosicurezza, l'uso di strumenti sterili e l'inoculazione della cavità orale con patogeni parodontali per causare le manifestazioni cliniche della parodontite.

1. Somministrare l'anestesia intraperitoneale a 8-12 topi C57BL/6 maschi di una settimana, che dovrebbero essere acclimatati alla loro struttura abitativa, utilizzando un ago ipodermico sterile da 0,5" G e una siringa da 1 mL secondo le linee guida approvate del comitato di cura e di utilizzo degli animali (IACUC).
   NOTA: Una combinazione di anestetici chetamina (100 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) induce rapidamente e in modo affidabile il livello appropriato di anestesia per tutta la durata della procedura.
2. Valutare la profondità anestetica prima e ogni 15 minuti durante la procedura, come evidenziato dalla perdita del riflesso del pedale.
3. Posizionare il mouse su una piattaforma chirurgica riscaldata (Figura 1A). Stabilizzare la mascella e mandibole in posizione aperta utilizzando elastici e sostenere il collo con un rotolo di cotone per aiutare a mantenere la mascella in un orientamento più orizzontale (Figura 1B). Coprire il corpo e la coda dell'animale per mitigare la perdita di calore durante la procedura.
4. Posizionare il microscopio chirurgico all'ingrandimento e all'illuminazione desiderati (se non montato direttamente al microscopio) sopra la cavità orale per la visualizzazione della dentizione. Mentre l'ingrandimento desiderato dipende dall'operatore, la visualizzazione ottimale della cavità orale si ottiene a 16x.
5. Installare una sutura sterile di seta intrecciata 5-0 intorno al primo (M1) e al secondo (M2) molari mascellanti all'interno del solco gengivale utilizzando pinze scheggiate.
   NOTA: suture di seta intrecciate di un misuratore più piccolo possono essere utilizzate per facilitare un'installazione più rapida e ridurre la possibilità di danni ai tessuti molli iatrogenici.
   1. Posizionare la coda distale della sutura sul lato palatale della dentizione e inserire il segmento prossimale tra il contatto di M2 e M3 (Figura 2A).
   2. Avvolgere la sutura intorno alla superficie buccaliale di M2 e inserirla tra il contatto di M1 e M2. Assicurarsi che entrambe le estremità della sutura siano tirate strettamente per guidare la sutura nel solco gengivale e rimuovere tutto il margine di flessibilità (Figura 2B).
   3. Avvolgere il segmento di sutura prossimale intorno a M1, sotto la sua altezza di contorno, e inserirlo tra il contatto di M1 e M2. Tirare la coda prossimale della sutura ermeticamente per guidare la sutura nel solco gengivale e rimuovere tutto il allentamento (Figura 2C).
      NOTA: Se si osserva resistenza quando si inserisce la sutura tra M1 e M2 o M2 e M3, il contatto potrebbe essere leggermente aperto utilizzando un esploratore dentale standard.
   4. Legare le estremità della sutura con un nodo di chirurgo e tagliare le code il più corto possibile. Collocare il nodo nell'embrasure gingivale tra M1 e M2 sul lato palatale della dentizione mascellare (Figura 2D).
      NOTA: i passaggi da 1.4.1– 1.4.4 possono essere ripetuti sul lato contralaterale, se necessario.
   5. Sterilizzare gli strumenti chirurgici in uno sterilizzatore di perline di vetro caldo tra ogni soggetto animale.
      INFORMATIVA: Le punte delle pinze sono estremamente affilate e possono facilmente causare traumi orali e sanguinamento significativo. Preparare piccoli segmenti di garza per rimuovere il sangue dalla cavità orale e applicare pressione alle ferite sanguinanti attivamente.
6. Dopo l'installazione di legatura, rimuovere il mouse dall'apparato chirurgico, posizionare in una gabbia pulita sotto una lampada termica e monitorare fino a quando non completamente recuperato.
7. Ospita singolarmente ogni topo con l'adeguato arricchimento ambientale e consenti l'accesso al libitum all'acqua filtrata e al manicomio di cibo in un ambiente controllato dalla temperatura e dall'umidità (ciclo scuro di 12 ore di luce/12 h) per 7-11 giorni.
   NOTA: La chow del purè riduce le forze necessarie per la masticazione riducendo così il dolore associato all'alimentazione e aiuta a prevenire la perdita prematura della legatura installata.

2. Raccolta di campioni

1. Topi eutanasi secondo le linee guida Approvate IACUC.
   NOTA: l'eutanasia individuale che utilizza una camera_co2 seguita da lussazione cervicale è il metodo preferito per questo protocollo. Questo può essere modificato a seconda di esperimenti che richiedono la raccolta di tessuti aggiuntivi.
2. Utilizzando una pipetta, sciacquare immediatamente la cavità orale con 100 gradi l di salina sterilizzata 4C 1x priva di fosfato (PBS) senza calcio e magnesio per 10 s.
3. Ripetere il passaggio 2.2 2x e posizionare ogni risciacquo in una singola provetta sterile in polipropilene conico da 15 ml.
4. Trasferire il contenuto in una provetta sterile in polipropilene conico da 50 ml eseguendoli attraverso un filtro a rete di nylon da 40 m.
5. Trasferire questi contenuti in una nuova provetta sterile in polipropilene conico da 15 mL.
   NOTA: il trasferimento finale del campione su un tubo più piccolo consente la migliore visualizzazione del pellet cellulare nei passaggi imminenti.
   1. Se lo si desidera, rimuovere la legatura molare (s) e mettere in 300 L di sterilizzato 1x PBS (4 gradi C, senza calcio e magnesio) in un separato 15 mL conico polipropilene sterile test camera. Agitare delicatamente e rimuovere la sutura dal tubo. Questo campione viene trattato in modo identico al campione di risciacquo orale da questo punto in avanti.
6. Aggiungere 33,3 litri di paraformaldeide (PFA) del 16% per facilitare la fissazione del campione.
7. Vorticare i campioni immediatamente e incubare sul ghiaccio per 15 min.
8. Riempire il tubo a 15 mL con 1x PBS per diluire PFA, quindi centrifugare a 1000 x g e 4 gradi C per 5 min.
9. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di buffer di smistamento cellulare attivato a fluorescenza (FACS) a 4 gradi centigradi. Contare le celle su un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
10. Centrifugare nuovamente il campione a 1000 RCF e 4 gradi centigradi per 5 min.
11. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in un volume appropriato di buffer FACS per una concentrazione finale di 0,5–1,0 x 10⁶ celle/50 l di buffer FACS.

3. Colorazione anticorpale per l'analisi citometrica del flusso

NOTA: Etichettare e raffreddare tutti i tubi FACS necessari prima dell'uso.

1. Aggiungete 1 - L di siero di ratto e 2 -L di anticorpo IgG anti-topo a 50 l del campione, vortice immediatamente, e blocco sul ghiaccio per 20 min.
2. Aggiungere gli anticorpi appropriati ad ogni campione, vortice immediatamente, e incubare sul ghiaccio per 30 min al buio.
   NOTA: la selezione e i volumi degli anticorpi dipendono da esperimenti pilota di ottimizzazione preliminari su misura per questa tecnica specifica.
3. Lavare i campioni con 1 mL di tampone FACS, vortice brevemente e centrifugando per 5 min a 1000 x g e 4 gradi centigradi. Ripetere questo passaggio 2x.
4. Risospendere i campioni in 250 , l di tampone FACS, tubi di copertura con pellicola di paraffina, avvolgere in un foglio di alluminio, e tenere a 4 gradi centigradi fino all'analisi.
   NOTA: È ideale analizzare i campioni entro poche ore dal completamento del protocollo a causa della perdita di segnale fluorescente durante lunghi periodi di conservazione. Tuttavia, i campioni possono essere analizzati 2-3 giorni dopo, se assolutamente necessario.

Risultati

Vengono forniti dati relativi alla citometria di flusso rappresentativo proveniente da campioni di risciacquo orale di un'ingenua (Figura 3A) e infiammata (Figura 3B) di cavità orale che si trovano secondaria mente alla parodontite indotta dalla legatura. Viene inoltre illustrato il ripristino di PMN da una legatura installata (Figura 3C). Le tensioni del canale del citometro di fl...

Discussione

L'elemento più critico associato all'uso del modello di parodontite indotta dalla legatura murina è centrato intorno alla ritenzione della legatura fino al momento del sacrificio o della rimozione intenzionale. La legatura biofilm-retentiva installata è in grado di indurre una significativa perdita di altezza ossea alveolare in appena 6 giorni, plateauing tra il periodo di 11-16 giorni³⁹. La decisione di sacrificare i soggetti animali prima del periodo massimo di perdita ossea, rendendo questo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL