Modelo robusto induzido por ligadura de periodontite de murine para a avaliação de neutrófilos orais

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo para estabelecer um modelo induzido por ligadura de periodontite murine envolvendo múltiplos molares maxilars, resultando em áreas maiores do tecido gingival envolvido e osso para análise posterior, bem como redução do uso animal. Uma técnica para avaliar neutrófilos orais de uma forma análoga aos seres humanos também é descrita.

Resumo

As principais vantagens do estudo da fisiopatologia da doença periodontal utilizando modelos de urina são o custo reduzido dos animais, a variedade de cepas geneticamente modificadas, o grande número de análises que podem ser realizadas em tecidos macios e duros colhidos. No entanto, muitos destes sistemas estão sujeitos a críticas processuais. Como alternativa, o modelo induzido pela ligadura da doença periodontal, impulsionado pelo desenvolvimento localizado e retenção de um microbioma oral disbiótico, pode ser empregado, o que é rapidamente induzido e relativamente confiável. Infelizmente, as variantes do protocolo de periodontite murine induzida por ligadura são isoladas para regiões focais do periodontium e sujeitas à avulsão prematura da ligadura instalada. Isso minimiza a quantidade de tecido disponível para análises subsequentes e aumenta o número de animais necessários para estudo. Este protocolo descreve as manipulações precisas necessárias para colocar ligaduras molar estendidas com melhor retenção e uso de uma nova técnica de lavagem para recuperar neutrófilos orais em camundongos com uma abordagem alternativa que atenua o referido desafios técnicos.

Introdução

A doença periodontal (DP) é uma condição osteolítica associada à morbidade hospedeira significativa e carga econômica, que se manifesta pela inflamação gingival e perda de apego de tecidos moles e suporte osseoso para a dentição afetada^1,2,3,4. Este processo é regido por interações entre a microbiota oral e o sistema imunológico inato do hospedeiro. Também está associada à exacerbação de outras doenças inflamatórias sistêmicas, incluindo diabetes, doenças cardiovasculares e câncer^5,6,7,8. Historicamente, foi a hipótese de que a patogênese pd é dependente de grandes quantidades de bactérias específicas, como Porphyromonas gingivalis⁹. No entanto, evidências recentes sugerem que o componente microbiano da DP é mediado pelo biofilme odontológico. O biofilme é uma comunidade organizada e complexa de inúmeros microrganismos que podem existir em estados disbióticos e disbióticos saudáveis^10,11. O biofilme oral normalmente oferece resistência ao hospedeiro, impedindo o estabelecimento de focos de bactérias patogênicas e promove a estrutura e função ideal do tecido gingival através da regulação da resposta imune do hospedeiro^12,13. Perturbações da relação equilibrious entre organismos comensal dentro da cavidade oral e do sistema imunológico hospedeiro podem levar a alterações na homeostase tecidual, resultando em disbacteriose e desenvolvimento das aparências clínicas e radiográficas de marca registrada de PD^{5,10,12,13,14}.

Curiosamente, o estabelecimento de uma disbacteriose oral, embora necessária para o início da DP, não é suficiente para conduzir a DP em todos os indivíduos, iludindo-se para a capacidade da resposta imune do hospedeiro para subverter a transição da microbiota entre os estados simbióticos e disbióticos¹⁵. Isso coloca um foco particular sobre os meios através dos quais a DP influencia um dos personagens principais do sistema imunológico inato, ou seja, o granulocito polimorfóide (PMN), ou neutrófilo, a partir de perspectivas locais e sistêmicas^16,17.

Em seres humanos, PMNs são recrutados a partir da circulação a uma taxa de ~ 2 x 10⁶ células / h em tecidos conectivos periodontais saudáveis, onde são a população de leukócitos predomáveis. Aqui, eles são posteriormente expulsos do sulco gingival na cavidade oral como um componente do líquido crevicular gingival. Na presença de DP, a neufilia se manifesta dentro da circulação e da cavidade oral, onde essas células efetoras possuem um fenótipo hiperinflamatório que leva à destruição acima mencionada do periodontium^{17,18,19,20,21,22}. Portanto, entender o papel das PMNs na DP e em outras condições inflamatórias sistêmicas é de extrema importância.

Embora seja amplamente aceito que as doenças crônicas estejam reciprocamente ligadas à DP, os mecanismos subjacentes ainda não foram elucidados, contribuindo para dificuldades na gestão dessas condições sistêmicas mórbidas e potencialmente fatais. Vários modelos animais experimentais, cada um com vantagens e desvantagens únicas, têm sido utilizados para estudar a fisiopatologia da DP^23,24. Concentrando-se especificamente em modelos de urina, há uma variedade de protocolos através dos quais o estudo da DP é facilitado; no entanto, possuem várias deficiências técnicas e fisiométricas^{25,26,27,28,29,30,31}.

Primeiro, o modelo oral do rato do gavage exige inoculations orais numerosos de micróbios patogénicos periodontais humanos para gerar a inflamação do gingival e a perda do osso. Além disso, é geralmente precedido por um período de tratamento antibiótico para subverter a flora oral murine commensal²⁵. Este modelo muitas vezes requer treinamento especializado para realizar com segurança o gavage oral, usa apenas uma pequena fração de patógenos periodontais do microbioma oral humano mais complexo e requer vários meses para estabelecer a perda de ossos alveolares.

Em contraste, modelos de urina quimicamente induzida utilizam a entrega oral de ácido sulfonic trinitrobenzene (TNBS) ou sódio de sulfato dextran (DSS), agentes comumente usados no estabelecimento de modelos de colite murina durante um período de vários meses para induzir a perda de ossos periodontais²⁶. Modelos à base de abscesso intraoral e extraoral estão disponíveis, que envolvem os incisivos e tecidos de urina do dorsum, bem como calvarium, respectivamente. No antigo modelo abscesso, várias injeções de bactérias são administradas, criando múltiplos abcessos gingival e uma escassez de perda óssea alveolar, limitando seu uso no estudo da DP. Os últimos modelos de abscesso são significativamente mais aptos a estudar a virulência bacteriana, inflamação e resorção óssea em locais fora da cavidade oral, o que elimina a avaliação do periodontium e microbioma oral^{27,28,29,30,31}.

Usando o modelo de periodontite induzido por ligadura, uma sutura de seda trançada tem sido comumente instalada circunferentemente em torno do segundo molar. Como alternativa, um único segmento linear de material de sutura pode ser inserido entre o primeiro e o segundo molares^32,33. O objetivo da colocação da ligadura é facilitar o acúmulo bacteriano e gerar disbiose dentro dos sulci de gingival, resultando na inflamação do tecido periodontal e na destruição dos tecidos que compõem o periodontium. Mais notavelmente, este modelo é capaz de produzir significativamente mais perda óssea alveolar em comparação com o modelo de gavage oral³⁴mais comumente usado. Complicando ainda mais o uso do modelo de gavage oral é a resistência natural por várias cepas de camundongos (ou seja, C57BL/6) ao desenvolvimento de perda óssea alveolar. Isso também é problemático, pois esta cepa é a mais utilizada na pesquisa animal baseada em urina^35.

Os procedimentos existentes descritos por Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis foram concebidos para simplificar o ato técnico de colocar a ligadura^33,36. Infelizmente, o protocolo anterior requer equipamentos especializados impressos em 3D e possuem o potencial de perda de ligadura prematura, aumentando assim o uso de animais e os custos associados ao tempo adicional gasto na sala de cirurgia. Além disso, ambos os protocolos geram apenas pequenas regiões do periodontium doente disponíveis para um estudo.

As vantagens que se encontram com esta técnica baseiam-se no estudo simultâneo da disbiose oral e imunologia que regem o periodontium, utilização de animais de baixo custo com diversas origens genéticas e práticas simples de habitação e pecuária. Como tal, os objetivos devem ser maximizar os volumes de tecidos doentes e, na tentativa de praticar os princípios de redução da pesquisa animal, reduzir o consumo animal a um nível tão baixo quanto possível. Isso requer garantir que todos os animais sejam capazes de serem incluídos nas análises experimentais^37. No entanto, deve-se notar que não importa qual modelo animal de doença periodontal é utilizado, não há um único modelo que abrange todos os elementos da fisiopatologia da DP humana.

Este novo protocolo emprega a colocação de uma ligadura em torno de vários dentes molar maxiares usando instrumentação e materiais que são encontrados na maioria dos laboratórios. Permite uma quantidade de tempo suficiente instalar facilmente e confiàvelmente uma ligadura que seja pouco susceptível de avulse prematuramente. Finalmente, à medida que as PMNs coordenam a destruição do periodontium em PD, também é apresentada uma nova metodologia para recuperar neutrófilos orais de forma análoga aos seres humanos.

Protocolo

Todos os estudos de urina cumpriram os regulamentos éticos relevantes e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade de Toronto e pelo Research Ethics Board (Protocol 20011930).

1. Instalação da ligadura

NOTA: Este é um procedimento cirúrgico não-estéril que pode ser realizado em uma sala de cirurgia padrão. O uso de animais livres de germes (não cobertos aqui) exige o manuseio dentro de um armário de biossegurança, o uso de instrumentos estéreis e a inoculação da cavidade oral com patógenos periodontais para causar as manifestações clínicas de periodontite.

1. Administrar anestesia intraperitoneal a camundongos C57BL/6 machos de 8 a 12 semanas de idade, que devem ser aclimatados em suas instalações habitacionais, usando uma agulha hipodérmica estéril de 0,5" 26 G e 1 mL seringa de acordo com as diretrizes do comitê de cuidados e uso de animais institucionais aprovados (IACUC).
   NOTA: Uma combinação de cetamina (100 mg/kg) e xilamina (10 mg/kg) anestésicos de forma rápida e confiável induz o nível adequado de anestesia para a duração do procedimento.
2. Avalie a profundidade anestésica antes e a cada 15 min durante o procedimento, como evidenciado pela perda do reflexo do pedal.
3. Posicione o mouse em uma plataforma cirúrgica aquecida(Figura 1A). Estabilizar a maxilo e mandíbula na posição aberta usando faixas elásticas e sustentar o pescoço com um rolo de algodão para ajudar a manter a maxilo em uma orientação mais horizontal (Figura 1B). Cubra o corpo e a cauda do animal para mitigar a perda de calor durante o procedimento.
4. Posicione o microscópio cirúrgico na ampliação e iluminação desejadas (se não montadadiretamente ao microscópio) sobre a cavidade oral para visualização da dentição. Enquanto a ampliação desejada é dependente do operador, a visualização ideal da cavidade oral é obtida a 16x.
5. Instale uma sutura de seda trançada 5-0 estéril em torno do primeiro (M1) e segundo (M2) molars maxiares dentro do sulco gingival usando fórceps dissidentes.
   NOTA: As suturas trançadas da seda de um calibre menor podem ser usadas para esta finalidade facilitar uma instalação mais rápida e reduzir a possibilidade de dano macio iatrogenic do tecido.
   1. Posicione a cauda distal da sutura no lado palatal da dentição e insira o segmento proximal entre o contato de M2 e M3(Figura 2A).
   2. Envolva a sutura em torno da superfície bucal de M2 e insira-a entre o contato de M1 e m2. Certifique-se de que ambas as extremidades da sutura são puxadas firmemente para conduzir a sutura no sulco gingival e remover toda a folga(Figura 2B).
   3. Envolva o segmento de sutura proximal em torno da M1, abaixo de sua altura de contorno, e insira-o entre o contato de M1 e M2. Puxe a cauda proximal da sutura firmemente para conduzir a sutura no sulco de gingival e remova toda a folga(figura 2C).
      NOTA: Se a resistência é observada ao inserir a sutura entre M1 e M2 ou M2 e M3, o contato pode ser aberto ligeiramente usando um explorador dental padrão.
   4. Amarre as extremidades da sutura com o nó de um cirurgião e aparar as caudas o mais curto possível. Coloque o nó na embrasure gingival entre M1 e M2 no lado palatal da dentição maxiária (Figura 2D).
      NOTA: Os passos 1.4.1-1.4.4 podem ser repetidos no lado contralateral, se necessário.
   5. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos em um esterilizador de contas de vidro quente entre cada sujeito animal.
      CUIDADO: As pontas dos fórceps são extremamente afiadas e podem facilmente causar trauma oral e sangramento significativo. Prepare pequenos segmentos de gaze para remover o sangue da cavidade oral e aplicar pressão sobre feridas sangrando ativamente.
6. Após a instalação da ligadura, retire o rato do aparelho cirúrgico, coloque em uma gaiola limpa uma lâmpada de calor e monitore até se recuperar completamente.
7. Individualmente abrigar cada mouse com o enriquecimento ambiental adequado e permitir o acesso ad libitum à água filtrada e purê de comida padrão em um ambiente de temperatura e umidade controlada (12-h light/12-h ciclo escuro) por 7-11 dias.
   NOTA: Purê de sopa diminui as forças necessárias para a masticação, reduzindo assim a dor associada à alimentação, e ajuda na prevenção da perda prematura da ligadura instalada.

2. Coleção de amostras

1. Eutanásia ratos de acordo com as diretrizes aprovadas IACUC.
   NOTA: A eutanásia individual usando uma câmara de CO₂ seguida de deslocamento cervical é o método preferido para este protocolo. Isso pode ser alterado dependendo de experimentos que exigem a colheita de tecidos adicionais.
2. Usando uma pipeta, lave imediatamente a cavidade oral com 100 μL de soro soro soro esnito esterilizado 4 °C 1x tampão de fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio por 10 s.
3. Repita o passo 2.2 2x e coloque cada enxaguar em um único tubo de ensaio estéril cônico de polipropileno mL.
4. Transfira o conteúdo para um tubo de ensaio estéril de polipropileno cônico de 50 mL, executando-os através de um filtro de malha de nylon de 40 μm.
5. Transfira esses conteúdos para um novo tubo de ensaio estéril de polipropileno cônico de 15 mL.
   NOTA: A transferência final da amostra para um tubo menor permite a melhor visualização da pelota celular nas próximas etapas.
   1. Se desejar, retire a ligadura molar (s) e coloque em 300 μL de 1x PBS esterilizado (4 °C, sem cálcio e magnésio) em um tubo de ensaio estéril de polipropileno cônico separado de 15 mL. Agita rasto suavemente e retire a sutura do tubo. Esta amostra é tratada de forma idêntica à amostra de lavagem oral a partir deste ponto em diante.
6. Adicione 33,3 μL de 16% de paraformaldeído (PFA) para facilitar a fixação da amostra.
7. Vortex as amostras imediatamente e incubar no gelo por 15 min.
8. Encha o tubo a 15 mL com 1x PBS para diluir PFA, a seguir centrífuga em 1000 x g e 4 °C para 5 min.
9. Aspirar o supernatant e resuspender a pelota em 1 mL de triagem celular ativada por fluorescência (FACS) tampão em 4 °C. Conte as células em um hemocytometer ou contador de células automatizada.
10. Centrífuga a amostra novamente em 1000 RCF e 4 °C por 5 min.
11. Aspirar o supernatant e resuspender a pelota em um volume apropriado de buffer FACS para uma concentração final de 0,5-1,0 x 10⁶ células/50 μL de buffer FACS.

3. Mancha de anticorpos para análise citométrica de fluxo

NOTA: Rotular e refrigerar todos os tubos FACS necessários antes de usar.

1. Adicione 1 μL de soro de rato e 2 μL de anticorpo igg anti-mouse a 50 μL da amostra, vórtice imediatamente, e bloqueie o gelo por 20 min.
2. Adicione os anticorpos apropriados a cada amostra, vórtice imediatamente, e incubar no gelo por 30 min no escuro.
   NOTA: A seleção e os volumes de anticorpos dependem de experimentos piloto de otimização prévia adaptados a esta técnica específica.
3. Lave amostras com 1 mL de tampão FACS, vórtice brevemente e centrífuga por 5 min a 1000 x g e 4 °C. Repita este passo 2x.
4. Resuspenda amostras em 250 μL de tampão FACS, cubra tubos com filme de parafina, envolva em folha de alumínio e segure em 4 °C até a análise.
   NOTA: É ideal analisar amostras dentro de horas de completar o protocolo devido à perda de sinal fluorescente durante longos períodos de armazenamento. No entanto, as amostras podem ser analisadas 2-3 dias depois, se absolutamente necessário.

Resultados

Dados representativos de citometria de fluxo de amostras de lavagem oral de uma ingênua(Figura 3A)e inflamado(Figura 3B) murine cavidade oral secundária à periodontite induzida pela ligadura são fornecidos. A recuperação de PMNs de uma ligadura instalada também é demonstrada(Figura 3C). As tensões do canal do cytometer do fluxo foram calibradas manualmente, e a compensaçã...

Discussão

O elemento mais crítico associado ao uso do modelo de periodontite induzido pela ligadura murine é centrado em torno da retenção da ligadura até o momento do sacrifício ou remoção intencional. A ligadura biofilme-retentive instalada é capaz de induzir uma perda significativa de altura alveolar do osso em tão poucos quanto 6 dias, platô entre o período de 11-16 dias³⁹. A decisão de sacrificar indivíduos animais antes do período máximo de perda óssea, tornando este um modelo muito m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL