מודל טרום קליני של תרומת הלב לאחר מוות הדם

Summary

פרוטוקול זה מציג גישה פשוטה וגמישה להערכת סוכני מיזוג או אסטרטגיות חדשות כדי להגביר את הכדאיות של תרומת הלב לאחר מוות הדם.

Abstract

הביקוש להשתלה הלב הוא בעלייה; עם זאת, זמינות האיברים מוגבלת בשל העני של תורמים מתאימים. תרומת איברים לאחר מוות הדם (DCD) הוא פתרון כדי לטפל בזמינות זו מוגבלת, אבל בשל תקופה של איסכמיה חמים ממושכת ואת הסיכון של פציעה ברקמה, השימוש השגרתי שלה השתלת לב לעתים רחוקות נראה. בכתב יד זה אנו מספקים פרוטוקול מפורט היטב מחקה את השיטות הקליניות הנוכחיות בהקשר של DCD עם ניטור רציף של תפקוד הלב, המאפשר הערכה של אסטרטגיות הרומן הספר והתערבויות לירידה פציעת איסכמיה-reperfusion.

במודל זה, הפרוטוקול DCD מתחיל בחולדות לואיס מאוחסות על ידי עצירת אוורור כדי לגרום למוות במחזור הדם. כאשר לחץ דם סיסטולי יורד מתחת 30 מ מ, זמן האיסכמי חם הוא יזם. לאחר שנקבע מראש תקופת איסכמי חם, הלבבות הם לרוקן עם הפתרון cardioplegic מיקרופון, הושגו, ורכוב על לאנגדורף לשעבר vivo מערכת הזרקת לב. לאחר 10 דקות של reperfusion הראשונית ייצוב, מיזוג לב מוערך ברציפות עבור 60 מינימום באמצעות ניטור לחץ מחדש. פגיעת לב מוערך על ידי מדידת טרופונין T ו סיכונים גודל הוא כימות על ידי כתמים היסטולוגית. זמן איסכמי חם יכול להיות מאופנן ומותאם לפתח את הכמות הרצויה של נזק מבנית ופונקציונלי. פרוטוקול זה פשוט מאפשר הערכה של אסטרטגיות שונות מיזוג קרדיוקטיבי הציג ברגע של הקרדיו, reperfusion הראשונית ו/או במהלך vivo perfusion לשעבר. ממצאים שהתקבלו פרוטוקול זה ניתן לשכפל במודלים גדולים, הקלה על תרגום קליני.

Introduction

השתלת איברים מוצק בהשתלה כללית ובלב, בפרט, הם על עליית ברחבי העולם^1,2. השיטה הסטנדרטית לרכישת איברים היא תרומה לאחר מוות מוחי (DBD). בהינתן קריטריוני הכללה קפדנית של DBD, פחות מ 40% של הלבבות המוצעים מתקבלים³, ובכך להגביל את ההצעה מול הביקוש הגוברת והרחבת רשימת ההמתנה לאיברים. כדי לטפל בבעיה זו, השימוש באיברים שנתרמו לאחר מוות הדם (DCD) נחשב לפתרון פוטנציאלי⁴.

ב-dcd תורמים, עם זאת, שלב נשימות אגונאליות לאחר נסיגה של טיפול ותקופה של איסכמיה חמה לא מוגנת לפני החייאה הם בלתי נמנע⁵. פגיעת איברים פוטנציאליים לאחר מוות הדם יכול להוביל לתפקוד איברים, להסביר את חוסר הרצון לאמץ באופן שגרתי DCD השתלות לב. הוא דיווח כי רק 4 מרכזים להשתמש dcd לבבות קלינית, עם קריטריונים מחמירים הכוללת מאוד קצר איסכמיה מאוד חם ותורמים צעירים ללא פתוגיות כרוניות^6,7. מסיבות אתיות ומשפטיות, ניתן ליישם התערבויות מוגבלות או ללא התערבות קרדיוקרדיסטית בתורמים לפני מוות הדם^5,8,9. כך, כל הקלה כדי להקל על הפגיעה איסכמיה-reperfusion (IR) מוגבל לטיפולים קרדיולפתאריים שיזמו במהלך הreperfusion המוקדמות עם פתרונות קרדיולצימית, ואינם מאפשרים הערכה תפקודית נאותה. לשעבר vivo לב זלוף (evhp) ו-התניה של הלב dcd באמצעות פלטפורמות ייעודי הוצע כפתרון אלטרנטיבי ולמד על ידי חוקרים שונים^10,11,12,13 . EVHP מציעה הזדמנות ייחודית לספק סוכני שלאחר המיזוג ללבבות DCD כדי לשפר את ההחלמה הפונקציונלית. עם זאת, עבור תרגום קליני יעיל, בעיות טכניות ומעשיות רבות נותרו להיות ממוען, וזה מורכב עוד יותר על ידי חוסר הסכמה על מגוון של קריטריונים הפרזיה ופונקציונלי כדי לקבוע את היכולת הזריעה^{6, שמונה}.

כאן אנו מדווחים על התפתחות של פרוטוקול DCD לפני המחקר הקליני בשילוב עם מערכת הvivo לשעבר הפרה של הלב שניתן להשתמש בו כדי לחקור לאחר מיזוג איברים יזם בזמן הרכישה, במהלך reperfusion הראשונית, ו /או ברחבי EVHP.

Protocol

כל טיפול בעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים תאמו את המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים מעבדה ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש בוועדה של מרכז אשפוז דה לאוניברסיטת מונטריאול המרכז למחקר.

1. ההכנות הראשוניות

1. הפעל את אמבטיית המים כדי לחמם את מערכת המסירה (איור 1a) ואת מערכת לאנגדורף לשעבר vivo זלוף (איור 1a). הגדר את טמפרטורת המים עד 38.5 ° c לטמפרטורת פתרון של 37 ° c. ניתן לראות את תצלומי ההתקנה באיור המשלים 1A, B.
2. הכינו 1 ליטר של התמיסה הקרדיוקרדילית. הוסף 1 mL של 2% לידוקאין הידרוכלוריד ו 10 מ מ 2 מ"מ KCl (הריכוז הסופי 20 מ"מ) עד 1 L של פלזמה-Lyte A (140 mM Na, 5 מ"מ K, 1.5 mM מ ג, 98 mM Cl, 27 מילימטר אצטט, 23 מ"מ gluconate). PH נכון 7.4 שימוש 6 N HCl.
   זהירות: מודל זה הוא רגיש מאוד ל-pH. תיקון pH שגוי (מחוץ לטווח הפיזיולוגי של 7.3-7.4) או פתרונות בלתי יציבים של pH עלולים לפגוע בניסוי או לספק נתונים לא מהימנים.
3. הכינו 4 L של הפתרון Krebs (113 mM היאl, 4.5 mM KCl, 1.6 mM נה₂PO₄, 1.25 mm cacl₂, 1 מ"מmgcl 2 ∙ 6H₂O, 5.5 מ"מ D-גלוקוז, 25 mM נחקו₃). המוני מצע 1 L של הפתרון צריך להיות כדלקמן: 6.1 g של הנרוג, 0.3355 g של KCl, 0.2035 g של MgCl₂∙ 6h₂O, 0.192 g של נה₂PO₄, 0.1387 g של cacl₂, 0.99 g של D-גלוקוז, 2.1 g של נחקו₃ , הנפח הסופי של 1 L במים מפולים במיוחד. הוסיף את ה מיכל שלוש אחרון שימנע משקעים. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ואחסן לילה. תקן את ה-pH כדי 7.4 כאשר הפתרון הוא ב 37 ° צ' ובועה עם 5% CO₂/95% O₂.
4. ממלאים את מעגל לאנגדורף עם פתרון קרבס ולהפעיל את משאבת המערכת. לוודא כי בועות לא נותרו בתוך אבובים. כוונן את מהירות המשאבה הפריסטטית ל-80 סל"ד (שווה ערך ל-1 L/min). באמצעות שני הדרך הפסקת התרנגול, להתאים את הזרימה כדי לשמור על טפטוף איטי דרך צינורית אבי העורקים עד שהלב מוצמד (איור 1B). שמור דגימה של הפתרון krebs (15 mL) בשפופרת חרוטי 50 mL על הקרח לצורך הובלת לב.
5. תמלא את מערכת האספקה. עם התמיסה הקרדיוליסטית לאחר הבועות יוסרו, להחליף את המעגל מלוחים באמצעות התרנגול 3 דרך לעצור (איור 1A). . כוונן את קצב הטפטוף מלוחים חייב להיות באיטיות נוטף מהקצה של הקטטר כדי להבטיח כי הפתרון לא מוזרק לב לפני מותו של בעל החיים.

2. הכנה לבעלי חיים

1. באמצעות תא אינהלציה, לגרום להרדמה. ברגע שהחיה אינה מגיבה, בצע הזרקה של קטמין (75 מ"ג/ק"ג) ו-xylazine (5 מ"ג/ק"ג) או הרדמה מתאימה באופן דומה, בעקבות התקנות המקומיות, כדי לשמור על ההרדמה לשאר הפרוצדורה. להבטיח את עומק ההרדמה על ידי שום תגובה צביטה הבוהן ו palpebral רפלקס.
2. החיה משתמשת בצנתר. בעובי של 14 גר' הפעל אוורור ב 50 נשימות לדקה, עם לחץ דרכי הנשימה מוגבל 20 cmH₂O.
3. מניחים את החיה על כרית חימום שנקבעה "בינונית" ומכסה עם משטח סופג כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. הכנס לווין בטמפרטורה רקטלית וחבר חיישן אוקסימטר של הפולס לאחת הרגליים. לשמור על טמפרטורה רקטלית ב 37 ° c במהלך ההליך.
4. גישה לכלי דם
   1. לעשות 3 כדי 4 ס מ העור חתך באמצע הצוואר באמצעות מספריים. שימוש במספריים מעוקלים, מנתחים בוטה את הרקמה התת עורית וחושפים את שריר הלשון הימני. באמצעות מלקחיים לא טראומטיים, הזז את השריר מעבר לשני עד לעורק העורק הימני (פועם), וריד העורק (לא פועם) והעצב התועה (לבן) מזוהים באופן חזותי (איור משלים 2 א). בזהירות להפריד את העצב תועה מתוך העורק הראשי באמצעות תשר קהה מספריים מעוקל.
   2. הכנס הפארין (2,000 IU/ק"ג) דרך עורק הצוואר הימני. החל לחץ על אתר ההזרקה לאחר נסיגה המחט כדי למנוע דליפת דם.
   3. באמצעות מלקחיים מעוקלים, לעבור 2 5-0 התפרים משי סביב העורק הראשי. לסגר את עורק הראש. בהיבט העליון של העורק החשוף . שמור על התפר הטוב ביותר משיכת התפר הקרוב ביותר ישמשו לשליטה בדימום בשלב הבא (איור משלים 2 ב). המרחק בין התפרים צריך להיות בקירוב 2 ס מ.
   4. באמצעות stereomicroscope לצורך הדמיה טובה יותר, בזהירות לעשות חתך 1 מ"מ עם מספריים מיקרו ניתוח על הקיר הקדמי של עורק הראש. להכניס 22 גרם, 1-סנטימטר העירוי הסגור לכיוון קשת אבי העורקים. הצנתר מחובר 2 התרנגול להפסיק לעצור, המאפשר חיבור ללחץ מתמר לניטור קבוע, עם האפשרות של הזרקת תמיסת מלח או קרדיולוגית דרך מערכת המסירה (איור 1A).

3. ייזום של תרומת הלב לאחר מוות הדם (DCD) פרוטוקול

הערה: ניתן לראות את ציר הזמן המלא של הפרוטוקול באיור 2.

1. הישבנים מחדש את עומק ההרדמה על ידי ביצוע צביטה הבוהן והערכת palpebral רפלקס. אם התגובה היא נצפתה, לבצע הזרקה תוך הצפק של קטמין (37.5 mg/Kg) ו xylazine (2.5 mg/ק"ג). הערכה מחדש לאחר 5 דקות. אם לא נצפתה תשובה המשך בהליך. יש לבצע את מהדק הקנה רק בחיות מיויתות כראוי.
2. כבו את המאוורר. והוציאו את החיה , שימוש במלחציים נגד יתושים. מהדק את קנה הנשימה הרגע הזה נחשב לתחילתו של השלב האגלי. התחל לספור את הזמן הפונקציונלי החמים התפקודי (שנינות) כאשר לחץ הדם הסיסטולי השיא טיפות מתחת 30 mmHg, או אם מופיע פרפור פרוזדורי או חדרית, מה שבא הראשון (איור 3).
   הערה: מידת הנזק צריכה להיות פרופורציונלית לשנינות. ניסויים נחוצים כדי למטב את הזמן על פי הרדמה בשימוש, בעלי חיים זן, מין ומשקל נבחר. בבעלי חיים בשליטה, מיד לאחר הגישה לכלי הדם בעורק הראש מאובטח, מוזרק הקרדיו, והלב מקבל כמתואר בשלב הבא (איור 2). ההתחלה של הפרזיה עם הקרדיוסטית נחשבת לסופה של התבונה.
3. בסוף התבונה, בצע. כריתת אונה המדיאלי השאר את החזה פתוח. באמצעות מפסק אלם שימוש במספריים, לפתוח את הבור הבור הנחות ושניהם האטריה כדי למנוע שריר הלב או הקרדיודקחיסון (איור משלים 3). . תהדק את העורקים מעל הסרעפת דרך העורק הקודם של העורק הראשי, להחדיר את הפתרון cardioplegic בלחץ מתמיד של 60 mmHg עבור 5 דקות באמצעות מערכת העברת שילוח. לחץ אינפוזיה ניתן לשנות על ידי שינוי גובה של עמודת המים.
4. בסוף האינפוזיה, מנתחים את העורק הראשי הנמצא מתחת לעורקי הריאות באמצעות מלקחיים מעוקלים (4A). . לעורק התחתי השמאלי להבטיח אורך אבי העורקים של לפחות 0.5 ס"מ על הצינורית של מנגנון לאנגדורף.
5. להחזיק את הלב מאבי העורקים, להשלים את הניתוח באמצעות הפרדת הלב מעורקי הריאות וממבני החזה האחרים (איור משלים 4B). במהירות, לטבול את הלב לתוך הקרח קר קרבס פתרון לתחבורה מהירה למערכת vivo ex. שמור את זמני הניתוח וההעברה בקצרה ככל האפשר (5 דקות).

4. לשעבר Vivo מערכת הלב Perfusion (EVHP) והערכה פונקציונלית לב

1. פתח את לומן אבי העורקים. באמצעות מלקחיים Deair העורקים על ידי מילוי לומן עם הפתרון Krebs טפטוף כדי למנוע בועות לכפות על כלי הדם כלילית. הורידו את הצינורית לתוך אבי העורקים, מטפלים לא להעביר את שורש אבי העורקים או לפגוע בעלונים של שסתומי אבי העורקים. תקן את הכיוונון באמצעות מהדק קטן.
2. באמצעות העצירות 2 הדרך, להגדיל את הזרימה כדי לחפש דליפות אפשריות העורקים. אם אף אחד לא מזוהה, היטב לתקן את העורקים לצינורית באמצעות תפר משי 2-0. . פתח לגמרי את הזרימה לצינורית לשמור על לחץ האבי העורקים בלחץ פיזיולוגי של 60-70 mmHg (מותאם על ידי שינוי הגובה של המערכת). ברגע זה מתחילה הreperfusion וזמן הייצוב הראשוניים. ניתן לשנות את לחץ אבי העורקים בהתאם לתוכנית הניסיונית של החוקר.
3. סובב את הלב כך שבסיס הלב (atria) יעמוד בפני חיישן הלחץ. . מנתח את הורידים הריאתי הכנס את בלון לייטקס מחובר חיישן הלחץ. ודא כי הבלון ממוקם במלואו בתוך החדר על ידי בדיקה חזותית. באיטיות למלא את הבלון עם תמיסת מלח עד הלחץ דיאסטולי הקצה (EDP) מוגדר ל 15 מ מ. להתאים לפי הצורך כדי לשמור על קבוע edp (הקבועים מראש edp פיזיולוגי). ניתן לכוונן את ה-EDP בהתאם ליעדי הניסוי של כל חוקר.
4. הכנס את האלקטרודה הצועדת לפנים הקדמי של הלב (מערכת העיכול הימנית). הימנע מלשאת את כלי הדם הכליליים. לאחר הכאה ספונטנית הוא נצפתה, ליזום התנועה על 300 פעימות לדקה. המתח הנדרש עשוי להשתנות בין ניסויים וזנים חולדות.
5. לאחר 10 דקות של ייצוב, ליזום הקלטה רציפה בלחץ מתמשך ההקלטה מדידה. רגע זה נחשב לתחילתו של שלב ההתניה וההערכה (זמן 0) שיימשך 1 h (איור 2). התניה עשויה להיות ממושכת, אך ירידה תלויה בזמן בהתבלפות צפויה בכל לבבות.
6. בתחילת מחדש, לאסוף הקולחים הלב לרדת מתוך ורידים הלב עבור 5 דקות עבור הערכה בסיסית תזרים כלילית וניתוחים ביוכימיים. עבור טרופונין T לחזור על כל 15 דקות (כפול 0, 15, 30, 45 ו 60 דקות). עבור ניתוחים אחרים האינדיבידואליזציה של זמני איסוף נדרשת (איור 2).

5. סוף הניסיון

1. . תסיר את הלב ממנגנון לנגדורף
2. באמצעות להב פלדה ישר פחמן גבוהה (להב מיקרוטומה או דומה), להסיר את בסיס הלב (כולל עורק העורקים והריאות).
3. עם חדר החדר הימני פונה למטה, לחתוך שקופיות המוח רוחבי של 1-2 מ"מ עובי. בחלק מייצג אחד (בדרך כלל השלישי) בלו את החדר הימני ואת ההקפאה להקפיא את החדר השמאלי. ניתן להשתמש בדוגמה זו לניתוחים ביוכימיים.
4. להטביע את הסעיפים הנותרים כדי טרי מוכנים 5% 2, 3, 5-triphenyl-טטרזויום כלוריד במאגר פוספט מסחרי מלוחים pH 7.4 עבור 10 דקות ב 37 ° c. רקמות בר קיימא הם צבע אדום לבנים.
5. לשטוף פעמיים עם מאגר פוספט מלוחים pH 7.4 ולתקן עם 10% פורמלין ב 4 ° c בלילה. לשטוף פעמיים עם פוספט מלוחים באגירה pH 7.4 ולשמור כל פרוסה שקוע.
6. משיכת עודפי נוזלים ומשקל כל שקופית. לצלם תמונות צבע דיגיטליות משני הצדדים. השתמש ניתוח planimetric כדי לחשב אחוז סיכונים size ונכון עבור פרוסה משקל המוח הכולל. צבע מתפוגג עם הזמן. יש לקחת תמונות בהקדם האפשרי.

6. ניתוח נתונים

1. שמור את כל נתוני הלחץ בקובץ חדש לכל חיה.
2. לניתוחי לחץ, בחרו לפחות 200 מחזורי לחץ לנקודות זמן. ניתוח יכול להתבצע לא מקוון (לאחר סיום הניסוי) באמצעות תוכנה ייעודית (לדוגמה, LabChart). פרמטרי לב וכלי דם נפוצים זמינים כוללים: לחץ מקסימלי שנוצר, לחץ דיאסטולי הקצה, + dP/dt (מדרון תלול במהלך העומס של עקומת הלחץ, מחוון של היכולת החדרית),-dP/dt (מדרון תלול במהלך ה למטה של עקומת הלחץ, מחוון של קיבולת הרפיה חדרית) בין היתר.
   הערה: לניתוח טרופונין, גידול ב טרופונין שחרור ב reperfusion הוא צפוי. אחרי 1 h של reperfusion ב-evhp מערכת, רמות טרופונין עלול לרדת לבסיס, הדגיש את הצורך בעיתוי זהיר באוסף וטיפול של דגימות אלה.

תוצאות

לאחר ההטברות, לחץ הדם צונח במהירות בתבנית צפויה (איור 3). הזמן הצפוי למוות הוא פחות מ -5 דקות.

איור 4 מראה עקומת ממוצע לחץ/זמן בתחילת התניה לאחר 0, 10 ו 15 דקות של שנינות. תפקוד הקונאקטולה ישתפר לאורך זמן. השימוש בתקופות קצרות של שנינות תאפשר לחזור לש...

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מציג מודל פשוט, נוח תכליתי של DCD לב, המציע את ההזדמנות להעריך התאוששות תפקודית הלב, הנזק לרקמות ואת השימוש לאחר מיזוג סוכנים לאחר המיזוג כדי לשפר את ההחלמה של תורם לבבות שנמחקו לאחר ההשתלה. מערכות vivo לשעבר של לב זלוף (evhp) מערכות כבר אופטימיזציה כדי לספק פלטפורמה להערכת תפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag	Baxter		Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter	Jelco	4098	To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Milipore-Sigma	T8877	Vital coloration
22 G 1" I.V catheter	BD	383532	I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr	Skalar	50-3147	Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4"	Skalar	22-9027	Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp	ADinstruments	FE221	Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride	Milipore-Sigma	C1016	CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose	Milipore-Sigma	G8270	D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADinstruments	MLAC06	Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock)	ADinstruments	MLT0670	Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS	Gibco	14190-144	Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4"	Skalar	66-2740	Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Milipore-Sigma	HT501128	Fixative solution
Heating Pad	Sunbean	756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL	Sandoz		For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0%	Fisher scientific	A144-500	Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine	Bimeda		Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart	ADinstruments		Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon	Radnoti	170404	In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution	AstraZeneca		Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS	ACP Chemicals	M-0460	MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor	Radnoti	159905	Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker	Biotronik	Reliaty	Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter	Fisher scientific	AE150
Physiological monitor	Kent Scientific	Physiosuite	For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A	Baxter		Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride	Milipore-Sigma	P4504	KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml	Hospira		Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph	ADinstruments		Electronic polygraph
Silk 2-0	Ethicon	A305H	Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0	Ethicon	A302H	Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation	Hallowell EMC	000A2770	Small animal ventilator
Sodium bicarbonate	Milipore-Sigma	S5761	NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride	Milipore-Sigma	S7653	NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets	ACP chemicals	S3700	Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic	Milipore-Sigma	S0751	NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2"	Skalar	22-1240	Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades	Thomas scientific	6727C18	Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8"	CardinalHealth	8881511235	For heparin injection
Veterinary General Surgery Set	Skalar	98-1275	Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set	Skalar	98-1311	Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system	Radnoti	120101BEZ	Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine	Bayer		Sedative. 20 mg/mL