循環死後の心臓寄付の前臨床モデル

要約

このプロトコルは、循環死後の心臓寄付の実現可能性を高めるための新しいコンディショニング剤または戦略の評価のためのシンプルで柔軟なアプローチを示す。

要約

心臓移植需要は増加しています。それにもかかわらず、臓器の入手可能性は、適切なドナーの貧弱さのために制限されています。循環死後の臓器提供(DCD)は、この限られた利用可能性に対処するための解決策であるが、長期にわたる温暖虚血症の期間と組織損傷のリスクのために、心臓移植におけるその日常的な使用はめったに見られない。この原稿では、心臓機能の継続的なモニタリングを伴うDCDの文脈における現在の臨床慣行を厳密に模倣した詳細なプロトコルを提供し、新しい心保護戦略の評価と介入を減少させることを可能にする。虚血再灌流損傷。

このモデルでは、DCDプロトコルは、循環死を誘発するために換気を停止することによって麻酔されたルイスラットで開始される。収縮期血圧が30mmHgを下回ると、暖かい虚血時間が開始される。あらかじめ設定された暖かい虚血期の後、心臓はノルマザー性心筋溶液で洗い流され、調達され、Langendorff ex vivo心臓灌流システムに取り付けられる。初期再灌流および安定化の10分後、心室内圧力モニタリングを用いて60分間、心臓の再調整を連続的に評価する。心臓のトロポニンTを測定することによって心臓損傷を評価し、梗塞の大きさは組織染色によって定量される。暖かい虚血時間は、構造的および機能的損傷の所望の量を開発するために変調し、調整することができる。この簡単なプロトコルは、心脾痛、初期再灌流および/または排生灌流中に導入された異なる心保護調節戦略の評価を可能にします。このプロトコルから得られた知見は、臨床翻訳を容易にする、大規模なモデルで再現することができる。

概要

固体臓器移植全般および心臓移植は、特に、世界的に^増加している1,2.臓器調達の標準的な方法は、脳死後の寄付(DBD)です。DBDの厳格な包含基準を考えると、提供された心臓の40%未満^が3を受け入れられ、それによって需要の増加に直面して提供を制限し、臓器待ちリストを拡張する。この問題に対処するために、循環死後に寄付された臓器の使用(DCD)は、潜在的な解決策^と考えられる4.

しかし、DCDドナーでは、ケアの撤退後の経度相と蘇生前の無防備な温暖虚血の期間は避けられない5.循環死後の潜在的な臓器損傷は臓器機能障害を引き起こす可能性がある。DCD心臓を臨床的に使用しているのは4つのセンターのみで、非常に短い温暖な虚血時間と慢性病理を持たない若いドナーを含む厳しい基準を有する6、7が報告されている。倫理的および法的な理由から、循環死5、8、9の前にドナーに限定された、または全く心保護介入を適用することができる。したがって、虚血再灌流(IR)損傷を緩和するための緩和策は、心置行溶液による早期再灌流中に開始される心保護療法に限定され、適切な機能評価を可能にしない。専用プラットフォームを用いてDCD心臓のエクスビボ心臓灌流(EVHP)とリコンディショニングが代替ソリューションとして提案され、様々な^{学者によって}研究されている10、11、12、13.EVHPは、機能回復を改善するためにDCD心臓にポストコンディショニング剤を提供するユニークな機会を提供しています。しかし、効率的な臨床翻訳のためには、多くの技術的および実用的な問題が解決されるべきであり、これは移植性^を決定するための灌流および機能基準の範囲に関するコンセンサスの欠如によってさらに悪化する6、 ⁸.

ここでは、調達時に開始された臓器ポストコンディショニングを調査するために使用できるex vivo心臓灌流システムと組み合わせた再現可能な前臨床小型動物DCDプロトコルの開発を報告し、初期再灌流中に、/またはEVHP全体で。

プロトコル

すべての動物のケアと実験プロトコルは、実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠し、センターホスピタリティ・ド・ル・ユニバーシテ・ド・モントリオール研究センターの施設動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 予備準備

1. 水浴をオンにして、心プレア送達システム(図1A)とランジェンドルフex生体灌流システム(図1B)を加熱します。37 °C の溶液温度の場合は、水温を 38.5 °C に設定します。セットアップ写真は補足図1A、Bで見ることができます。
2. 1Lの心筋溶液を調調します。血漿ライテAの1L(140 mM Na、5 mM K、1.5mM Mg、98mM Cl、27mM酢酸塩、23mMグルコン酸塩)に2%リドカイン塩酸塩の1mLと10mLを加えます。6 N HCl を使用して pH を 7.4 に補正します。
   注意:このモデルはpHに対して非常に敏感である。間違ったpH補正(7.3-7.4生理学的範囲外)またはpH不安定な溶液は、実験を損なうか、信頼性の低いデータを提供する可能性があります。
3. クレブス溶液の4Lを調製する(113 mM NaCl、4.5 mM KCl、1.6 mM NaH₂PO 4、1.25 mM CaCl_2、1mMMgCl_2=6H2O、5.5 mM D-グルコース、25mM NaHCO_3)。溶液1L当たりの基質質量は、次のようになります: NaClの6.1 g、KClの0.3355g、MgClの0.2035 g、NaH₂PO₄の0.192g、CaCl₂の0.1387g、D-グルコースの0.99g、NaCo_の2.1g、超純脱イオン水中の1Lの最終容積。NaHCO を追加する₃降水を避けるために最後に.0.22 μm フィルターを使用して溶液をフィルター処理し、一晩保存します。溶液が37°Cで、5%CO₂/95%O2で気泡がある場合は、pHを7.4に修正します。
4. ランゲンドルフ回路をKrebs溶液で満たし、システムポンプを起動します。チューブの中に気泡が残っていないことを確認します。蠕動ポンプ速度を80rpm(1 L/min相当)に調整します。双方向ストップコックを使用して、心臓が取り付けられるまで大動脈カニューレを通してゆっくりとドリップを維持するために流れを調整します(図1B)。心臓輸送のための氷の上の50 mLの円錐管のクレブス溶液(15 mL)のサンプルを保つ。
5. 心プレグレッシカルソリューションで心プレギア送達システムを埋めます。気泡を取り除いたら、3ウェイストップコック(図1A)を使用して回路を生理生理生理に切り替えます。ドリップレートを調整します。生理食動物の死の前に心因性溶液が注入されないように、生理食動物はカテーテルの先端からゆっくりと滴下する必要があります。

2. 動物の準備

1. 吸入室を用いて、3%イソファランで麻酔を誘導する。動物が応答しない場合は、ケタミン(75mg/kg)およびキシラジン(5mg/kg)または同様に適切な麻酔薬の下皮注射を行い、現地の規制に従って、残りの手順の麻酔を維持する。つま先のピンチとパルペブラル反射に反応しないで麻酔の深さを確保します。
2. 14 G、2インチのI.V.カテーテルを使用して動物を挿管します。気道圧が20 cmH₂Oに制限され、毎分50呼吸で換気を開始します。
3. 「中」に設定された加熱パッドに動物を置き、体温を維持するために吸収性パッドで覆います。直腸温度プローブを挿入し、経皮パルスオキシメータセンサーを足の1つに取り付けます。手順を通して直腸温度を37°Cに保ちます。
4. 血管アクセス
   1. はさみを使って首に3~4cmの中線皮膚切開を行います。鈍い先端の湾曲したはさみを使用して、鈍い皮下組織を解剖し、右のステルノヒオイド筋を露出させる。非外傷性鉗子を用いて、右頚動脈(脈動)、頸静脈(非脈動)および迷走神経(白色)が視覚的に同定されるまで筋肉を横に動かす(補足図2A)。鈍い先端の湾曲したはさみを使用して頚動脈から迷走神経を慎重に分離します。
   2. 右頚静脈を介してヘパリン(2,000 IU/kg)を注入する。血液漏れを避けるために、針の引き込み後に注射部位に圧力を加えます。
   3. 湾曲した鉗子を使用して、頚動脈の周りに2つの5-0シルク縫合糸を渡す。露出した動脈の優れた側面で頚動脈を閉塞させる遠位縫合糸をしっかりと取り付けます。近位縫合糸を結ばないようにします。近位縫合糸の引っ張りは、次のステップで出血制御に使用される(補足図2B)。縫合糸間の距離は約2 cmでなければなりません。
   4. より良い視覚化のための立体顕微鏡を使用して、慎重に頚動脈の前壁の上にマイクロ外科はさみで1ミリメートルの切開を行います。22 G、1 インチの閉じた I.V.カテーテルを大動脈のアーチに向かって挿入します。カテーテルは2ウェイストップコックに接続され、一定のモニタリングのための圧力トランスデューサへの接続を可能にし、心plegia送達システムを介して生理食べ物または心脾臓を注入する可能性がある(図1A)。

3. 循環死後の心臓寄付の開始(DCD)プロトコル

注:完全なプロトコルタイムラインを図 2に見ることができます。

1. つま先のピンチを実行し、パルペブラル反射を評価することにより、麻酔の深さを再びアスキスします。反応が観察された場合, ケタミンの経皮注射を行う (37.5 mg/Kg) キシラジン (2.5 mg/Kg).5分後に再評価する。応答が観察されない場合は、手順を続行します。気管クランプは、適切に麻酔された動物でのみ行われるべきである。
2. 人工呼吸器をオフにし、動物を排泄します。蚊鉗子を使用して、気管をクランプ。この瞬間は、アゴナルフェーズの始まりと考えられています。ピーク収縮期血圧が30mmHgを下回った場合、または無収縮または心室細動が現れたら、機能的な暖かい虚血時間(WIT)を数え始める(図3)。
   注:損害範囲は WIT に比例する必要があります。使用される麻酔薬、動物のひずみ、性別および体重に応じてWIT時間を最適化するために実験が必要です。対照動物において、頚動脈血管アクセスが確保された直後に、心膜炎が注入され、次のステップで説明するように心臓が調達される(図2)。心膜炎の灌流の開始は、WITの終わりと考えられています。
3. WITの終了時に、中間の立体摘出を行う。Alm リトラクタを使用して胸部を開いたままにします。はさみを用いて、心筋の発散または心不全の再循環を避けるために、下の静脈カバと両方の心房を開きます(補足図3)。ダイヤフラムの上の大動脈をクランプします。以前にカテーテル化された頚動脈を通して、心プレア送達システムを使用して5分間60 mmHgの一定の圧力で心電図溶液を注入する。注入圧力は、水柱の高さを変更することによって変更することができる。
4. 心肺注入の終わりに、湾曲した鉗子を用いて肺動脈から上昇近位大動脈を解剖する(補足図4A)。大動脈を左鎖骨下動脈に切る。ランゲンドルフ装置のカナンレーションのために少なくとも0.5 cmの大動脈の長さを保障する。
5. 心臓を大動脈から保持し、肺静脈および他の胸部構造から心臓を分離して生残術を完了する(補足図4B)。急速に、外生システムへの迅速な輸送のための氷冷クレブス溶液に心臓を浸す。解剖と輸送時間をできるだけ短くしてください(5分)。

4. エクスビボ心臓灌流システム(EVHP)と心臓機能評価

1. 鉗子を使用して大動脈のルーメンを開きます。冠状動脈血管に気泡を押し込まないように、滴下クレブス溶液で内膜を充填することにより、大動脈を脱気します。カニューレを大動脈に下げ、大動脈根を通過したり、大動脈弁のリーフレットを損傷しないように注意してください。小さなクランプでセットアップを修正します。
2. 2ウェイストップコックを使用して、大通りで起こりうる漏れを探すために流れを増やします。何も検出されない場合は、2-0シルク縫合糸を使用してカニューレに大小をしっかりと固定します。カニューレへの流れを完全に開きます。60-70 mmHgの生理的圧力で大動脈圧を維持する(システムの高さを変えることによって調節される)。この時点で、初期再灌流および安定化時間が開始されます。大動脈圧は、研究者の実験計画に従って変更することができる。
3. 心臓(心房)の基部が圧力センサに向かるように心臓を回転させます。肺静脈を解剖して左心室開口を広げる。圧力センサーに接続されているラテックスバルーンを挿入します。目視検査により、気球が心室内に完全に配置されていることを確認します。拡張期圧力(EDP)が15mmHgに設定されるまで、ゆっくりと生理的に生理的にバルーンを充填します。EDPを一定に保つために必要に応じて調整します(あらかじめ決定された生理EDP)。EDPは、各研究者の実験目的に従って調整することができる。
4. 心臓の前面(右心室流出路)にペーシング電極を挿入します。冠状動脈の容器を穿刺しないようにしてください。自発的な拍動が観察されると、毎分300ビートでペーシングを開始し、必要な電圧は実験とラット株の間で変化する可能性があります。
5. 安定化の10分後、連続的な静脈内圧測定記録を開始する。この瞬間は、1時間持続するリコンディショニングと評価フェーズ(時間0)の始まりと考えられています(図2)。リコンディショニングは長引くかもしれませんが、すべての心臓に時間依存性の低下が予想されます。
6. リコンディショニングの開始時に、ベースライン冠動脈の流れ評価および生化学的分析のために5分間心臓静脈から落ちる心臓の流出物を集める。トロポニンTについては、15分毎に繰り返す(回0、15、30、45および60分)。その他の分析では回収時間の個別化が必要(図2)。

5. 経験の終わり

1. ラングデンドルフ装置から心臓を取り除きます。
2. まっすぐな高炭素鋼の刃(マイクロトームブレードまたは類似)を使用して、心臓の基部(大動脈および肺動脈を含む)を取り除く。
3. 右心室を下向きにして、厚さ1〜2mmの横心室スライドを切断します。1つの代表的なセクション(通常は第3)で右心室を切除し、左心室を凍結するスナップ。このサンプルは生化学的分析に使用することができる。
4. 残りの切片を37°Cで10分間、市販のリン酸バッファー生理食塩水食塩水中に2,3,5-トリフェニル-テトラゾリウム塩化物を2,3,5-テトラゾリウムに浸します。生存可能な組織は赤レンガで着色されています。
5. リン酸バッファー生理食液pH 7.4で2回洗浄し、一晩4°Cで10%ホルマリンで固定します。リン酸緩衝生理食生pH 7.4で2回洗浄し、各スライスを水没させたままにします。
6. 余分な液体と重量を各スライドを撤回します。両側のデジタルカラー画像を撮ります。平面解析を使用して、梗塞のサイズを計算し、スライスと全心室の重量を補正します。色分けは時間とともにフェードします。写真はできるだけ早く撮らなければなりません。

6. データ分析

1. 動物ごとに新しいファイルにすべての圧力データを保存します。
2. 圧力解析では、ポイントごとに少なくとも 200 の圧力サイクルを選択します。分析は、専用ソフトウェア(LabChart)を使用して、オフライン(実験終了後)に行うことができます。利用可能な一般的な心血管パラメータが含まれます:最大発生圧力、末端拡張圧、+dP/dt(圧力曲線の上書き中に最も急な斜面、心室収縮能力の指標)、-dP/dt(最も急な傾斜圧力曲線のダウンストローク、心室緩和能力の指標)。
   注:トロポニン分析の場合、再灌流時のトロポニン放出の増加が予想される。EVHPシステムでの再灌流の1時間後、トロポニンレベルはベースラインに減少し、これらのサンプルの収集および取り扱いにおける慎重なタイミングの必要性を強調する。

結果

挿管後、血圧は予測可能なパターンで急速に低下する(図3)。予想死亡時間は5分未満です。

図 4は、WIT の 0、10、および 15 分に続くリコンディショニング開始時の平均圧力/時間曲線を示しています。収縮機能は時間の経過とともに改善されます。WITの短期間の使用は、収縮性が正常に戻ることを可能にし、形態学的損傷は検出?...

ディスカッション

ここで提示されるプロトコルは、心臓DCDのシンプルで便利で汎用性の高いモデルを導入し、心臓機能回復、組織損傷、およびドナーの回復を改善するためのポストコンディショニング心保護剤の使用を評価する機会を提供します。そうでなければ移植のために廃棄される心臓。Ex vivo心臓灌流システム(EVHP)システムは、心臓機能を評価するためのプラットフォームを提供し、ポストコンディシ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag	Baxter		Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter	Jelco	4098	To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Milipore-Sigma	T8877	Vital coloration
22 G 1" I.V catheter	BD	383532	I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr	Skalar	50-3147	Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4"	Skalar	22-9027	Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp	ADinstruments	FE221	Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride	Milipore-Sigma	C1016	CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose	Milipore-Sigma	G8270	D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADinstruments	MLAC06	Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock)	ADinstruments	MLT0670	Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS	Gibco	14190-144	Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4"	Skalar	66-2740	Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Milipore-Sigma	HT501128	Fixative solution
Heating Pad	Sunbean	756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL	Sandoz		For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0%	Fisher scientific	A144-500	Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine	Bimeda		Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart	ADinstruments		Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon	Radnoti	170404	In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution	AstraZeneca		Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS	ACP Chemicals	M-0460	MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor	Radnoti	159905	Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker	Biotronik	Reliaty	Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter	Fisher scientific	AE150
Physiological monitor	Kent Scientific	Physiosuite	For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A	Baxter		Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride	Milipore-Sigma	P4504	KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml	Hospira		Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph	ADinstruments		Electronic polygraph
Silk 2-0	Ethicon	A305H	Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0	Ethicon	A302H	Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation	Hallowell EMC	000A2770	Small animal ventilator
Sodium bicarbonate	Milipore-Sigma	S5761	NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride	Milipore-Sigma	S7653	NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets	ACP chemicals	S3700	Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic	Milipore-Sigma	S0751	NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2"	Skalar	22-1240	Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades	Thomas scientific	6727C18	Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8"	CardinalHealth	8881511235	For heparin injection
Veterinary General Surgery Set	Skalar	98-1275	Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set	Skalar	98-1311	Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system	Radnoti	120101BEZ	Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine	Bayer		Sedative. 20 mg/mL