Modèle préclinique du don cardiaque après la mort circulatoire

Résumé

Ce protocole montre une approche simple et flexible pour l'évaluation de nouveaux agents de conditionnement ou de stratégies pour augmenter la faisabilité du don cardiaque après la mort circulatoire.

Résumé

La demande de transplantation cardiaque est à la hausse; néanmoins, la disponibilité des organes est limitée en raison du manque de donneurs appropriés. Le don d'organes après la mort circulatoire (DCD) est une solution pour répondre à cette disponibilité limitée, mais en raison d'une période d'ischémie chaude prolongée et le risque de lésions tissulaires, son utilisation courante dans la transplantation cardiaque est rarement vu. Dans ce manuscrit, nous fournissons un protocole détaillé imitant étroitement les pratiques cliniques actuelles dans le contexte de DCD avec la surveillance continue de la fonction cardiaque, permettant l'évaluation des nouvelles stratégies et interventions cardioprotectrices pour diminuer ischémie-reperfusion.

Dans ce modèle, le protocole DCD est initié chez les rats Lewis anesthésiés en arrêtant la ventilation pour induire la mort circulatoire. Lorsque la pression artérielle systolique descend en dessous de 30 mmHg, le temps ischémique chaud est lancé. Après une période ischémique chaude pré-fixée, les coeurs sont rincés avec une solution cardioplégique normothermic, acheté, et monté sur un système de perfusion de coeur ex vivo de Langendorff. Après 10 min de réperfusion et de stabilisation initiales, le reconditionnement cardiaque est continuellement évalué pendant 60 min en utilisant la surveillance intraventriculaire de pression. Une lésion cardiaque est évaluée en mesurant la troponine cardiaque T et la taille infarctus est quantifiée par la coloration histologique. Le temps ischémique chaud peut être modulé et adapté pour développer la quantité désirée de dommages structurels et fonctionnels. Ce protocole simple permet l'évaluation de différentes stratégies de conditionnement cardioprotective introduites au moment de la cardioplégie, de la réperfusion initiale et/ou pendant la perfusion ex vivo. Les résultats obtenus à partir de ce protocole peuvent être reproduits dans de grands modèles, facilitant la traduction clinique.

Introduction

La transplantation d'organes solides en général et la transplantation cardiaque, en particulier, sont à la hausse dans le monde^1,2. La méthode standard d'achat d'organes est le don après la mort cérébrale (DBD). Compte tenu des critères d'inclusion stricts de la DBD, moins de 40% des cœurs offerts sont acceptés³, limitant ainsi l'offre face à la demande croissante et l'extension de la liste d'attente des organes. Pour résoudre ce problème, l'utilisation d'organes donnés après la mort circulatoire (DCD) est considérée comme une solution potentielle⁴.

Chez les donneurs de DCD, cependant, une phase angoissée après le retrait des soins et une période d'ischémie chaude non protégée avant la réanimation sont inévitables⁵. Les dommages potentiels d'organe après la mort circulatoire peuvent mener au dysfonctionnement d'organe, expliquant la réticence à adopter systématiquement des transplantations de coeur de DCD. Il est rapporté que seulement 4 centres utilisent des coeurs de DCD médicalement, avecdes critères stricts qui incluent les temps chauds très courts d'ischémie chaude et les jeunes donateurs sans pathologies chroniques 6,⁷. Pour des raisons éthiques et juridiques, des interventions cardioprotectrices limitées ou inadaptées peuvent être appliquées chez les donneurs avant la mort circulatoire^5,8,9. Ainsi, toute atténuation pour soulager les lésions ischémique-réperfusion (IR) est limitée aux thérapies cardioprotectrices initiées lors d'une réperfusion précoce avec des solutions cardioplégiques, et ne permettent pas une évaluation fonctionnelle appropriée. Perfusion cardiaque ex vivo (EVHP) et le reconditionnement du cœur DCD à l'aide de plates-formes dédiées a été proposé comme une solution alternative et étudié par divers chercheurs^10,11,12,13 . EVHP offre une occasion unique de fournir des agents post-conditionnement aux cœurs DCD pour améliorer la récupération fonctionnelle. Cependant, pour une traduction clinique efficace, de nombreuses questions techniques et pratiques restent à résoudre, et cela est encore aggravé par l'absence de consensus sur une gamme de perfusion et de critères fonctionnels pour déterminer la transplantation^{6, 8}.

Ici nous rapportons le développement d'un protocole préclinique reproductible de DCD d'animal de petit animal combiné avec un système ex vivo de perfusion de coeur qui peut être employé pour étudier le post-conditionnement d'organe lancé au moment de l'approvisionnement, pendant la reperfusion initiale, et /ou dans l'ensemble de l'EVHP.

Protocole

Tous les protocoles de soins et d'expérimentation des animaux conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire ont été approuvés par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Centre hospitalier de l'Université de Montréal.

1. Préparations préliminaires

1. Allumez le bain d'eau pour chauffer le système de livraison de cardioplégie (Figure 1A) et le système de perfusion ex vivo Langendorff (Figure 1B). Fixer la température de l'eau à 38,5 oC pour une température de solution de 37 oC. Les photographies d'configuration peuvent être vues dans la figure 1A supplémentaire,B.
2. Préparer 1 L de solution cardioplégique. Ajouter 1 ml d'hydrochlorure de lidocaïne 2% et 10 ml de 2 ml de KCl (concentration finale 20 mM) à 1 L de Plasma-Lyte A (140 mM Na, 5 mM K, 1,5 mM Mg, 98 mM Cl, 27 mM d'acétate, 23 mM de gluconate). PH correct à 7.4 en utilisant 6 N HCl.
   MISE EN GARDE: Ce modèle est très sensible au pH. Une correction du pH erroné (en dehors de la plage physiologique de 7,3-7,4) ou des solutions instables de pH peuvent compromettre l'expérience ou fournir des données peu fiables.
3. Préparer la solution 4 L de Krebs (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH₂PO₄, 1,25 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂6H₂O, 5,5 mM D-Glucose, 25 mM NaHCO₃). Les masses de substrat pour 1 L de solution doivent être les suivantes: 6,1 g de NaCl, 0,3355 g de KCl, 0,2035 g de MgCl₂6H₂O, 0,192 g de NaH₂PO₄, 0,1387 g de CaCl₂, 0,99 g de D-Glucose, 2,1 g de NaHCO₃ , volume final de 1 L en eau déionisée ultrapure. Ajouter le NaHCO _{3 (en)} dernier pour éviter les précipitations. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 m et stocker pendant la nuit. Corriger le pH à 7,4 lorsque la solution est à 37 oC et bulle avec 5% CO₂/95% O₂.
4. Remplissez le circuit Langendorff avec la solution Krebs et démarrez la pompe système. Assurez-vous qu'il n'y a plus de bulles à l'intérieur dutube. Ajuster la vitesse de la pompe péristatique à 80 tr/min (équivalent à 1 L/min). En utilisant le coq d'arrêt à double sens, ajuster le flux pour maintenir un goutte à goutte lent à travers la canule aortique jusqu'à ce que le cœur est attaché (Figure 1B). Conservez un échantillon de solution Krebs (15 ml) dans un tube conique de 50 ml sur la glace pour le transport cardiaque.
5. Remplissez le système de livraison cardioplégie avec la solution cardioplégique. Une fois les bulles enlevées, basculez le circuit en salin à l'aide d'un coq d'arrêt à 3 voies (Figure 1A). Ajuster le taux d'égouttement. Saline doit couler lentement de la pointe du cathéter pour s'assurer qu'aucune solution cardioplégique n'est injectée avant la mort de l'animal.

2. Préparation des animaux

1. À l'aide d'une chambre d'inhalation, induire l'anesthésie avec 3% d'isoflurane. Une fois que l'animal ne répond pas, effectuez une injection intrapéritonéale de kétamine (75 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) ou d'anesthésique s'apparatif, conformément aux règlements locaux, pour maintenir l'anesthésie pour le reste de la procédure. Assurer la profondeur de l'anesthésie par aucune réaction à pincement d'orteil et réflexe palpebral.
2. Intuber l'animal à l'aide d'un cathéter I.V. de 14 G et 2 pouces. Démarrer la ventilation à 50 respirations par min, avec une pression des voies respiratoires limitée à 20 cmH₂O.
3. Placez l'animal sur un coussin chauffant réglé sur « moyen » et recouvrez-le d'un coussin absorbant pour maintenir la température corporelle. Insérez une sonde de température rectale et attachez un capteur d'oxymètre d'impulsion transdermique à l'un des pieds. Maintenir la température rectale à 37 oC tout au long de la procédure.
4. Accès vasculaire
   1. Faire une incision de 3 à 4 cm dans la peau médiane dans le cou à l'aide de ciseaux. À l'aide de ciseaux courbés à pointe émoussée, disséquer le tissu sous-cutané et exposer le muscle sternohyoid droit. À l'aide de forceps non traumatiques, déplacez le muscle latéralement jusqu'à ce que l'artère carotide droite (pulsation), la veine jugulaire (non-pulsation) et le nerf vague (blanc) soient visuellement identifiés (Figure 2A supplémentaire). Séparez soigneusement le nerf vague de l'artère carotide à l'aide de ciseaux courbés à pointe émoussée.
   2. Injecter de l'héparine (2 000 UI/kg) par l'intermédiaire de la veine jugulaire droite. Appliquer une pression sur le site d'injection après la rétraction de l'aiguille pour éviter les fuites de sang.
   3. À l'aide de forceps incurvés, passez deux sutures de soie 5-0 autour de l'artère carotide. Attachez fermement une suture distale à l'occludede de l'artère carotide à l'aspect supérieur de l'artère exposée. Gardez la suture proximale déliée. Le tir de la suture proximale sera utilisé pour le contrôle des saignements à l'étape suivante (Figure 2B supplémentaire). La distance entre les sutures doit êtred'environ 2 cm.
   4. À l'aide d'un stéréomicroscope pour une meilleure visualisation, faites soigneusement une incision de 1 mm avec des ciseaux de microchirurgie au-dessus de la paroi antérieure de l'artère carotide. Insérez un cathéter I.V. fermé de 22 G et 1 pouce vers l'arc aortique. Le cathéter est relié à un robinet d'arrêt à 2 voies, permettant la connexion à un transducteur de pression pour une surveillance constante, avec la possibilité d'injecter saline ou cardioplégie via le système de livraison cardioplégie (Figure 1A).

3. Initiation du don cardiaque après la mort circulatoire (DCD) Protocole

REMARQUE: Un calendrier complet du protocole peut être consulté à la figure 2.

1. Réévalue la profondeur anesthésique en effectuant une pincement d'orteil et en évaluant le réflexe palpebral. Si la réaction est observée, effectuer une injection intrapéritonéale de kétamine (37,5 mg/Kg) et de xylazine (2,5 mg/Kg). Réévaluer après 5 minutes. Si aucune réponse n'est observée, continuez la procédure. La pince trachéale ne doit être effectuée que chez des animaux correctement anesthésiés.
2. Éteignez le ventilateur et extubatez l'animal. À l'aide de forceps de moustique, serrer la trachée. Ce moment est considéré comme le début de la phase agonale. Commencez à compter le temps ischémique chaud fonctionnel (WIT) lorsque la pression artérielle systolique maximale descend en dessous de 30 mmHg, ou si la fibrillation asystole ou ventriculaire apparaît, quel que soit le premier (Figure 3).
   REMARQUE: L'étendue des dommages devrait être proportionnelle à LA PFT. Des expériences sont nécessaires pour optimiser le temps WIT en fonction de l'anesthésie utilisée, de la souche animale, du sexe et du poids choisi. Chez les animaux témoins, immédiatement après la sécurité de l'accès vasculaire carotide, la cardioplégie est injectée et le cœur est acheté comme décrit à l'étape suivante (figure 2). Le début de la perfusion avec la cardioplégie est considéré comme la fin de WIT.
3. À la fin de WIT, effectuer une stérilisation médiale. Gardez le thorax ouvert à l'aide d'un rétracteur alm. À l'aide de ciseaux, ouvrez le vela cava inférieur et les deux atriums pour éviter la distension myocardique ou la recirculation cardioplégie (figure complémentaire 3). Clamp l'aorte au-dessus du diaphragme. Par l'artère carotide précédemment cathéterisée, infuser la solution cardioplégique à une pression constante de 60 mmHg pendant 5 min utilisant le système de livraison de cardioplegia. La pression d'infusion peut être modifiée en modifiant la hauteur de la colonne d'eau.
4. À la fin de l'infusion cardioplégique, disséquez l'aorte proximale ascendante de l'artère pulmonaire à l'aide de forceps courbés (figuresupplémentaire 4A). Couper l'aorte distale à l'artère sous-clavière gauche. Assurer une longueur aortique d'au moins 0,5 cm pour le cannulation pour l'appareil Langendorff.
5. Tenir le cœur de l'aorte, compléter la cardicectomie en séparant le cœur des veines pulmonaires et d'autres structures thoraciques (figuresupplémentaire 4B). Rapidement, submergez le cœur dans la solution Krebs glacée pour un transport rapide vers le système ex vivo. Gardez la dissection et les temps de transport aussi courts que possible (5 min).

4. Système de perfusion cardiaque Ex Vivo (VEV) et évaluation fonctionnelle cardiaque

1. Ouvrez le lumen aortique à l'aide de forceps. Déporter l'aorte en remplissant le lumen avec la solution Krebs goutte à goutte pour éviter de forcer des bulles dans les vaisseaux coronaires. Abaissez la canule dans l'aorte, en prenant soin de ne pas passer la racine aortique ou d'endommager les folioles de valve aortique. Fixer la configuration avec une petite pince.
2. En utilisant le stopcock à 2 voies, augmenter le débit pour rechercher des fuites possibles dans l'aorte. Si aucun n'est détecté, fixer fermement l'aorte à la canule à l'aide d'une suture de soie 2-0. Ouvrez entièrement le flux vers la canule. Maintenir une pression aortique à une pression physiologique de 60-70 mmHg (ajustée en modifiant la hauteur du système). À ce moment, le temps initial de réperfusion et de stabilisation est lancé. La pression aortique peut être modifiée selon le plan expérimental de l'enquêteur.
3. Faites pivoter le cœur de sorte que la base du cœur (atria) est face au capteur de pression. Élargir l'ouverture auriculaire ventriculaire gauche en disséquant les veines pulmonaires. Insérez le ballon en latex relié à un capteur de pression. Assurez-vous que le ballon est entièrement positionné à l'intérieur du ventricule par inspection visuelle. Remplissez lentement le ballon de salin jusqu'à la fin de la pression diastolique (EDP) est réglé à 15 mmHg. Ajuster au besoin pour maintenir l'EDP constant (EDP physiologique prédéterminé). Le PDE peut être ajusté en fonction des objectifs expérimentaux de chaque chercheur.
4. Insérer l'électrode de stimulation dans la face antérieure du cœur (tract droite ventriculaire). Évitez de perforer les vaisseaux coronaires. Une fois que le battement spontané est observé, initier le rythme à 300 battements par min. La tension requise peut varier entre les expériences et les souches de rats.
5. Après 10 min de stabilisation, initier l'enregistrement continu de mesure de pression intraventriculaire. Ce moment est considéré comme le début de la phase de reconditionnement et d'évaluation (temps 0) qui durera 1 h (Figure 2). Le reconditionnement peut être prolongé, mais une diminution de la contractilité dépendante du temps est prévue dans tous les cœurs.
6. Au début du reconditionnement, recueillir les effluents cardiaques tombant des veines cardiaques pendant 5 min pour l'évaluation de base du débit coronaire et des analyses biochimiques. Pour la troponine T répéter toutes les 15 min (temps 0, 15, 30, 45 et 60 min). Pour d'autres analyses, l'individualisation des temps de collecte est nécessaire (Figure 2).

5. Fin de l'expérience

1. Retirez le cœur de l'appareil Langendorff.
2. À l'aide d'une lame d'acier à haute teneur en carbone droite (lame de microtome ou similaire), enlever la base du cœur (y compris l'aorte et l'artère pulmonaire).
3. Avec le ventricule droit vers le bas, couper les glissières ventriculaires transversales d'une épaisseur de 1 à 2 mm. Dans une section représentative (normalement la troisième) excisez le ventricule droit et cassez geler le ventricule gauche. Cet échantillon peut être utilisé pour des analyses biochimiques.
4. Immerger les sections restantes dans le chlorure de 5%3,5-triphenyl-tetrazolium fraîchement préparé dans le pH salin tampon commercial 7.4 pendant 10 min à 37 oC. Les tissus viables sont de couleur brique rouge.
5. Laver deux fois avec un pH salin tampon de phosphate 7,4 et fixer avec 10% de formaline à 4 oC pendant la nuit. Laver deux fois avec du pH salin tamponné par phosphate 7,4 et garder chaque tranche immergée.
6. Retirez l'excès de liquide et le poids de chaque diapositive. Prenez des images couleur numériques des deux côtés. Utilisez des analyses planimétriques pour calculer la taille de l'infarctus pour cent et corriger le poids ventriculaire total et de tranche. La coloration s'estompe avec le temps. Les photos doivent être prises dès que possible.

6. Analyses de données

1. Enregistrez toutes les données de pression dans un nouveau fichier par animal.
2. Pour les analyses de pression, sélectionnez au moins 200 cycles de pression par point de temps. Les analyses peuvent être effectuées hors ligne (après l'achèvement de l'expérience) à l'aide de logiciels dédiés (c.-à-d. LabChart). Les paramètres cardiovasculaires communs disponibles sont les suivants : pression générée maximale, pression diastolique de fin, 'dP/dt' (pente la plus raide pendant le coup ascendant de la courbe de pression, indicateur de la capacité contractile ventriculaire), -dP/dt (pente la plus raide pendant le de la courbe de pression, un indicateur de la capacité de relaxation ventriculaire) entre autres.
   REMARQUE : Pour les analyses de troponine, une augmentation de la libération de troponine à la reperfusion est prévue. Après 1 h de réperfusion dans le système EVHP, les niveaux de troponine peuvent diminuer à la ligne de base, soulignant la nécessité d'un timing soigneux dans la collecte et la manipulation de ces échantillons.

Résultats

Après l'extubation, la pression artérielle diminue rapidement dans un modèle prévisible (Figure 3). Le temps de mort prévu est inférieur à 5 min.

La figure 4 montre une courbe moyenne de pression/temps au début du reconditionnement après 0, 10 et 15 min de WIT. La fonction contractile s'améliorera avec le temps. L'utilisation de courtes périodes de SRT permettra à la passation de pouvoir de revenir à la normale, et les do...

Discussion

Le protocole présenté ici introduit un modèle simple, pratique et polyvalent de DCD cardiaque, offrant la possibilité d'évaluer la récupération fonctionnelle cardiaque, les dommages de tissu et l'utilisation des agents cardioprotecteurs de poteau-conditionnement pour améliorer le rétablissement du donneur cœurs autrement jetés pour la transplantation. Les systèmes de perfusion cardiaque ex vivo (EVHP) ont été optimisés pour fournir une plate-forme pour évaluer la fonction cardiaque et offrir une occasion ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag	Baxter		Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter	Jelco	4098	To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Milipore-Sigma	T8877	Vital coloration
22 G 1" I.V catheter	BD	383532	I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr	Skalar	50-3147	Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4"	Skalar	22-9027	Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp	ADinstruments	FE221	Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride	Milipore-Sigma	C1016	CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose	Milipore-Sigma	G8270	D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADinstruments	MLAC06	Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock)	ADinstruments	MLT0670	Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS	Gibco	14190-144	Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4"	Skalar	66-2740	Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Milipore-Sigma	HT501128	Fixative solution
Heating Pad	Sunbean	756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL	Sandoz		For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0%	Fisher scientific	A144-500	Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine	Bimeda		Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart	ADinstruments		Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon	Radnoti	170404	In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution	AstraZeneca		Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS	ACP Chemicals	M-0460	MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor	Radnoti	159905	Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker	Biotronik	Reliaty	Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter	Fisher scientific	AE150
Physiological monitor	Kent Scientific	Physiosuite	For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A	Baxter		Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride	Milipore-Sigma	P4504	KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml	Hospira		Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph	ADinstruments		Electronic polygraph
Silk 2-0	Ethicon	A305H	Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0	Ethicon	A302H	Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation	Hallowell EMC	000A2770	Small animal ventilator
Sodium bicarbonate	Milipore-Sigma	S5761	NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride	Milipore-Sigma	S7653	NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets	ACP chemicals	S3700	Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic	Milipore-Sigma	S0751	NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2"	Skalar	22-1240	Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades	Thomas scientific	6727C18	Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8"	CardinalHealth	8881511235	For heparin injection
Veterinary General Surgery Set	Skalar	98-1275	Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set	Skalar	98-1311	Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system	Radnoti	120101BEZ	Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine	Bayer		Sedative. 20 mg/mL