Modelo pré-clínico de doação cardíaca após a morte circulatória

Resumo

Este protocolo apresenta uma abordagem simples e flexível para a avaliação de novos agentes condicionantes ou estratégias para aumentar a viabilidade da doação cardíaca após a morte circulatória.

Resumo

A demanda de transplante cardíaco está em ascensão; no entanto, a disponibilidade de órgãos é limitada devido a uma escassez de doadores adequados. A doação de órgãos após a morte circulatória (DCD) é uma solução para abordar essa disponibilidade limitada, mas devido a um período de isquemia morna prolongada e ao risco de lesão tecidual, seu uso rotineiro no transplante cardíaco raramente é observado. Neste manuscrito nós fornecemos um protocolo detalhado que imita pròxima práticas clínicas atuais no contexto de DCD com monitoração contínua da função de coração, permitindo a avaliação de estratégias e de intervenções cardioprotetores novas para diminuir lesão de isquemia-reperfusão.

Neste modelo, o protocolo de DCD é iniciado em ratos de Lewis anestesiados parando a ventilação para induzir a morte circulatória. Quando a pressão arterial sistólica cai abaixo de 30 mmHg, o tempo de isquemia quente é iniciado. Após um período isquêmico morno pré-ajustado, os corações são liberados com uma solução cardioplégica normotérmica, adquiridos, e montados em um sistema ex vivo da perfusão do coração de Langendorff. Após 10 min de reperfusão inicial e estabilização, o condicionamento cardíaco é continuamente avaliado por 60 min usando a monitorização da pressão intraventricular. Um ferimento de coração é avaliado medindo o troponina cardíaco T e o tamanho do enfarte é quantificado pela mancha histológica. O tempo de isquemia quente pode ser modulado e adaptado para desenvolver a quantidade desejada de danos estruturais e funcionais. Este protocolo simples permite a avaliação de diferentes estratégias de condicionamento cardioprotetor introduzidas no momento da cardioplegia, reperfusão inicial e/ou durante a perfusão ex vivo. Os achados obtidos nesse protocolo podem ser reproduzidos em grandes modelos, facilitando a tradução clínica.

Introdução

A transplantação contínua do órgão no transplante geral e cardíaco, em particular, está na ascensão Worldwide^1,2. O método padrão de suprimento de órgãos é a doação após a morte encefálica (DBD). Dado os critérios estritos da inclusão de DBD, menos de 40% dos corações oferecidos são aceitados³, limitando desse modo a oferta frente à demanda crescente e estendendo a lista de espera do órgão. Para abordar esse problema, o uso de órgãos doados após a morte circulatória (DCD) é considerado uma solução potencial⁴.

No entanto, em doadores de DCD, uma fase agonal após a retirada do cuidado e um período de isquemia morna desprotegida antes da ressuscitação são inevitáveis⁵. A lesão potencial do órgão após a morte circulatória pode conduzir à deficiência orgânica do órgão, explicando a relutância para adotar rotineiramente transplantações do coração de DCD. É relatado que apenas 4 centros utilizam o DCD Hearts clinicamente, com critérios rigorosos que incluem tempos de isquemia quente muito curtos e jovens doadores sem patologias crônicas^6,7. Por razões éticas e jurídicas, intervenções cardioprotetoras limitadas ou não podem ser aplicadas em doadores antes da morte circulatória^5,8,9. Assim, qualquer mitigação para aliviar a lesão de isquemia-reperfusão (IR) é limitada a terapias cardioprotetoras iniciadas durante a reperfusão precoce com soluções cardioplémicas, e não permitem uma avaliação funcional adequada. A perfusão cardíaca ex vivo (evhp) e o recondicionamento do coração de DCD utilizando plataformas dedicadas têm sido propostos como uma solução alternativa eestudados por vários estudiosos^10,11,12,13 . A EVHP oferece uma oportunidade única de entregar agentes de pós-condicionamento aos corações DCD para melhorar a recuperação funcional. No entanto, para uma tradução clínica eficiente, muitas questões técnicas e práticas continuam a ser abordadas, e isso é agravado pela falta de consenso sobre uma gama de perfusão e critérios funcionais para determinar a transplantabilidade^6, a ⁸.

Nisto nós relatamos o desenvolvimento de um protocolo pequeno animal pré-clínico reprodutível de DCD combinado com um sistema ex vivo da perfusão do coração que possa ser usado para investigar o borne-condicionamento do órgão iniciado na altura da colheita, durante o reperfusion inicial, e /ou em todo o EVHP.

Protocolo

Todos os cuidados com os animais e protocolos experimentais conformados com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais do centro de pesquisa centro hospitalier de l' Université de Montréal.

1. preparações preliminares

1. Ligar o banho de água para aquecer o sistema de parto cardioplegia (Figura 1a) e o sistema de perfusão de Langendorff ex vivo (Figura 1b). Ajuste a temperatura da água a 38,5 ° c para uma temperatura da solução de 37 ° c. As fotografias da instalação podem ser vistas na Figura 1a suplementar, B.
2. Prepare 1 L de solução cardioplégico. Adicionar 1 mL de cloridrato de lidocaína a 2% e 10 mL de KCl de 2 mM (concentração final 20 mM) a 1 L de plasma-Lyte A (140 mM na, 5 mM K, 1,5 mM mg, 98 mM CL, 27 mM acetato, 23 mM gluconato). PH correto a 7,4 usando HCl 6 N.
   Atenção: Este modelo é altamente sensível ao pH. Uma correção de pH errada (fora do intervalo fisiológico 7.3-7.4) ou soluções de pH instável pode comprometer o experimento ou fornecer dados não confiáveis.
3. Prepare 4 litros de solução de Krebs (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH₂po₄, 1,25 mm CAcl₂, 1 mm MgCl₂∙ 6h₂O, 5,5 mm D-glucose, 25 mm NaHCO₃). As massas de substrato por 1 L de solução devem ser as seguintes: 6,1 g de NaCl, 0,3355 g de KCl, 0,2035 g de MgCl₂∙ 6h₂O, 0,192 g de NaH₂po₄, 0,1387 g de CAcl₂, 0,99 g de D-glucose, 2,1 g de NaHCO₃ , volume final de 1 L em água desionizada ultrapura. Adicione o NaHCO _{3. º} último a evitar a precipitação. Filtre a solução usando um filtro de 0,22 μm e armazene durante a noite. Corrija o pH para 7,4 quando a solução está em 37 ° c e bolha com 5% CO₂/95% o₂.
4. Encha o circuito de Langendorff com a solução de Krebs e comece a bomba do sistema. Certifique-se de que nenhuma bolha é deixada dentro da tubulação. Ajuste a velocidade da bomba peristáltica para 80 rpm (equivalente a 1 L/min). Usando a torneira de batente em dois sentidos, ajuste o fluxo para manter um gotejamento lento através da cânula aórtica até que o coração esteja Unido (Figura 1b). Mantenha uma amostra de solução de Krebs (15 mL) em um tubo cónico de 50 mL no gelo para o transporte do coração.
5. Encha o sistema de parto cardioplegia com a solução cardioplégica. Uma vez que as bolhas são removidas, mude o circuito para soro fisiológico usando uma torneira de batente de 3 vias (Figura 1a). Ajuste a taxa de gotejamento. O soro fisiológico deve ser lentamente pingando da ponta do cateter para garantir que nenhuma solução cardioplégico seja injetada antes da morte do animal.

2. preparação animal

1. Utilizando uma câmara de inalação, induzir anestesia com isoflurano 3%. Uma vez que o animal não responde, realize uma injeção intraperitoneal de cetamina (75 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) ou anestésico similarmente adequado, seguindo os regulamentos locais, para manter a anestesia para o resto do procedimento. Assegure a profundidade da anestesia por nenhuma reação à pitada do dedo do pé e ao reflexo palpebral.
2. Intubate o animal utilizando um cateter intravenoso de 14 G e 2 polegadas. Comece a ventilação em 50 respirs por o minuto, com pressão da via aérea limitada a 20 cmH₂O.
3. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento definido como "médio" e cubra com uma almofada absorvente para manter a temperatura do corpo. Inserir uma sonda de temperatura retal e anexar um sensor de oxímetro de pulso transdérmico a um dos pés. Manter a temperatura retal a 37 ° c durante todo o procedimento.
4. Acesso vascular
   1. Faça uma incisão na pele de 3 a 4 cm no pescoço usando uma tesoura. Usando a ponta sem corte curvada scissors, Blunt dissecar o tecido subcutaneous e expor o músculo esterno direito. Usando pinça não traumática, mova o músculo lateralmente até que a artéria carótida direita (pulsante), veia jugular (não pulsante) e o nervo vago (branco) sejam identificados visualmente (Figura 2a suplementar). Separe com cuidado o nervo vago da artéria carotídea usando a ponta sem corte curvada tesouras.
   2. Injete heparina (2.000 UI/kg) através da veia jugular direita. Aplique pressão no local da injecção após a retração da agulha para evitar fugas de sangue.
   3. Usando fórceps curvo, passe duas 5-0 suturas de seda ao redor da artéria carótida. Prenda firmemente uma sutura longe do ponto de origem para obstruir a artéria carotídea no aspecto superior da artéria exposta. Mantenha a sutura proximal desamarrada. A tração da sutura proximal será utilizada para o controle do sangramento na próxima etapa (Figura 2b suplementar). A distância entre as suturas deve ser de aproximadamente 2 cm.
   4. Usando um estereomicroscópio para melhor visualização, faça com cuidado uma incisão de 1 mm com tesouras de microcirurgia sobre a parede anterior da artéria carótida. Insira um cateter intravenoso fechado de 22 G, 1 polegada em direção ao arco aórtico. O cateter é conectado a uma torneira de parada de 2 vias, permitindo a conexão a um transdutor de pressão para monitoramento constante, com a possibilidade de injetar soro fisiológico ou cardioplegia através do sistema de parto cardioplegia (Figura 1a).

3. iniciação do protocolo de doação cardíaca após morte circulatória (DCD)

Nota: Uma linha do tempo completa do protocolo pode ser vista na Figura 2.

1. Re-Asses a profundidade anestésica realizando uma pitada do dedo do pé e avaliando o reflexo palpebral. Se for observada reação, realize uma injeção intraperitoneal de cetamina (37,5 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg). Reavaliar após 5 minutos. Se nenhuma resposta for observada, continue o procedimento. A braçadeira traqueal só deve ser realizada em animais adequadamente anestesiados.
2. Desligue o ventilador e extubato o animal. Usando o fórceps do mosquito, prenda a traquéia. Este momento é considerado como o início da fase agonal. Comece a contar o tempo de isquemia funcional quente (WIT) quando a pressão arterial sistólica máxima cair abaixo de 30 mmHg, ou se aparecer assistolia ou fibrilação ventricular, o que vier primeiro (Figura 3).
   Nota: A extensão de dano deve ser proporcional ao WIT. Experimentos são necessários para otimizar o tempo de WIT de acordo com o anestésico usado, estirpe animal, sexo e peso escolhidos. Nos animais controle, imediatamente após o acesso vascular carotídeo é fixado, a cardioplegia é injetada e o coração é suprido conforme descrito na próxima etapa (Figura 2). O início da perfusão com cardioplegia é considerado como o fim da sagacidade.
3. No final da WIT, realize uma esternotomia medial. Mantenha o tórax aberto usando um retractor de ALM. Usando tesouras, abra a veia cava inferior e ambos os átrios para evitar distensão miocárdica ou recirculação cardioplegia (figura complementar 3). Aperte a aorta acima do diafragma. Através da artéria carotídea previamente cateterizada, inutilizar a solução cardioplégica a uma pressão constante de 60 mmHg por 5 min usando o sistema de parto cardioplegia. A pressão da infusão pode ser modificada alterando a altura da coluna de água.
4. Ao término da infusão cardioplégico, dissecar a aorta proximal ascendente da artéria pulmonar utilizando fórceps curvo (figura 4a suplementar). Corte a aorta distal à artéria subclávia esquerda. Assegure um comprimento aórtico de pelo menos 0,5 cm para o canulação para o instrumento de Langendorff.
5. Segurando o coração da aorta, complete a cardiectomia, separando o coração das veias pulmonares e outras estruturas torácicas (Figura 4B suplementar). Ràpida, mergulhe o coração dentro à solução Ice-Cold de Krebs para o transporte rápido ao sistema ex vivo. Mantenha a dissecção e os tempos de transporte o mais curtos possível (5 min).

4. sistema de perfusão cardíaca ex vivo (EVHP) e avaliação funcional cardíaca

1. Abra o lúmen aórtico usando fórceps. Deair a aorta enchendo o lúmen com a solução pingando de Krebs para evitar forçar bolhas dentro aos vasos coronarianos. Abaixe a cânula na aorta, tomando cuidado para não passar a raiz aórtica ou danificar os folhetos da valva aórtica. Fixe a configuração com um grampo pequeno.
2. Usando o stopcock de 2 vias, aumente o fluxo para procurar possíveis vazamentos na aorta. Se nenhum for detectado, Fixe firmemente a aorta à cânula usando uma sutura de seda 2-0. Abra totalmente o fluxo para a cânula. Manter a pressão aórtica a uma pressão fisiológica de 60-70 mmHg (ajustada alterando a altura do sistema). Neste momento inicia-se o tempo inicial de reperfusão e estabilização. A pressão aórtica pode ser modificada de acordo com o plano experimental do investigador.
3. Gire o coração para que a base do coração (átrios) esteja voltada para o sensor de pressão. Amplie a abertura atrial ventricular esquerda dissecando as veias pulmonaas. Insira o balão de látex conectado a um sensor de pressão. Certifique-se de que o balão está totalmente posicionado dentro do ventrículo por inspeção visual. Encha lentamente o balão com soro fisiológico até que a pressão diastólica final (EDP) esteja definida para 15 mmHg. Ajuste conforme necessário para manter a EDP constante (EDP fisiológico pré-determinado). O EDP pode ser ajustado de acordo com os objetivos experimentais de cada investigador.
4. Insira o eletrodo de estimulação na face anterior do coração (trato de saída do ventrículo direito). Evite perfurar os vasos coronarianos. Uma vez que o espancamento espontâneo é observado, iniciar a estimulação em 300 batimentos por min. a tensão requerida pode variar entre experimentos e cepas de ratos.
5. Após 10 min de estabilização, iniciar a gravação de medição de pressão intraventricular contínua. Este momento é considerado o início da fase de recondicionamento e avaliação (tempo 0) que durará por 1 h (Figura 2). O recondicionamento pode ser prolongado, mas uma diminuição dependente do tempo na contratilidade é esperada em todos os corações.
6. No início do recondicionamento, coletar efluente cardíaco caindo das veias cardíacas por 5 min para avaliação de fluxo coronariano basal e análises bioquímicas. Para troponina T repetir a cada 15 min (vezes 0, 15, 30, 45 e 60 min). Para outras análises, é necessária a individualização dos tempos de coleta (Figura 2).

5. fim da experiência

1. Retire o coração do aparelho de Langendorff.
2. Usando uma lâmina de aço carbono de alta reta (lâmina de micrótomo ou similar), retire a base do coração (incluindo aorta e artéria pulmonar).
3. Com o ventrículo direito virado para baixo, corte as lâminas ventriculares transversais de 1-2 mm de espessura. Em uma seção representativa (normalmente a terceira), o ventrículo direito e a pressão congelam o ventrículo esquerdo. Esta amostra pode ser usada para análises bioquímicas.
4. Submerge as seções restantes dentro ao cloreto recentemente preparado de 5% 2, 3, 5-triphenyl-Tetrazolium no pH fisiológico 7,4 do tampão de fosfato comercial para 10 minutos em 37 ° c. Os tecidos viáveis são tijolos vermelhos coloridos.
5. Lave duas vezes com tampão fosfato soro fisiológico pH 7,4 e fixar com formalina 10% a 4 ° c durante a noite. Lave duas vezes com pH salina tamponado fosfato 7,4 e mantenha cada fatia submersa.
6. Retire o excesso de líquido e peso cada slide. Tirar imagens de cor digital de ambos os lados. Use análises planimetric para calcular o tamanho do infarto dos por cento e corrija para a fatia e o peso ventricular total. A coloração desvanece-se com o tempo. As fotos devem ser tiradas o mais rápido possível.

6. análise de dados

1. Salve todos os dados de pressão em um novo arquivo por animal.
2. Para análises de pressão, selecione pelo menos 200 ciclos de pressão por pontos de tempo. As análises podem ser executadas off-line (após a conclusão do experimento) usando software dedicado (ou seja, LabChart). Os parâmetros cardiovasculares comuns disponíveis incluem: pressão máxima gerada, pressão diastólica final, + DP/DT (inclinação mais íngreme durante o movimento ascendente da curva de pressão, um indicador da habilidade contrátil ventricular),-DP/DT (inclinação mais íngreme durante a diminuição da curva de pressão, um indicador de capacidade de relaxamento ventricular) entre outros.
   Nota: para análises de troponina, espera-se um aumento na liberação de troponina na reperfusão. Após 1 h de reperfusão no sistema EVHP, os níveis de troponina podem diminuir para a linha de base, salientando a necessidade de um tempo cuidadoso na coleta e manuseio dessas amostras.

Resultados

Após a extubação, a pressão arterial cai rapidamente em um padrão previsível (Figura 3). O tempo esperado até a morte é inferior a 5 min.

A Figura 4 mostra uma curva média de pressão/tempo no início do recondicionamento após 0, 10 e 15 min de Wit. Contractile função irá melhorar ao longo do tempo. O uso de curtos períodos de sagacidade permitirá a contratilidade voltar ao normal, e os danos morfológicos não serão d...

Discussão

O protocolo apresentado aqui apresenta um modelo simples, conveniente e versátil de DCD cardíaco, oferecendo a oportunidade de avaliar a recuperação funcional cardíaca, dano tecidual e o uso de agentes cardioprotetores pós-condicionamento para melhorar a recuperação do doador os corações rejeitados de outra forma para transplante. Sistemas de perfusão cardíaca ex vivo (EVHP) foram otimizados para fornecer uma plataforma para avaliar a função cardíaca e oferecer uma oportunidade única de entregar e testar ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag	Baxter		Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter	Jelco	4098	To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Milipore-Sigma	T8877	Vital coloration
22 G 1" I.V catheter	BD	383532	I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr	Skalar	50-3147	Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4"	Skalar	22-9027	Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp	ADinstruments	FE221	Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride	Milipore-Sigma	C1016	CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose	Milipore-Sigma	G8270	D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADinstruments	MLAC06	Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock)	ADinstruments	MLT0670	Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS	Gibco	14190-144	Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4"	Skalar	66-2740	Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Milipore-Sigma	HT501128	Fixative solution
Heating Pad	Sunbean	756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL	Sandoz		For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0%	Fisher scientific	A144-500	Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine	Bimeda		Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart	ADinstruments		Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon	Radnoti	170404	In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution	AstraZeneca		Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS	ACP Chemicals	M-0460	MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor	Radnoti	159905	Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker	Biotronik	Reliaty	Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter	Fisher scientific	AE150
Physiological monitor	Kent Scientific	Physiosuite	For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A	Baxter		Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride	Milipore-Sigma	P4504	KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml	Hospira		Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph	ADinstruments		Electronic polygraph
Silk 2-0	Ethicon	A305H	Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0	Ethicon	A302H	Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation	Hallowell EMC	000A2770	Small animal ventilator
Sodium bicarbonate	Milipore-Sigma	S5761	NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride	Milipore-Sigma	S7653	NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets	ACP chemicals	S3700	Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic	Milipore-Sigma	S0751	NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2"	Skalar	22-1240	Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades	Thomas scientific	6727C18	Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8"	CardinalHealth	8881511235	For heparin injection
Veterinary General Surgery Set	Skalar	98-1275	Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set	Skalar	98-1311	Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system	Radnoti	120101BEZ	Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine	Bayer		Sedative. 20 mg/mL