JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

Abstract

מלחי אינוזיטול ופוספוליזידים מווסת מספר תהליכים סלולריים ב-eukaryotes, כולל ביטוי גנטי, סחר בסמים, התמרה של אותות, חילוף חומרים, ופיתוח. מטבוליטים אלה לבצע פעילות תקינה זו על ידי איגוד לחלבונים, ובכך שינוי היווצרות חלבון, פעילות קטליטי, ו/או אינטראקציות. השיטה המתוארת כאן משתמשת בכרומטוגרפיה של זיקה בשילוב עם הספקטרומטר המסה או הכתמים המערביים כדי לזהות חלבונים הפועלים באינטראקציה עם מלחי אינוזיטול או פוספופנוסיידים. הפוספטים inositol או פוספיונוסיידים הם כימית מתויג עם biotin, אשר נלכד אז באמצעות streptavidin מצועם מעלה או חרוזים מגנטיים. חלבונים מבודדים על ידי הזיקה שלהם של קשירה המטולוליט, ולאחר מכן הודללו וזוהו על ידי ספקטרומטר המסה או בלוק המערבי. השיטה יש זרימת עבודה פשוטה רגיש, לא רדיואקטיבי, ליפומי-חינם, להתאמה אישית, תמיכה בניתוח של חלבון ואינטראקציה מטבלייט עם דיוק. גישה זו יכולה לשמש ללא תווית או בחומצה אמינית מתויג כמותית שיטות המסה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-מטבוליט בדגימות ביולוגיות מורכבות או באמצעות חלבונים מטוהרים. פרוטוקול זה מותאם במיוחד לניתוח של חלבונים מטריאנוסומה ברוסייבי, אך ניתן להתאים אותו לטפילים פרוטוזוקיים, שמרים או מהיונקים.

Introduction

אינוסיטול פוספטים (IPs) ו פוספהונוסידים (פיס) לשחק תפקיד מרכזי בביולוגיה איקריוטים באמצעות התקנה של תהליכים סלולריים כגון השליטה בביטוי הגנים1,2,3, שלפוחית הסחר 4, שינוי האותות של5,6, מטבוליזם7,8,9, ופיתוח8,10. הפונקציה התקינה של מטבוליטים אלה תוצאות מהיכולת שלהם אינטראקציה עם חלבונים ובכך לווסת את תפקוד החלבון. עם כריכה על ידי חלבונים, IPs ו-פיס עשויים לשנות את היווצרות חלבון11, פעילות קטליטי12, או אינטראקציות13 ומכאן להשפיע על הפונקציה התאית. שב ס ו-פיס מופצים בתאי משנה מרובים, כגון: גרעין2,3,14,15, אנפלזמית ברשת16,17, פלזמה ממברנה1 ו ציטוסול18, המשויכים לחלבונים3,19 או עם rnas20.

המחשוף של הממברנה המשויכת PI (4, 5) P2 ידי פוספוליפדאז C תוצאות בשחרור של Ins (1, 4, 5) P3, אשר יכול להיות זרחנים או deated על ידי הקיסים IP ו פוספאטטיות, בהתאמה. שב ס מולקולות מסיסים שיכולות לאגד חלבונים ולהפעיל פונקציות רגולטוריות. לדוגמה, Ins (1, 4, 5) P3 ב מטזוזה יכול לשמש כשליח השני על ידי מחייב IP3 קולטנים, אשר מעורר שינויים בקולטן ובכך לשחרר של Ca2 + מן חנויות תאיים11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 נקשר לקומפלקס הימרחליקלז ומסדיר הרכבה ופעילות של מורכבות חלבון13. דוגמאות אחרות של הפונקציה התקינה של IPs כוללות את השליטה של ארגון כרומטין21, rna תחבורה22,23, RNA עריכה24, ושעתוק1,2,3 . לעומת זאת, הפיס משויך לעתים קרובות לגיוס חלבונים לקרום הפלזמה או לקרומים האורגונל25. עם זאת, המאפיין המתעוררים של פיס הוא היכולת לקשר עם חלבונים בסביבה לא קרומי3,15,19,26. זהו המקרה של הגורם לקולטן גרעינית, אשר פונקציה שליטה ההמרה מוסדר על ידי PI (3, 4, 5) P319, ו-פולי פולימראז אשר פעילות אנזימטית מוסדר על ידי הגרעין PI (4, 5) P226. תפקיד רגולטורי עבור IPs ו-פיס הוצג באורגניזמים רבים כולל שמרים22,27, תאים מוחיים19,23, דרוסוהילה10 ותולעים28. המשמעות היא התפקיד של מטבוליטים אלה בטריאנוזומים, אשר התפצל מוקדם מן השושלת איקריוטית. מטבוליטים אלה לשחק תפקיד חיוני בטריאנוסומה ברוסייס1 בקרת שליטה,3, פיתוח8, ארגונית biogenesis ו חלבון התנועה 29,30 , מיכל בן 31 , 32, והם מעורבים גם פיתוח וזיהום של פתוגנים T. cruzi33,34,35, טוקסופלזמה36 ו פלמודיום מיכל 5 , 37. מכאן, הבנת התפקיד של IPs ו-הפיס בטריאנוזומים עשויים לסייע להבהיר פונקציה ביולוגית חדשה עבור מולקולות אלה ולזהות מטרות של סמים חדשניים.

הספציפיות של חלבון ו-IP או כריכת PI תלוי בתחומים של אינטראקציה חלבונים ואת המצב זירחון של אינוזיטול13,38, למרות אינטראקציות עם החלק השומנים של פיס גם מתרחשת19. מגוון של כתובות ה-Ip ו-פיס ושינוי שלהם מספק מנגנון הסלולר גמיש לשליטה בתפקוד החלבון אשר מושפע על ידי זמינות מטבוליזם ושפע, המצב של זירחון של inositol, וחלבון אהדה של אינטראקציה1,3,13,38. למרות כמה תחומים חלבונים מאופיינים היטב39,40,41, למשל, pleckstrin הומולוגיה תחום42 ו SPX (SYG1/Pho81/XPR1) תחומים43 ,44,45, כמה חלבונים אינטראקציה עם IPs או הפיס על ידי מנגנונים שאינם ידועים. לדוגמה, חלבון activator 1 (RAP1) של T. brucei חסר הקאנוני התחומים מחייב pi אבל אינטראקציה עם pi (3, 4, 5) P3 ושליטה שעתוק של גנים המעורבים וריאציה אנטי הגניים3. כרומטוגרפיה וניתוח הספקטרומטר ההמוני של החלבונים בעלי אינטראקציה של ip או pi מתוך טריאנומין, שמרים או תאי מיונקים זיהו מספר חלבונים ללא מחשבים מבוססי IP או pi-כריכה מסוג8,46, 47. הנתונים מציעים מחשבים נוספים שאינם מאופיינים בחלבון שתאגד לאותם מטבוליטים. מכאן, הזיהוי של חלבונים האינטראקציה עם IPs או הפיס עשוי לחשוף מנגנונים חדשניים של האינטראקציה חלבון-מטבוליט ופונקציות חדשות הרגולציה הסלולר עבור אלה מולקולות קטנות.

השיטה המתוארת כאן מעסיקה כרומטוגרפיה של אהדה בשילוב עם הדגמים המערביים או ספקטרומטר המסה כדי לזהות חלבונים הקושרים ל-IPs או לפיס. הוא משתמש ב-IPs biotinylated או ב-"פיס" המקושרים לstreptavidin בעלי מבטים לחרוזים או לחילופין, שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin-מצוייביים (איור 1). השיטה מספקת זרימת עבודה פשוטה רגישה, לא רדיואקטיבית, ליפומי-חינם, והיא מתאימה לזיהוי הכריכה של חלבונים מתאי ליטים או חלבונים מטוהרים3 (איור 2). ניתן להשתמש בשיטה ללא תווית8,46 או מצמידים לחומצות אמינו ממותגים בעלי שמות מספרים מבוססי חומצה אמימטריה47 כדי לזהות חלבונים של IP או PI-מחייב מדגימות ביולוגיות מורכבות. מכאן, שיטה זו היא חלופה לכמה שיטות זמין ללמוד את האינטראקציה של IPs או הפיס עם חלבונים סלולריים יסייע להבין את התפקוד הרגולטורי של מטבוליטים אלה בטריאנוזומים ואולי eukaryotes אחרים.

Protocol

1. ניתוח החלבונים של IP או PI-מחייב על ידי כרומטוגרפיה של אהדה ובלוק מערבי

  1. צמיחת תאים, לליזה וכרומטוגרפיה של זיקה
    1. הגדל תאים T. brucei לשלב באמצע היומן ולפקח על הכדאיות וצפיפות התא. סך של 5.0 x 107 תאים מספיק עבור שיטת מחייב אחת.
      1. עבור טפסים במחזור הדם, לגדול תאים בתקשורת HMI-9 שיושלם עם 10% סרום שור עוברי (FBS) ב 37 ° צ' ו 5% CO2. שמור על צפיפות תאים בין 8.0 x 105 כדי 1.6 x 106 תאים/mL.
        הערה: צפיפות גבוהה יותר מ-1.8 x 106 תאים/mL עלולה להשפיע על הכדאיות בתאים. זמן ההכפלה של T. brucei 427 הזנים גדל בתוך מבחנה הוא בין 5.5 ו 6.5 h.
      2. עבור צורות procyclic, לגדול תאים ב SDM-79 בינוני בתוספת 10% FBS ב 27 ° צ' ולשמור על צפיפות התא בין 1.0 x 107 ו 3.0 x 107 תאים/mL.
      3. עבור חלבונים מטוהרים (למשל, רקומביננטי חלבונים), לקחת 0.5 עד 1 μg של חלבון ולדלל ב 450 μL של מאגר מחייב (25 מ"מ HEPES, 150 mM הנאקל, 0.2% 4-לאיל פניאיל-פוליאתילן גליקול, pH 7.4). לשמור 5% חלבון מדולל (קלט) עבור ניתוח כתמי אבן מערבית. . המשך לשלב 1.1.7
    2. בתאי צנטריפוגה ב 1,600 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). . מחק את הסופרנטאנט
      הערה: ראה step 2.1.2 לקבלת מידע נוסף על צנטריפוגה של כמויות גדולות של תרבות.
    3. השעיית מחדש בעדינות את הגלולה ב 10 מ ל של פוספט מלוחים באגירה pH 7.4 שיושלם עם 6 מ"מ גלוקוז (PBS-G) ו מחומם מראש ב 37 ° צ' כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב 1,600 x g עבור 5 דקות ב RT. חזור על ההליך פעמיים.
    4. השהה את הגלולה ב-1 מ ל של PBS-G. ואז, להעביר את עוצמת הקול לצינור 1.5 mL ו צנטריפוגה ב 1,600 x g עבור 5 דקות. להיפטר supernatant.
      הערה: כדורי תא יכול להיות פלאש קפוא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב-80 ° c או חנקן נוזלי.
    5. השהה מחדש את הגלולה ב 0.5 mL של מאגר הליזה (25 מ"מ HEPES, 150 mM הנאקל, 1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol, pH 7.4) שיושלם עם מעכב 1.5 x המעכבי הקוקטייל ו-1x פוספאטאז מעכבי הקוקטייל (טבלת חומרים) טרום מקורר בקרח כדי . לסדר את התאים דגירה ליפוסט עבור 10 דקות מסתובבת ב 50 rpm ב 4 ° c.
      הערה: זהו שלב קריטי מכיוון שחלבונים עלולים להיפגם אם לא טופלו כמצוין. בדיקת שלמות חלבון ליפוסט על ידי נתרן dodecyl סולפט-פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS/PAGE) במידת הצורך.
      התראה: T-octylphenoxypolyethoxyethanol הוא רעיל יכול לגרום גירוי בעור ובעיניים. שימוש בכפפות, eyeshield והגנה faceshield.
    6. צנטריפוגה את הליפוסט ב 14,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. לאסוף את supernatant לתוך שפופרת חדש 1.5 mL לכריכה assays. שמור 5% מכלל הליפוסט הכולל (קלט) עבור ניתוח הכתמים המערביים. Supernatant מכיל חלבונים טפיל שחולצו עם מאגר לפירוק.
    7. לאסוף 50 μL של שב ס או הפיס מעלה מעלה חרוזים agarose (כלומר, 50 μL של שאיפה) או 50 μL של חרוזים של agarose, ו צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 1,000 x g. למחוק את supernatant ולהשעות מחדש ב 50 μL של מאגר מחייב כדי לבטג את החרוזים. השתמש בחרוזים שאינם מצובית כפקד. השתמש ב-IP/PI חרוזים עם תצורת פוספט שונים כולל צורות שאינן זרחמות כדי לשלוט על אינטראקציות לא ספציפיות.
    8. הוסף 50 μL של IP-או PI חרוזים ל-ליפוסט תא או חלבונים מטוהרים (כל 1 מ ל של חרוזים מכיל 10 nmol של מעלה שב ס או פיס). שמור על עוצמת הקול של מחרוזות IP או PI בתוך 10% מכלל הליפוסט הכולל ובמידת הצורך, כוונן את עוצמת התגובה של האיגוד עם מאגר האיגוד.
      1. לגבי התחרות, הוסיפו לתגובת האיגוד ריכוזים שונים של כתובות IPs או פיס (לדוגמה, 1-, 10-, 100-העודפים מתקפל לעומת ה-IP או PI-חרוזים).
    9. דגירה את התגובה עבור 1 h, או לילה, ב 4 ° c ו מסתובבת ב 50 rpm.
      הערה: כריכת תגובות עם חלבונים מטוהרים ניתן לעשות ב-RT בהתאם ליציבות החלבון. אם השימוש ב-IPs או ב-הפיס מעלה לביוטין להמשיך לשלב 1.1.9.1, אחרת המשך לשלב 1.1.10.
      1. הוסף 50 μL של streptavidin-מעלה מעלה חרוזים מגנטיים לתגובת איגוד ו דגירה עבור 1 h ב 4 ° c מסתובבת ב 50 סל ד.
    10. צנטריפוגה את התערובת עבור 1 דקות ב 1,000 x g ב 4 ° c. הסר את הסופרנטנט (זרימה) ושמור את הגלולה. שמרו 5% מתוך הסופרנטאנט לניתוח כתמי אבן מערבית.
      הערה: אם אתה משתמש בחרוזים מגנטיים, הסר את הסופרנטנים ובצע שוטף באמצעות מעמד מגנטי (centrifugations אינם נחוצים).
    11. הוסף 1 מ ל של מאגר כביסה (25 מ"מ HEPES, 300 מ"מ היאl, 0.2% 4-nonyl פניאיל-פוליאתילן גליקול, pH 7.4) ו להשעות את שרף על ידי הקשה או מתערבל את הצינור (לא להשתמש בפיפטה כי חרוזים יכולים לצרף לטיפים פיפטה). צנטריפוגה את התגובה עבור 1 דקות ב 1,000 x g ב 4 ° c ולהיפטר supernatant. חזור על ההליך עבור סך של חמש שטיפות.
      התראה: 4-nonyl פניאיל-פוליאתילן גליקול רעיל והוא יכול לגרום גירוי בעור ובעיניים. שימוש בכפפות, eyeshield והגנה faceshield.
    12. הוסף 50 μL של מאגר 2x Laemmli בתוספת עם 710 mM 2-mercaptoethanol לחרוזים ומערבבים על ידי הקשה או מערבולת כדי elute את החלבונים. חום ב 95 ° צ' עבור 5 דקות, לאחר מכן צנטריפוגה עבור 10,000 x g עבור 1 דקות ולאסוף את supernatant (מכיל חלבונים מתכווצים). לחילופין, חלבון elute חלבונים עם 8 M שתנן/100 מילימטר גליצין pH 2.9 כדי להימנע משימוש SDS. הקפא את ההקפאה ב-80 ° c, אחרת המשיכו לניתוח כתמי האבן המערביים.
      התראה: 2-mercaptoethanol הוא רעיל ועלול לגרום עור, עיניים וגירויים בדרכי הנשימה. השתמש בכפפות ועבוד בשכונה הכימית.
  2. אנליזה בלופית מערבית
    1. מערבבים 15 μL של קלט (משלב 1.1.6) או זרימה-דרך (משלב 1.1.10) דגימות עם 5 μL של מאגר 4x Laemmli. כניסת חום ודגימות זרימה במשך 5 דקות ב 95 ° c. עבור דגימות משתמט 8 מ ' אוריאה/100 מ"מ גליצין pH 2.9, מערבבים 15 μL של הללויה עם 5 μL של מאגר 4x Laemmli, וחום עבור 5 דקות ב 95 ° c.
      הערה: שלב זה אינו הכרחי עבור דגימות המודערות במאגר 2x Laemmli.
    2. טעינת בארות של 4-20% SDS/דף ג ' ל עם 2.5 μL של קלט, 2.5 μL זרימה-through, ו 20 μL של דגימות משחרלי, ולטעון את סולם החלבון לפי המלצת היצרן.
      הערה: בחר ג'ל% בהתאם למשקל המולקולרי של חלבון הריבית.
    3. הפעל SDS/PAGE ב 150 V עבור 30-45 דקות במאגר פועל, או עד הצבע הכחול של מאגר Laemmli הוא בסוף ג'ל.
      הערה: זמן ההפעלה עשוי להשתנות בהתאם לציוד המעבדה.
    4. הסירו את הג מלוחות הזכוכית (או הפלסטיק) והשתזפו במאגר העברה למשך 15 דקות.
    5. העבר את החלבונים כדי polyvinylidene difluoride (PVDF) קרום או ניטרוצלולוזה קרום. השתזפו בקרומים ובנייר סינון 3 מ"מ במאגר ההעברות. להרכיב סנדוויץ ' עם שלושה גיליונות של נייר סינון, ניטרוצלולוזה קרום PVDF, ג'ל, ו שלושה גיליונות נוספים של נייר סינון. ודא שאין בועות אוויר לכודים בכריך. השתמש רולר כדי להסיר בועות במידת הצורך. הגדר את הקרום על הקתודה ועל הג בצד האנודה של הקלטת.
      הערה: בדוק את הוראות יצרן הממברנה לקבלת מידע על הפעלת קרום או הכנה לכתם.
    6. הצב את הקלטת המכילה את הכריך במיכל ההעברות עם מאגר העברה. מניחים את המיכל בדלי קרח או ב -4 ° צ' (למשל, בחדר הקריר). העברת חלבונים ב 100 V עבור 1 h (הנוכחי משתנה בין 200-400 mA). לחלופין, העבירו לילה בזרם קבוע של 15 מא ' בשעה 4 ° c.
    7. הסר את הקרום מתוך הקלטת. מודלת את הקרום ב 6% חלב יבש ללא שומן מדולל PBS עם 0.05% של polysorbate 20 (PBS-T), או פתרון חסימה תואמת, עבור 1 h ב RT כדי לחסום את הקרום.
      הערה: לפני חסימת הקרום, ניתן לבדוק את איכות ההעברה באמצעות הכתם של פוננסו. הרפידת את הקרום במשך 1 דקות ב-15 מ ל של פוננסו S, שטפו במים ודמיינו להקות.
    8. להסיר את הפתרון חסימה מודלת את הקרום עבור 1 h ב RT עם 50 rpm סיבוב בנוגדנים העיקרי מדולל ב 6% חלב יבש שומן מדולל ב-PBS-T. לחילופין, ממברנה דגירה לילה ב 4 ° צ' עם סיבוב 50 rpm.
      הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לאיכות הנוגדנים; עם זאת, רוב הנוגדנים יעבדו עם 1-3 incubations h ב-RT. בצע את ההמלצה של היצרן על הריכוז נוגדנים או דילול.
    9. לשטוף את האבן על ידי דגירה את הקרום ב-PBS-T עבור 5 דקות עם 50 rpm סיבוב ב RT. חזור על ההליך 3-5 פעמים. ניתן לקבל עוד שוטפים בהתאם לאיכות הנוגדנים.
    10. הממברנה הקרום בחזרת peroxidase (HRP)-מצועם נוגדנים משנית עבור 1 h ב RT ב 6% חלב יבש ללא שומן מדולל PBS-T עם 50 rpm סיבוב.
      הערה: עקוב אחר המלצת היצרן לגבי הריכוז או הדילול של נוגדנים.
    11. שטוף את האבן החשופה כפי שמצוין בשלב 1.2.9.
    12. הוסיפו את המצע הכימי. כדי לכסות את הקרום הסר את עודפי המצע ואת הדגירה עבור 5 דקות ב-RT בחושך.
      הערה: בדוק את הוראות היצרן להמלצות על הריאגנטים הכימי.
    13. לכוד את אות הכמימיננטאנאת. בעזרת האימגר המבוסס על מצלמה לחילופין, השתמש בסרט רנטגן כדי ללכוד את האות הכימי.

2. ניתוח מחייב החלבונים באמצעות כרומטוגרפיה של אהדה וספקטרומטר מסה

  1. צמיחת תאים, לליזה וכרומטוגרפיה של זיקה
    1. הגדל תאים T. brucei לשלב באמצע היומן ולפקח על הכדאיות וצפיפות התא.
      הערה: סך של 1.0 x 10 תאים מספיק עבור שני מחייב כריכה. שימוש בפחות תאים מאשר המצוין כאן עלול להשפיע על איתור חלבונים שפע נמוך על ידי ספקטרומטר מסה.
      1. עבור הטפסים במחזור הדם של T. brucei , לגדול תאים בשלב באמצע יומן (8.0 x 105-1.6 x 106 תאים/mL) ב hmi-9 מדיה בתוספת 10% fbs ב 37 ° צ' ו עם 5% CO2. עבור 427 זן, 5 L של התרבות תניב 0.5-1.0 x 1010 תאים. נטר את צמיחת התאים כדי למנוע צפיפות גבוהה יותר מ-1.8 x 106 תאים/mL אשר עשויים להשפיע על הכדאיות של התא. שמור את נפח התרבות הסלולרית ל-1/10 של נפח הבקבוקון; אחרת, שיעור הצמיחה של התאים יושפעו עקב האנטנה המסכנה.
        הערה: למתח 427 יש זמן הכפלה של 5.5-6.5 h.
      2. עבור צורות procyclic, לגדול תאים ב SDM-79 בינוני בתוספת 10% FBS ב 27 ° צ' ולשמור על צפיפות התא בין 1.0 x 107 ו 3.0 x 107 תאים/mL. 500 מ ל של התרבות תניב 0.5-1.5 x 1010 תאים.
    2. צנטריפוגה את התאים ב 1,600 x g עבור 15 דקות ב RT. להשליך את supernatant ולהשעות את הגלולה ב 200 ML של PBS-g מחומם מראש ב 37 ° c. השימוש עגול התחתון צינורות צנטריפוגה (טבלה של חומרים) כי T. brucei מחזור הדם טופס כדורי מופרע בקלות כאשר משתמשים ברוטור צנטריפוגה בזוית קבועה. צנטריפוגה את התאים שוב ב 1,600 x g עבור 5 דקות ב RT.
    3. והשהה מחדש את הגלולה. ב -10 מ ל של PBS-ג'י צנטריפוגה את התאים ב 1,600 x g עבור 5 דקות ב RT. חזור על ההליך ולאחר השטיפה הסופית, מחק את הסופרנטאנט.
      הערה: כדורי עשוי להיות פלאש קפוא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב-80 ° c או חנקן נוזלי.
    4. השהה מחדש את הגלולה בתא 5 מ ל של מאגר הליזה לפני מקורר בקרח ושיושלם עם מעכב 1.5 x הפרוטאז מעכבי ו-1x פוספאטאז מעכבי קוקטייל (טבלת חומרים). מודטה הליפוסט עבור 10 דקות ב 4 ° c מסתובבת ב 50 סל ד.
    5. צנטריפוגה את הליפוסט ב 10,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. לאסוף את supernatant (חלבונים מסיסות) ולדלל אותו 20 מ ל של מאגר מחייב.
    6. לאסוף 400 μL של שב ס או מעלה באוב חרוזים agarose (כלומר, 400 μL של שאיפה) או 400 μL של חרוזי שליטה, צנטריפוגה עבור 1 דקות בשעה 1,000 x g ב RT. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש בתוך 400 μl של מאגר מחייב כדי לequiאת החרוזים. השתמש חרוזים agarose כפקד שלילי כדי לקבוע העשרה ספציפיים של החלבון מטבוליזם אינטראקציות לעומת אינטראקציות לא ספציפיות (למשל, חלבונים כי לאגד לא במיוחד את החרוזים). השתמש ב-IPs או ב-"פיס" עם תצורות פוספט שונות, כולל צורות לא-זרחמות לשליטה על אינטראקציות לא ספציפיות עקב מטעני פוספט או קשירה לביוטין.
    7. הוסף 400 μL של IP/PI חרוזים או חרוזי בקרה ל 10 מ ל של ליפוסט ו-דגירה עבור 1 h, או לילה, ב 4 ° c מסתובבת ב 50 סל ד. אם השימוש ב-IPs או ב-הפיס מצועם עם ביוטין בלבד (ללא חרוזים) המשך לשלב 2.1.7.1, אחרת המשך לשלב 2.1.8.
      1. הוסף 100 μL של streptavidin-מעלה מעלה על חרוזים מגנטיים והדגירה עבור 1 h ב 4 ° c מסתובבת ב 50 סל ד.
    8. צנטריפוגה את תגובת האיגוד במשך 1 דקות ב 1,000 x g ב -4 ° c. הסר את הסופרנטנט (זרימה) ושמור את הגלולה. שמרו 5% מתוך הסופרנטאנט לניתוח כתמי אבן מערבית.
    9. הוסף 5 מ ל של מאגר כביסה לתוך הגלולה, לערבב בעדינות על ידי התערבל הצינור, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 1,000 x g ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט . חזור על הכביסה חמש פעמים אם שימוש בחרוזים מגנטיים, לאסוף supernatants ולבצע שוטף באמצעות עמדה מגנטית (centrifugations אינם נחוצים).
    10. הוסף 50 μL של מאגר 2x Laemmli (או 8 M שתנן/100 מ"מ גליצין pH 2.9, כדי למנוע שימוש ב-SDS) על חרוזים ולערבב על ידי הקשה או מערבולת (להימנע ללטף כי חרוזים יכולים לצרף לטיפים הפיפטה), ולאחר מכן חום ב 95 ° צ' עבור 5 10,000 דקות ולאסוף את ה-סופרנטנט (חלבונים מאלגנים). חזור על ההליך פעמיים כדי לאסוף סך של שלושה שברים.
    11. הקפא את המנוע ב-80 ° c, אחרת הפרידו חלבונים ב-SDS/PAGE או המשיכו בפתרון לטריסינזציה ולניתוח ספקטרומטר המסה.
  2. טריפסין העיכול של חלבונים לספקטרומטר מסה
    הערה: שתי וריאציות של הליך זה מוצגות עבור סעיף 2.2.1 (ב ג'ל) או סעיף 2.2.2 (בפתרון) העיכול של חלבונים. מומלץ למנוע הפסדים לדוגמה. התייעץ עם כימאי אנליטי במתקן פרוטקומקס את ההתאמה של פרוטוקול עבור דגימות ומכשירי ספקטרומטר מסה זמין.
    1. טריסינטזציה של חלבונים בתוך-ג'ל
      1. לאחר הפרדת החלבון ב-SDS/PAGE, שטוף בקצרה את הג במים בעלי טוהר גבוה. להעביר את הג על צלחת זכוכית נקייה. להקות חלבון בלו עם להב נקי ולהימנע מקיצוץ ג'ל נוסף מחוץ ללהקות. חותכים את חתיכות ג'ל לחתיכות קטנות (כלומר, כ 1 מ"מ מרובע) ולהעביר אותם לתוך צינור 1 מ ל. השתמשו בעצת פיפטה במידת הצורך, אך ודאו שטיפ הפיפטה שוטפים באתנול לפני השימוש.
        הערה: השתמש בכפפות כדי למנוע זיהום ג'ל. חתיכות ג'ל ניתן לאחסן ב-20 ° c.
      2. הוסף 100 μL של מים בעלי טוהר גבוהה או ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית צינורות לשטוף חתיכות ג'ל. . להשליך את המים
        1. עבור Coomassie או רותניום מבוססי פלורסנט בחתיכות ג'ל ויטראז ', מודות את חתיכות ג'ל בפתרון destaining (25 מ"מ NH4hco3 ב 50% acetonitrile) עבור 1 h, ואז למחוק את הפתרון. חזור על ההליך עד שהצביעת לא תהיה גלויה.
          הערה: הכנת פתרונות המכילים NH4hco3 על ידי דילול מתוך פתרון מניות ב 100 mM NH4hco3, pH 7.8.
          התראה: Acetonitrile הוא ממיס נדיפים, דליק רעיל. NH4hco3 יכול לגרום גירוי בעור או בעין. להשתמש בכפפות ולעבוד תחת כיסוי כימי.
        2. עבור חתיכות ג'ל ויטראז ', חתיכות ג'ל דגירה ב 50 μL של מחיקת הפתרון לכתם כסף (15 מ"מ K3[FE (CN)6], 50 mM Na2S2O3) במים עבור 30 דקות. למחוק את הפתרון ולשטוף חתיכות ג'ל עם 200 μl של מים. חזור על השטיפה חמש פעמים או עד שהצבע הצהוב של ג'ל לא ייראה.
          התראה: K3[FE (CN)6] עלול לגרום לגירוי בעור או בעיניים. . תשתמש בכפפות
      3. מייבשים את חתיכות ג'ל באמצעות 200 μL של acetonitrile עבור 10 דקות ב RT. לאחר מכן, בטל את הפתרון.
        הערה: פריטי ג'ל יבשים קטנים יותר בנפח, אטום ודביק. אם כמה חתיכות ג'ל משולבים בצינור אחד, לחזור על ההליך להתייבשות יעילה של חתיכות ג'ל.
      4. הוסף 50 μL (או נפח מספיק כדי לכסות את חתיכות ג'ל) של הפחתת פתרון (10 מ"מ dithio, [DTT] ב 100 mM NH4hco3) ו דגירה ב 56 ° צ' עבור 1 h. לאחר מכן, קריר את הצינורות כדי RT ולמחוק את העודף של פתרון הפחתת.
      5. הוסף 50 μL (או נפח מספיק כדי לכסות את חתיכות ג'ל) של פתרון האלקיללציה (50 mM iodoamide ב 100 mM NH4hco3) ו דגירה עבור 30 דקות ב RT בחושך. לאחר מכן, השמט את. פתרון האלקיללציה
      6. מייבשים את חתיכות ג'ל עם 200 μL של acetonitrile עבור 10 דקות ב RT. הסר את הצ ומימה את חתיכות ג'ל עם 100 mM NH4hco3 עבור 10 דקות ב rt.
      7. מייבשים את חתיכות ג'ל שוב עם 200 μL של acetonitrile עבור 10 דקות ב RT ולמחוק את העודף של הפתרון.
      8. הוסף 15 μL של המסה ספקטרומטר כיתה טרימטריה מדולל בשנת 50 mM NH4hco3 מאגר, או נפח מספיק כדי לכסות חתיכות ג'ל ומודלת עבור 4 h, או לילה, ב 37 ° c. שמרו על טריפסין כמויות מוחלטת בין 100 ל-500 ng (או 20 מלטריפסין/μg של חלבון).
      9. מגניב את הדגימה ל RT, ואת צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 2,000 x g ב מיקרוצנטריפוגה. הוסף 10-20 μl של 5% החומצה פורמית מדולל במים ו דגירה עבור 10 דקות ב RT.
        התראה: חומצה פורמית היא דליק, מאכל ורעיל. להשתמש בכפפות ולעבוד תחת כיסוי כימי.
      10. צנטריפוגה כפי שצוין בשלב 2.2.1.9, ולאחר מכן לאסוף את supernatant (מכילים פפטידים מחולץ) לצינור אחר. הוסף 20 μl של 5% חומצה פורמית מדולל ב 50-60% acetonitrile לצינור ו דגירה עבור 10 דקות ב RT. לאסוף שברים פפטיד שחולצו באותה צינורית.
      11. יבש את המדגם בתוך מרכז ואקום ומהווים מחדש ב 10 μL של 0.5% חומצה אצטית 2% acetonitrile עבור ניתוח הספקטרומטר ההמוני. צנטריפוגה ולאסוף את הפתרון בתחתית הצינור; פתרון החנות ב-20 ° צ' או-80 ° c.
    2. בפתרון טריזיזציה של חלבונים
      1. מזרז חלבונים כדי להפחית את הנפח, התפלה, וחילופי מאגר. הוסף שישה כרכים של מקורר (-20 ° c) אצטון למדגם, למשל, 600 μL של אצטון כדי 100 μL של דגימה. מערבולת ומודקון ב-20 ° c עבור 15 דקות עד 1 h. הפתרון יהפוך להיות מעורפל או ליצור מזרז.
        זהירות: אצטון רעיל ודליק. להשתמש בכפפות ולעבוד תחת כיסוי כימי.
      2. דגימות צנטריפוגה ב 4 ° c עבור 30 דקות. Decant אצטון ואוויר יבש את הגלולה עבור 15 דקות.
      3. הוסף 10 μL של 6-8 M אוריאה או 1% SDS ב 50 mM NH4hco3 לפזר את הגלולה ואת המערבולת לערבב. עבור כמויות גדולות יותר של חלבונים (> 10 μg), להשתמש עד 20 μL של מאגר הפירוק.
      4. הוסף 5 μL של הפחתת פתרון ומערבולת. תוריד את הווליום. בעזרת מיקרוצנטריפוגה אם הדגימות מדוללת באוריאה, אז הדגירה עבור 1 h ב RT. אם הדגימות מדולדלים ב-SDS, לאחר מכן מודלת עבור 1 h ב 56 ° c.
      5. תוריד את הווליום. בעזרת מיקרוצנטריפוגה הוסף 3 μL של פתרון אלקיללציה ומערבולת. לאחר מכן, לסובב את עוצמת הקול למטה הדגירה בחושך עבור 30 דקות ב RT.
      6. הוסף 3 μL של הפחתת פתרון כדי לנטרל את התגובה. לאט לדלל את המדגם 1 M אוריאה או 0.05% SDS באמצעות 50 mM NH4hco3.
        הערה: מאגר העיכול של טריפסין חייב להיות כביסה או ניקוי. מגבלות הריכוז של הדאצורנים הן: 0.05% SDS; 0.1% אוקטיל ב-D-גלוקופיסוסייד; 0.1% 4-ללא שאילפניקסיל-פוליאתילן גליקול; 0.1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol; 0.1% פוליפbate 20; 0.1% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethlammonio] -1-propane,; . < 1 מ אוריאה או טאוראה
      7. הוסף 5 μL של טרימטריה כיתה מאסיבית המוניים מדולל ב50 mM NH4hco3 מאגר ו מודונט עבור 4 h, או לילה, ב 37 ° c. שמרו על מספר טריפסין כמויות בין 100 ו-500 ng (או 20 מנג טריפסין/μg של חלבון).
      8. לצנן את המדגם כדי RT, ולסובב את עוצמת הקול באמצעות מיקרוצנטריפוגה. הוסף 5% חומצה אצטית (או חומצה פורמית 5% ב 50% acetonitrile) כדי להרוות את התגובה.
      9. נגב את הדגימות בתוך מרכז ואקום כפי שמצוין בשלב 2.2.1.11. דגימות מהחנות ב-80 ° c. Desalt ו פפטידים להתרכז באמצעות עמודה הפוכה השלב כמו סי18 zip-עצה ולאחר מכן לנתח על ידי ספקטרומטר מסה.

תוצאות

אנליזה של RAP1 ו-PI (3, 4, 5) P3 אינטראקציה באמצעות כרומטוגרפיה של אהדה ובלוק מערבי
דוגמה זו ממחישה את היישום של שיטה זו כדי לנתח את הכריכה של RAP1 מ t. brucei ליפוסט או על ידי רקומביננטי t. brucei RAP1 חלבון. ליזוטים של T. brucei מחזור הדם צורות לבטא hemagglutinin (HA)-מתויגים RAP1 שימשו בכריכה assays. RA...

Discussion

הזיהוי של חלבונים התאגד ל-IPs או לפיס הוא קריטי להבנת התפקוד התאי של מטבוליטים אלה. כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן החשופה המערבית או לספקטרומטר מסה מציעה הזדמנות לזהות את החלבונים באינטראקציה של IP או PI ומכאן לקבל תובנות על התפקוד הרגולטורי שלהם. שב ס או פיס כימית מתויג [למשל, Ins (1, 4, 5) P3 כימי...

Disclosures

. לסופר אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC, RGPIN-2019-04658); השקת NSERC גילוי תוספת עבור חוקרים קריירה מוקדמת (DGECR-2019-00081) ועל ידי אוניברסיטת מקגיל.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneSigma-Aldrich650501Ketone
AcetonitrileSigma-Aldrich271004Solvent 
Ammonium bicarbonateSigma-AldrichA6141Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MIBeckman CoulterAvanti J6-MICentrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botlesSigma-AldrichB1408Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control BeadsEchelonP-B000-1mlAffinity chromatography reagent - control
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad1610610Reducing agent
Dynabeads M-270 StreptavidinThermoFisher Scientific65305Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001Protease inhibitors
Electrophoresis running bufferBio-Rad161073225 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesCorning Life Sciences430052To centrifuge 10 mL cultures
Formic acidSigma-Aldrich106526Acid
GlycineSigma-AldrichG7126Amino acid
HMI-9 cell culture mediumThermoFisher ScientificME110145P1Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein StainThermoFisher Scientific24615Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 BeadsEchelonQ-B0145-1mlAffinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry MilkThomas ScientificC837M64Blocking reagent for Western blotting
IodoacetamideSigma-AldrichI6125Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab RotatorThomas Scientific1159Z92For binding assays
LoBind Microcentrifuge TubesThermoFisher Scientific13-698-793Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630)Sigma-Aldrich21-3277Detergent
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010031Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescenceThermoFisher Scientific32106Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail TabletsRoche4906845001Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP BeadsEchelonP-B003a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP BeadsEchelonP-B034a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8EchelonP-3908-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP BeadsEchelonP-B345a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B035a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP BeadsEchelonP-B004a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8EchelonP-4508-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B045a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP BeadsEchelonP-B005a-1mlAffinity chromatography reagent 
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III)Sigma-Aldrich702587Potassium salt 
PtdIns PIP BeadsEchelonP-B001-1mlAffinity chromatography reagent 
PVDF MembraneBio-Rad1620177For Western blotting 
Refrigerated centrifugeEppendorf5910 RMicrocentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich862010Detergent
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich72049Chemical 
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermoFisher ScientificSPD120-115Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture ThermoFisher Scientific159910To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry GradePromegaV5280Trypsin for protein digestion
UreaSigma-AldrichU5128Denaturing reagent
VortexFisher Scientific02-215-418For mixing reactions
Western blotting transfer bufferBio-Rad161073425 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paperSigma-AldrichWHA3030861Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M)Bio-Rad1610710Reducing agent
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561094Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0747Protein loading buffer

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi, S. R., Wente, Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved