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要約

このプロトコルは、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定に焦点を当てています。これは、アガロースまたは磁気ビーズにストレプトアビジンを介して固定化されたバイオチン化イノシトールリン酸塩またはリンオイノシチドとの親和性クロマトグラフィーを使用しています。イノシトールリン酸塩またはホスオイノシチド結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析によって同定される。

要約

イノシトールリン酸塩およびホスホイノシチドは、遺伝子発現、小胞の人身売買、シグナル伝達、代謝、および発達を含む真核生物のいくつかの細胞プロセスを調節する。これらの代謝産物は、タンパク質に結合することによってこの調節活性を実行し、それによってタンパク質の立体構造、触媒活性、および/または相互作用を変化させる。ここで説明する方法は、質量分析またはウェスタンブロッティングに結合されたアフィニティクロマトグラフィーを使用して、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドと相互作用するタンパク質を同定する。イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドは、化学的にビオチンでタグ付けされ、その後、アガロースまたは磁気ビーズに結合したストレプトアビジンを介して捕捉される。タンパク質は、代謝物との結合の親和性によって単離され、次いで、質量分析またはウェスタンブロッティングによってタンパク化され、同定される。この方法は、感度が高く、非放射性、リポソームフリー、カスタマイズ可能なシンプルなワークフローを備えており、タンパク質と代謝産物の相互作用を精度で解析できます。このアプローチは、ラベルフリーまたはアミノ酸標識定量質量分析法で、複雑な生物学的試料中のタンパク質代謝産物相互作用を同定したり、精製されたタンパク質を使用したりするために使用できます。このプロトコルは、トリパノソマブルーサイからのタンパク質の分析のために最適化されていますが、関連する原虫寄生虫、酵母または哺乳動物細胞に適応することができます。

概要

イノシトールリン酸塩(IP)とホスホイノシチド(POI)は、遺伝子発現1、2、3、小胞の人身売買などの細胞プロセスの調節を通じて、白質生物生物学において中心的な役割を果たしている。4、信号伝達5、6、代謝7、8、9、および発達8、10。これらの代謝産物の調節機能は、タンパク質と相互作用し、したがってタンパク質機能を調節する能力から生じます.タンパク質によって結合すると、IPおよびピは、タンパク質立体構造11、触媒活性12、または相互作用13を変化させ、したがって細胞機能に影響を与える。IPおよびPは、核2、3、14、15、小平性網膜16、17、プラズマなどの複数の細胞下コンパートメントに分布している。膜1およびサイトゾル18は、タンパク質3、19またはRNA20に関連する。

ホスホリパーゼCによる膜関連PI(4,5)P2の切断は、それぞれIPキナーゼおよびホスファターゼによってリン酸化または脱リン酸化されうるIns(1,4,5)P3の放出をもたらす。IPは、タンパク質に結合し、調節機能を発揮することができる可溶性分子です。例えば、メタゾンにおけるIns(1,4,5)P3は、IP3受容体に結合することによって第2のメッセンジャーとして作用することができ、これは受容体立体構造変化を誘導し、したがって細胞内ストア11からCa2+の放出を誘導する。Ins(1,3,4,5)P4はヒストンデアセチラーゼ複合体に結合し、タンパク質複合体の組み立ておよび活性13を調節する。IP調節機能の他の例は、クロマチン組織21、RNA輸送22、23、RNA編集24、および転写1、2、3の制御を含む.対照的に、ピニは、多くの場合、血漿膜またはオルガネラ膜25へのタンパク質の募集に関連する。しかし、新しいPの特性は、非membranous環境3、15、19、26のタンパク質と関連付ける能力である。これは、転写制御機能がPI(3,4,5)P319によって調節される核受容体ステロイド生成因子の場合であり、および酵素活性が核PI(4,5)P226によって調節されるポリAポリメラーゼである。IPおよびPIの調節的役割は、酵母22、27、哺乳動物細胞19、23、ショウジョウバエ10およびワーム28を含む多くの生物で示されている。重要なのは、真核系統から早期に発散したトリパノソームにおけるこれらの代謝産物の役割である。これらの代謝産物は、トリパノソマブルーサイ転写制御1、3、開発8、器官生体形成およびタンパク質トラフィック29、30において重要な役割を果たす,31歳,32、および病原体T.クルジ33、34、35、トキソプラズマ36およびプラスモジウムにおける発達および感染の制御にも関与している5,37.したがって、トリパノソームにおけるIPとPIの役割を理解することは、これらの分子の新しい生物学的機能を解明し、新しい薬物標的を同定するのに役立つ可能性がある。

タンパク質およびIPまたはPI結合の特異性は、イノシトール13、38のタンパク質相互作用ドメインおよびリン酸化状態に依存するが、PIの脂質部分との相互作用も19である。様々なIプとピと、その修飾キナーゼおよびホスファターゼは、代謝産物の利用可能性と豊富さ、イノシトールのリン酸化状態、およびタンパク質の影響を受けるタンパク質機能を制御するための柔軟な細胞機構を提供します。相互作用の親和性1,3,13,38.一部のタンパク質ドメインは39、40、41、例えば、プレクストリン相同性ドメイン42およびSPX(S YG1/P ho81/XPR1)ドメイン43を特徴とするが ,44,45, 一部のタンパク質は、未知のままであるメカニズムによって、IPまたはPと相互作用する。例えば、T.bruceiのリプレッサ活性化タンパク質1(RAP1)は、正規のPI結合ドメインを欠いているが、PI(3,4,5)P3と相互作用し、抗原変動3に関与する遺伝子の転写を制御する。トリパノソーム、酵母、または哺乳動物細胞からのIPまたはPI相互作用タンパク質の親和性クロマトグラフィーおよび質量分析分析は、既知のIP-またはPI結合ドメインなしでいくつかのタンパク質を同定した8、46、47.データは、これらの代謝産物に結合する追加の無特徴タンパク質ドメインを示唆している。したがって、IPやピと相互作用するタンパク質の同定は、これらの低分子に対するタンパク質代謝物相互作用と新しい細胞調節機能の新しいメカニズムを明らかにする可能性がある。

ここで説明する方法は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析に結合したアフィニティクロマトグラフィーを採用し、IPまたはPIに結合するタンパク質を同定する。これは、アガロースビーズに結合したストレプトアビジンに架橋されるか、または代わりに、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを介して捕捉されたバイオミチル化されたIPまたはピを使用します(図1)。この方法は、感受性、非放射性、リポソームフリーであり、細胞のリザエートまたは精製タンパク質3からのタンパク質の結合を検出するのに適した簡単なワークフローを提供する(図2)。この方法は、標識のない8、46、またはアミノ酸標識定量質量分析47に結合して、複雑な生物学的試料からIPまたはPI結合タンパク質を同定するために使用することができる。したがって、この方法は、細胞タンパク質とのIPまたはピの相互作用を研究するために利用可能ないくつかの方法に代わるものであり、トリパノソームおよびおそらく他の真核生物におけるこれらの代謝産物の調節機能を理解するのに役立ちます。

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プロトコル

1. 親和性クロマトグラフィーとウェスタンブロッティングによるIP結合タンパク質の解析

  1. 細胞増殖、リシスおよび親和性クロマトグラフィー
    1. T.ブルーシー細胞を中間ログ相に成長させ、細胞の生存率と密度を監視します。1つの結合アッセイには合計5.0 x 107細胞で十分です。
      1. 血流形態の場合、37°Cおよび5%CO2で10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したHMI-9培中の細胞を増殖させる。8.0 x 105から 1.6 x 106セル/mL の間のセル密度を維持します。
        注: 1.8 x 106セル/mL より高い密度は、細胞の生存率に影響を与える可能性があります。インビトロで成長したT.brucei 427株の倍増時間は5.5〜6.5hの間である。
      2. プロ環状形態の場合、SDM-79培地で細胞を27°Cで10%FBSで補い、1.0 x 107と3.0 x 107細胞/mLの間の細胞密度を保つ。
      3. 精製タンパク質(例えば、組換えタンパク質)の場合、0.5~1 μgのタンパク質を摂取し、結合バッファーの450 μLで希釈する(25mM HEPES、150mM NaCl、0.2%4-ノンニルフェニルポリエチレングリコール、pH 7.4)。ウェスタンブロット分析のために希釈タンパク質(入力)の5%を保持します。ステップ 1.1.7 に進みます。
    2. 室温(RT)で10分間1,600 x gの遠心分離細胞。上清を捨てます。
      注: 大きなカルチャボリュームの遠心分離の詳細については、手順 2.1.2 を参照してください。
    3. 6 mMグルコース(PBS-G)を補充したリン酸緩衝生理食生pH 7.4の10mLでペレットを静かに再中断し、37°Cで予熱して細胞を洗浄する。次に、RTで1,600 x gで細胞を遠心分離し、RTで5分間遠心分離します。
    4. PBS-Gの1 mLでペレットを再ステースする。その後、1.5 mLチューブにボリュームを移し、1,600 x gで5分間上清を捨てます。
      注:細胞ペレットは、液体窒素中でフラッシュ冷凍し、-80 °Cまたは液体窒素で保存することができます。
    5. 0.5 mLのリシスバッファー(25 mM HEPES、150mM NaCl、1%t-オクチルフェノキシポリエトキセタノール、pH 7.4)でペレットを再懸濁し、1.5倍プロテアーゼ阻害剤カクテルと1xホスファターゼ阻害剤カクテル(材料の表)を予め冷やした細胞をlyseします。4°Cで50rpmで回転する10分間のライサテをインキュベートします。
      注:タンパク質は、指示どおりに処理しないと分解する可能性があるため、これは重要なステップです。必要に応じて、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS/PAGE)によるタンパク質リサートの完全性を確認してください。
      注意: T-オクチルフェノキシポリエトキセタノールは有毒であり、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。手袋、アイシールド、フェイスシールドを使用してください。
    6. 4°Cで10分間14,000 x gでリサートを遠心分離します。結合アッセイのための新しい1.5 mLチューブに上清を収集します。西洋ブロッティング分析のための総リサート(入力)の5%を保ちます。上清は、リシスバッファーで抽出された寄生虫タンパク質を含んでいます。
    7. アガロースビーズ(スラリーの50μL)または50μLのアガロースビーズに結合した50 μLのIまたはピを集め、1,000 x gで1分間遠心分離機を採取する。上清を廃棄し、ビーズを平衡化するために結合バッファーの50 μLで再懸濁します。コントロールとして非共役ビーズを使用します。非リン酸化形態を含む異なるリン酸構成のIP/PIビーズを使用して、非特異的相互作用を制御します。
    8. 細胞のライサートまたは精製タンパク質に50 μLのIP-またはPI-ビーズを加えます(ビーズの各1 mLには、共役IPまたはPIの10 nmolが含まれています)。IP-またはPIビーズの体積を総リサートの10%以内に保ち、必要に応じて結合バッファーで結合反応量を調整します。
      1. 競合アッセイの場合、結合反応に非共役IPまたはPIの様々な濃度(例えば、IP-またはPIビーズと比較して1-、10-、100倍のモル過剰)を加える。
    9. 反応を1時間または一晩、4°Cでインキュベートし、50rpmで回転させる。
      注:精製タンパク質との結合反応は、タンパク質の安定性に応じてRTで行うことができます。BIOtin に結合された I または P を使用する場合は、ステップ 1.1.9.1 にのみ進む場合は、ステップ 1.1.10 に進みます。
      1. 結合反応に磁気ビーズに50μLのストレプトアビジン結合を加え、50rpmで回転する4°Cで1時間インキュベートする。
    10. 4°Cで1,000 x gで1分間混合物を遠心分離します。上清(フロースルー)を取り除き、ペレットを保持します。西洋のブロット分析のための上清の5%を保つ。
      注:磁気ビーズを使用する場合は、上清を取り除き、磁気スタンドを使用して後続の洗い出しを行います(遠心分離は必要ありません)。
    11. 洗浄バッファー(25 mM HEPES、300 mM NaCl、0.2%4-ノンニルフェニルポリエチレングリコール、pH 7.4)を1mL追加し、チューブをタップまたは旋回して樹脂を再サスペンドします(ビーズはピペットの先端に付着できるのでピペットを使用しないでください)。4°Cで1,000 x gで1分間の反応を遠心分離し、上清を廃棄する。合計 5 回の洗い方の手順を繰り返します。
      注意:4-ノニルフェニルポリエチレングリコールは有毒であり、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。手袋、アイシールド、フェイスシールドを使用してください。
    12. ビーズに710 mM 2-メルカプトエタノールを添加した2x Laemmliバッファーの50 μLを加え、たたきまたは渦をタップしてタンパク質を溶出して混ぜます。95°Cで5分間熱し、その後1分間10,000 x gの遠心分離機を行い、上清(タンパク質を含む)を収集します。あるいは、8M尿素/100mMグリシンpH 2.9を有するタンパク質を溶出し、SDSの使用を避ける。溶出液を-80°Cで凍結し、それ以外の場合はウェスタンブロット分析に進みます。
      注意:2-メルカプトエタノールは有毒であり、皮膚、眼および呼吸器刺激を引き起こす可能性がある。手袋を使用し、化学フードで作業します。
  2. 西洋ブロッティング分析
    1. 入力の15 μL(ステップ1.1.6から)またはフロースルー(ステップ1.1.10から)サンプルを4x Laemmliバッファの5 μLと混合します。95°Cで5分間の熱入力とフロースルーサンプル。8M尿素/100mMグリシンpH 2.9で溶出したサンプルの場合は、溶出液の15μLを4x Laemmliバッファーの5μLと混合し、95°Cで5分間加熱します。
      注: この手順は、2x Laemmli バッファーでエリュートされたサンプルには必要ありません。
    2. 入力の2.5 μL、2.5 μLのフロースルー、および20 μLの浸透サンプルを備えた4-20%のSDS/PAGEゲルのウェルをロードし、製造元の推奨に従ってタンパク質はしごをロードします。
      注:目的のタンパク質の分子量に応じてゲル%を選択します。
    3. 実行中のバッファーで 30 ~ 45 分間、または Laemmli バッファーの青色染料がゲルの末端になるまで、SDS/PAGE を 150 V で実行します。
      注:走行時間は、実験装置によって異なる場合があります。
    4. ガラス(またはプラスチック)プレートからゲルを取り出し、15分間転送バッファーに浸します。
    5. タンパク質をポリビニリデレンジフッ化物(PVDF)膜またはニトロセルロース膜に移す。転写バッファーに膜と3mmフィルターペーパーを浸します。3枚のフィルターペーパー、ニトロセルロースまたはPVDF膜、ゲル、およびフィルターペーパーの追加3枚でサンドイッチを組み立てます。サンドイッチに気泡が閉じ込められていないことを確認します。必要に応じて、ローラーを使用して気泡を除去します。カソードの膜とカセットの陽極側のゲルをセットします。
      注: 膜の活性化またはブロット調製に関する情報については、膜の製造元の指示を確認してください。
    6. サンドイッチを入ったカセットを転送バッファ付きの転送タンクに入れます。タンクをアイスバケツまたは4°C(例えば、冷たい部屋)に置きます。1時間100Vでタンパク質を転写する(電流は200〜400 mAの間で変化する)。あるいは、4°Cで15mAの一定電流で一晩転送する。
    7. カセットから膜を取り除きます。ポリソルベート20(PBS-T)の0.05%でPBSで希釈した6%非脂肪ドライミルクで膜をインキュベートし、または互換性のあるブロッキング溶液をRTで1時間、膜を遮断する。
      注:膜を遮断する前に、ポンソーS染色を使用して転送の品質を確認することができます。ポンソーSの15 mLで1分間膜をインキュベートし、水中ですすいでバンドを可視化します。
    8. ブロッキング溶液を除去し、PBS-Tで希釈した6%の非脂肪ドライミルクで希釈した一次抗体で50rpm回転でRTで1時間膜をインキュベートする。あるいは、50rpm回転で4°Cで一晩膜をインキュベートする。
      注:インキュベーションの時間は、抗体の品質に応じて変化する場合があります。しかし、ほとんどの抗体はRTで1-3時間のインキュベーションで動作します。
    9. PBS-Tで膜を5分間、RTで50rpm回転させ、ブロットを洗浄し、手順を3~5回繰り返します。抗体の品質に応じて、より多くの洗い出しが必要な場合があります。
    10. 50 rpm 回転で PBS-T で希釈した 6% 非脂肪ドライミルクで RT で 1 時間のワサビペルオキシダーゼ (HRP)結合二次抗体で膜をインキュベートします。
      注:抗体濃度または希釈に関するメーカーの推奨に従ってください。
    11. ステップ 1.2.9 に示すようにブロットを洗います。
    12. 膜を覆う化学発光基板を添加する。基板の過剰を取り除き、暗闇の中でRTで5分間インキュベートします。
      注: 化学発光試薬に関する推奨事項については、製造元の指示を確認してください。
    13. カメラベースのイメージャーを使用して化学発光信号をキャプチャします。あるいは、X線フィルムを使用して化学発光シグナルを捕捉する。

2. 親和性クロマトグラフィーと質量分析によるIP/PI結合タンパク質の解析

  1. 細胞増殖、リシスおよび親和性クロマトグラフィー
    1. T.ブルーシー細胞を中間ログ相に成長させ、細胞の生存率と密度を監視します。
      注:合計1.0 x 1010細胞は、2つの結合アッセイに十分です。ここで示すよりも少ない細胞を使用すると、質量分析による低量タンパク質の検出に影響を与える可能性があります。
      1. T.brucei血流形態の場合、HMI-9培中の中間対数相(8.0 x 105-1.6 x 106細胞/mL)で細胞を増殖させ、37°Cで10%FBSを補充し、5%CO2を用いた。427株の場合、5Lの培養物は0.5〜1.0 x 1010細胞を得る。細胞の増殖を監視し、細胞の生存率に影響を与える可能性のある1.8 x 106細胞/mLより高い密度を避けます。フラスコ体積の1/10にセル培養体積を保ちます。それ以外の場合は、細胞の増殖速度が悪い通気性のために影響を受けます。
        注:427株は5.5-6.5 hの倍増時間を有する。
      2. プロ環状形態の場合、SDM-79培地で細胞を27°Cで10%FBSで補い、1.0 x 107と3.0 x 107細胞/mLの間の細胞密度を保つ。培養の500 mLは0.5〜1.5 x 1010細胞を生み出す。
    2. RTで1,600 x gで細胞を遠心分離し、上清を捨て、37°Cで予熱したPBS-Gの200 mLでペレットを再懸濁する。固定角遠心ローターを使用する場合、T.ブルーセイ血流形態ペレットが邪魔されやすいため、丸底遠心分離管(材料表)を使用してください。RTで5分間、1,600 x gで再び細胞を遠心分離します。
    3. 上清を取り出し、PBS-Gの10mLでペレットを再中断します。RTで5分間1,600 x gで細胞を遠心分離し、手順を繰り返し、最終洗浄後、上清を廃棄します。
      注:ペレットは、液体窒素中でフラッシュ凍結し、-80°Cまたは液体窒素で保存することができます。
    4. 細胞ペレットを5mLのリシスバッファーで予め氷で冷やし、1.5倍プロテアーゼ阻害剤カクテルと1xホスファターゼ阻害剤カクテル(材料表)を補充する。50rpmで回転する4°Cで10分間ライサテをインキュベートします。
    5. 4°Cで10分間10,000 x gでリサートを遠心分離します。上清(可溶化タンパク質)を回収し、結合バッファーの20mLで希釈します。
    6. アガロースビーズ(スラリーの400μL)または400μLのコントロールビーズに結合した400 μLのIまたはピを収集し、RTで1,000 x gで1分間遠心分離機を廃棄し、ビーズを平衡化するために400 μLの結合バッファーで再濁します。アガロースビーズを負の対照として使用して、非特異的相互作用(例えば、ビーズに非特異的に結合するタンパク質)と比較したタンパク質代謝産物相互作用の特異的濃縮を決定する。非リン酸化形態を含む異なるリン酸構成を持つIPまたはピを使用して、リン酸料金またはビオチンへの結合による非特異的相互作用を制御します。
    7. 400 μLのIP/PIビーズまたはコントロールビーズを10mLのリザートに加え、50rpmで回転する4°Cで1時間または一晩インキュベートします。ビオチンのみ(ビーズなし)で結合したIPまたはピを使用する場合は、ステップ2.1.7.1に進み、それ以外の場合はステップ2.1.8に進みます。
      1. 磁気ビーズに100μLのストレプトアビジン結合を加え、50rpmで回転する4°Cで1時間インキュベートします。
    8. 4°Cで1,000 x gで1分間の結合反応を遠心分離する。上清(フロースルー)を取り除き、ペレットを保持します。西洋のブロット分析のための上清の5%を保つ。
    9. ペレットに洗浄バッファーの5 mLを追加し、チューブを旋回して穏やかに混合し、次いで4°Cで1,000 x gで1分間遠心分離機を行います。上清を捨てます。5回繰り返します。磁気ビーズを使用する場合は、上清を収集し、磁気スタンドを使用して洗い洗いを行います(遠心分離は必要ありません)。
    10. 2x Laemmliバッファーの50 μL(または8 M尿素/100 mMグリシンpH 2.9、SDSの使用を避けるために)をビーズに追加し、タップまたは渦(ビーズはピペットの先端に取り付けることができるのでピペッティングを避ける)、そして10,000 mのために5分間95°Cで熱します。上清(タンパク質)を収集します。手順を 2 回繰り返して、合計 3 分の分数を収集します。
    11. 溶出液を-80°Cで凍結し、それ以外の場合はSDS/PAGEでタンパク質を分離するか、トリプシン化および質量分析分析のための溶液中に保管してください。
  2. 質量分析のためのタンパク質のトリプシン消化
    注:この手順の2つのバリエーションは、セクション2.2.1(ゲル)またはセクション2.2.2(溶液中)のタンパク質の消化について示されています。タンパク質の低結合チューブは、サンプル損失を防ぐために推奨されます。プロテオミクス施設の分析化学者に、利用可能なサンプルおよび質量分析計の器具に対するプロトコルの適合性を相談してください。
    1. タンパク質のインゲルトリプシン化
      1. SDS/PAGEでタンパク質を分離した後、高純度の水でゲルを簡単にすすいでください。ジェルをきれいなガラス板に移します。きれいな刃の蛋白質バンドを物品切り出しし、バンドの外に余分なゲルを切断しないようにしてください。ゲル片を小片(約1mm角)に切り、1mLチューブに移します。必要に応じてピペットチップを使用しますが、使用前にピペットチップがエタノールですす込まれたことを確認してください。
        注:ゲルの汚染を避けるために手袋を使用してください。ゲル片は-20°Cで保存することができます。
      2. 高純度または高性能液体クロマトグラフィーグレードの水をチューブに100μLのゲル片をすすいでください。水を捨てなさい。
        1. クーマシーまたはルテニウムベースの蛍光染色ゲル片の場合は、脱染溶液(25mM NH4HCO3 in 50%アセトニトリル)でゲル片を1時間インキュベートし、溶液を廃棄します。染色が見えないまで手順を繰り返します。
          注:100 mM NH4HCO 3、pH 7.8のストック溶液からの希釈によりNH4 HCO3を含む溶液を調調します。
          注意:アセトニトリルは揮発性溶媒であり、可燃性および有毒である。NH4HCO3は、皮膚や眼の刺激を引き起こす可能性があります。手袋を使用し、化学フードの下で作業します。
        2. 銀染色ゲル片の場合は、銀染色液の50μLの脱染液(15mM K3[Fe(CN)6]、50mM Na2 S2O3)を水中で30分間水中に入れ、200μLでゲル片を洗浄します。水の。5回繰り返し、またはゲル黄色が見えなくなるまで洗い流します。
          注意:K3[Fe(CN)6]皮膚や眼の炎症を引き起こすことがある。手袋を使用してください。
      3. RTで200μLのアセトニトリルを使用してゲル片を10分間脱水します。次に、ソリューションを破棄します。
        注:脱水ゲル片は、体積、不透明、粘着性が小さくなります。複数のゲルを1つのチューブに組み合わせる場合は、ゲル片の効率的な脱水のための手順を繰り返します。
      4. 還元液(100mM NH4HCO3で10mMジチオスレイトール[DTT])の50 μL(またはゲル片を覆うのに十分な体積)を加え、その後1時間56°Cでインキュベートし、チューブをRTに冷却し、還元液の過剰を廃棄します。
      5. アルキル化溶液(100mM NH4HCO3で50mMヨードアセタミド)の50 μL(またはゲル片を覆うのに十分な体積)を加え、暗闇の中でRTで30分間インキュベートします。その後、過剰なアルキル化溶液を廃棄する。
      6. RTで10分間アセトニトリルの200 μLでゲル片を脱水し、RTで100 mM NH4HCO3でゲル片を水和します。
      7. RTで10分間アセトニトリルの200 μLで再度ゲル片を脱水し、溶液の過剰を廃棄します。
      8. 50 mM NH4HCO3バッファーで希釈した質量分析グレードトリプシンを 15 μL 追加するか、水和ゲル片を覆うのに十分な体積を加え、4 時間または一晩、37 °C でインキュベートします。総トリプシン量は100~500ng(またはタンパク質の20ngトリプシン/μg)に保ちます。
      9. サンプルをRTに冷却し、マイクロ遠心分離機で2,000 x gで1分間遠心分離機を使用します。水に希釈したギ酸5%の10-20 μLを加え、RTで10分間インキュベートします。
        注意:ギ酸は可燃性、腐食性、有毒です。手袋を使用し、化学フードの下で作業します。
      10. ステップ2.2.1.9に示すように遠心分離機は、次いで、別のチューブに上清(抽出されたペプチドを含む)を収集します。50-60%のアセトニトリルで希釈した5%のギ酸の20 μLをチューブに加え、RTで10分間インキュベートします。
      11. 真空濃縮器でサンプルを乾燥させ、質量分析のために0.5%酢酸と2%アセトニトリルの10 μLで再構成します。遠心分離機とチューブの底部に溶液を収集します。-20 °C または -80 °C.
    2. タンパク質の溶液トリプシン化
      1. タンパク質を沈殿させ、サンプル量、脱塩、およびバッファー交換を減らします。6つのボリュームのチルド(-20°C)アセトンをサンプルに加え、例えば、600μLのアセトンを100μLのサンプルに加えます。渦と-20°Cで15分〜1時間インキュベートします。溶液は曇りになるか、沈殿物を形成します。
        注意:アセトンは有毒で可燃性です。手袋を使用し、化学フードの下で作業します。
      2. 遠心分離機は4°Cで30分間試料を30分間デカントし、ペレットを15分間空気乾燥させます。
      3. 50 mM NH4HCO3に6-8 M尿素の10 μLまたは1%SDSを加え、ペレットと渦を溶かして混合します。タンパク質の量が多い場合 (> 10 μg) は、最大 20 μL の溶解バッファーを使用します。
      4. 還元溶液と渦の5 μLを追加します。マイクロ遠心分離機を使用して音量を下げます。サンプルが尿素で希釈された場合は、RTで1時間インキュベートします。サンプルをSDSで希釈した場合は、56°Cで1時間インキュベートします。
      5. マイクロ遠心分離機を使用して音量を下げます。アルキル化溶液と渦の3 μLを追加します。その後、音量を下げ、RTで30分間暗闇の中でインキュベートします。
      6. 反応を中和するために還元溶液の3 μLを追加します。50 mM NH4HCO3を使用してサンプルを1M尿素または0.05%SDSにゆっくりと希釈する。
        注:トリプシン消化バッファーは、洗剤または脱窒剤を持っている必要があります。脱薬の濃度限界は次のとおりです: 0.05% SDS;0.1% オクチル B-D-グルコピーラノシド;0.1% 4-ノニルフェニルポリエチレングリコール;0.1% t-オクチルフェニキシポリエトキセタノール;0.1% ポリソルベート 20;0.1% 3-[(3-チョラミドプロピル)ジメチルアモンオ]-1-プロパンスルホネート;< 1 M尿素またはチウレア。
      7. 50 mM NH4HCO3バッファーで希釈した質量分析グレードトリプシンを 5 μL を追加し、37 °C で 4 時間または一晩インキュベートします。総トリプシン量は100~500ng(またはタンパク質の20ngトリプシン/μg)に保ちます。
      8. サンプルをRTに冷却し、マイクロ遠心分離機を使用して音量を下げます。反応をクエンチするために5%酢酸(または50%アセトニトリルで5%ギ酸)を追加します。
      9. ステップ2.2.1.11に示すように、真空コンセントレータでサンプルを乾燥させます。サンプルを-80 °C.で保存します。C18ジップチップなどの逆相カラムを用いてペプチドを脱塩・濃縮し、質量分析で分析します。

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結果

親和性クロマトグラフィーとウェスタンブロッティングによるRAP1とPI(3,4,5)P3相互作用の解析
この例は、この方法を用いて、T.ブルシー・リサートまたは組換えT.ブルーシーRAP1タンパク質からのRAP1による結合を分析する。ヘマグルチニン(HA)タグ付きRAP1を発現するT.ブルーセイ血流形態のライサテスを結合アッセイに用いた。RAP1は、変異面糖タンパク質(VSG)遺...

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ディスカッション

これらの代謝産物の細胞機能を理解するためには、IPまたはPに結合するタンパク質の同定が重要です。ウェスタンブロットまたは質量分析に結合されたアフィニティクロマトグラフィーは、IPまたはPI相互作用タンパク質を同定し、その調節機能に関する洞察を得る機会を提供します。IPまたはPは化学的にタグ付けされた[例えば、Ins(1,4,5)P3はビオチンに化学的にリンクされている]とストレプ?...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(NSERC、RGPIN-2019-04658)によって支援されました。NSERCディスカバリーは、初期のキャリア研究者のためのサプリメントを起動します (DGECR-2019-00081) とマギル大学.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneSigma-Aldrich650501Ketone
AcetonitrileSigma-Aldrich271004Solvent 
Ammonium bicarbonateSigma-AldrichA6141Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MIBeckman CoulterAvanti J6-MICentrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botlesSigma-AldrichB1408Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control BeadsEchelonP-B000-1mlAffinity chromatography reagent - control
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad1610610Reducing agent
Dynabeads M-270 StreptavidinThermoFisher Scientific65305Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001Protease inhibitors
Electrophoresis running bufferBio-Rad161073225 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesCorning Life Sciences430052To centrifuge 10 mL cultures
Formic acidSigma-Aldrich106526Acid
GlycineSigma-AldrichG7126Amino acid
HMI-9 cell culture mediumThermoFisher ScientificME110145P1Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein StainThermoFisher Scientific24615Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 BeadsEchelonQ-B0145-1mlAffinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry MilkThomas ScientificC837M64Blocking reagent for Western blotting
IodoacetamideSigma-AldrichI6125Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab RotatorThomas Scientific1159Z92For binding assays
LoBind Microcentrifuge TubesThermoFisher Scientific13-698-793Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630)Sigma-Aldrich21-3277Detergent
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010031Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescenceThermoFisher Scientific32106Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail TabletsRoche4906845001Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP BeadsEchelonP-B003a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP BeadsEchelonP-B034a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8EchelonP-3908-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP BeadsEchelonP-B345a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B035a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP BeadsEchelonP-B004a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8EchelonP-4508-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B045a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP BeadsEchelonP-B005a-1mlAffinity chromatography reagent 
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III)Sigma-Aldrich702587Potassium salt 
PtdIns PIP BeadsEchelonP-B001-1mlAffinity chromatography reagent 
PVDF MembraneBio-Rad1620177For Western blotting 
Refrigerated centrifugeEppendorf5910 RMicrocentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich862010Detergent
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich72049Chemical 
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermoFisher ScientificSPD120-115Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture ThermoFisher Scientific159910To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry GradePromegaV5280Trypsin for protein digestion
UreaSigma-AldrichU5128Denaturing reagent
VortexFisher Scientific02-215-418For mixing reactions
Western blotting transfer bufferBio-Rad161073425 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paperSigma-AldrichWHA3030861Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M)Bio-Rad1610710Reducing agent
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561094Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0747Protein loading buffer

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