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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo si concentra sull'identificazione delle proteine che si legano ai fosfati inositoli o fosforoparassiti. Utilizza la cromatografia di affinità con fosfati inositoli biotinylati o fosforostostodi che vengono immobilizzati tramite streptavidin a agarose o perline magnetiche. Le proteine leganti al fosfato o fosfoinosazione sono identificate da gonfiore occidentale o spettrometria di massa.

Abstract

Fosfati inositoli e fosfoinossidi regolano diversi processi cellulari negli eucarioti, tra cui l'espressione genica, il traffico di vescicle, la trasduzione del segnale, il metabolismo e lo sviluppo. Questi metaboliti svolgono questa attività regolatrice legandosi alle proteine, cambiando così la conformazione proteica, l'attività catalitica e/o le interazioni. Il metodo qui descritto utilizza la cromatografia di affinità accoppiata alla spettrometria di massa o al gonfiore occidentale per identificare le proteine che interagiscono con fosfati inositoli o fosfoinossidi. I fosfati inositoli o fosforosati sono etichettati chimicamente con biotina, che viene poi catturata tramite streptavidina coniugata ad agarose o perline magnetiche. Le proteine sono isolate dalla loro affinità di legame con il metabolita, poi eluite e identificate da spettrometria di massa o gonfiore occidentale. Il metodo ha un flusso di lavoro semplice, non radioattivo, privo di liposomi e personalizzabile, che supporta con precisione l'analisi dell'interazione tra proteine e metaboliti. Questo approccio può essere utilizzato in metodi di spettrometria di massa quantitativa senza etichetta o con elementi aminoacidi per identificare le interazioni proteina-metabolita in campioni biologici complessi o utilizzando proteine purificate. Questo protocollo è ottimizzato per l'analisi delle proteine di Trypanosoma brucei, ma può essere adattato ai relativi parassiti protozoi, lieviti o cellule mammiferi.

Introduzione

I fosfati inositoli (IP) e le fosfoinosti (PI) svolgono un ruolo centrale nella biologia degli eucarioti attraverso la regolazione dei processi cellulari come il controllo dell'espressione genica1,2,3, il traffico di vescicocchi 4, trasduzione del segnale5,6, metabolismo7,8,9, e lo sviluppo8,10. La funzione regolatoria di questi metaboliti deriva dalla loro capacità di interagire con le proteine e quindi regolare la funzione proteica. Al momento del legame da parte delle proteine, IP e PI possono alterare la conformazione proteica11, l'attività catalitica12o le interazioni13 e quindi influenzare la funzione cellulare. IP e PI sono distribuiti in più compartimenti subcellulari, come il nucleo2,3,14,15, reticolo endolasmico16,17, plasma membrana1 e citosol18, associati alle proteine3,19 o con RNA20.

La scissione del PI(4,5)P2 associato alla membrana dalla fosforaC determina il rilascio di Ins(1,4,5)P3, che può essere fosforilata o dephophorylated da kinasi IP e fosfoforasi, rispettivamente. Gli IP sono molecole solubili che possono legarsi alle proteine ed esercitare funzioni regolatorie. Ad esempio, Ins(1,4,5)P3 in metazoo può agire come un secondo messaggero legandosi ai recettori IP3, che induce i cambiamenti conformazionali del recettore e quindi il rilascio di Ca2, dai negozi intracellulari11. Ins(1,3,4,5)P4 si lega al complesso della deacetylase istone e regola l'assemblaggio e l'attività complesse di proteine13. Altri esempi di funzione regolatrice degli IP includono il controllo dell'organizzazione della cromatina21, il trasporto dell'RNA22,23, l'editing RNA24e la trascrizione1,2,3 . Al contrario, i PI sono spesso associati al reclutamento di proteine nella membrana plasmatica o nelle membrane dell'orgelli25. Tuttavia, una proprietà emergente delle PI è la capacità di associarsi alle proteine in un ambiente non-membranoso3,15,19,26. Questo è il caso del recettore nucleare fattore steroidogenico, che la funzione di controllo trascrizionale è regolata da PI(3,4,5)P319, e poli-A polimerasi che l'attività ezimatica è regolata da NUCLEAR PI(4,5)P226. Un ruolo normativo per IP e PI è stato dimostrato in molti organismi tra cui lievito22,27, cellule di mammiferi19,23, Drosophila10 e vermi28. Di significato è il ruolo di questi metaboliti nei trypanosomi, che si sono differenziati presto dal lignaggio eucarotico. Questi metaboliti svolgono un ruolo essenziale nel trypanosoma brucei controllo trascrizionale1,3, sviluppo8, biogenesi organelle e traffico proteico29,30 , 31 Milia , 32, e sono anche coinvolti nel controllo dello sviluppo e infezione nei patogeni T. cruzi33,34,35,Toxoplasma36 e Plasmodium 5 Del numero 3( , 37. Quindi, comprendere il ruolo degli IP e dei PI nei trypanosomi può aiutare a chiarire la nuova funzione biologica di queste molecole e a identificare nuovi bersagli farmacologici.

La specificità del legame di proteine e IP o PI dipende dalle proteine che interagiscono tra i domini e lo stato di fosforilazione dell'inositolo13,38, anche se le interazioni con la parte lipidica delle PI avvengono anche19. La varietà di IP e PI e la loro modifica di chinasi e fosfolenosi fornisce un meccanismo cellulare flessibile per controllare la funzione proteica che è influenzato dalla disponibilità e dall'abbondanza di metaboliti, dallo stato di fosforolalazione dell'inositolo e dalle proteine affinità di interazione1,3,13,38. Anche se alcuni domini proteici sono ben caratterizzati39,40,41, ad esempio, pleckstrin homology dominio42 e SPX (SYG1 /Pho81 /XPR1) domini43 ,44,45, alcune proteine interagiscono con IP o PI con meccanismi che rimangono sconosciuti. Ad esempio, la proteina repressore-attivatore 1 (RAP1) di T. brucei manca di domini di legame PI canonici, ma interagisce con PI(3,4,5)P3 e la trascrizione di controllo dei geni coinvolti nella variazione antigenica3. La cromatografia di affinità e l'analisi della spettrometria di massa delle proteine interagenti IP o PI da cellule tripitosomi, lievito o mammiferi hanno identificato diverse proteine senza domini di legame IP o PI noti8,46, 47. I dati suggeriscono ulteriori domini proteici non caratterizzati che si legano a questi metaboliti. Quindi, l'identificazione delle proteine che interagiscono con IP o PI può rivelare nuovi meccanismi di interazione proteina-metabolita e nuove funzioni regolatorie cellulari per queste piccole molecole.

Il metodo qui descritto utilizza la cromatografia di affinità accoppiata alla blotrotazione occidentale o alla spettrometria di massa per identificare le proteine che si legano a IP o PI. Esso utilizza IP biotinylati o PI che sono o cross-linked a streptavidin a perline di agarose o in alternativa, catturato tramite perline magnetiche coniugate streptavidin (Figura 1). Il metodo fornisce un flusso di lavoro semplice, sensibile, non radioattivo, privo di liposomi ed è adatto per rilevare il legame delle proteine da lismi cellulari o proteine purificate3 (Figura 2). Il metodo può essere utilizzato in una spettrometria di massa quantitativada 8,46 o accoppiato a una spettrometria di massa quantitativa con etichetta di aminoacidi47 per identificare proteine IP o PI-leganti da campioni biologici complessi. Quindi, questo metodo è un'alternativa ai pochi metodi disponibili per studiare l'interazione di IP o PI con proteine cellulari e aiuterà a comprendere la funzione regolatoria di questi metaboliti nei trypanosomi e forse in altri eucarioti.

Protocollo

1. Analisi delle proteine che legano IP o PI mediante cromatografia di affinità e gonfiore occidentale

  1. Crescita cellulare, lisi e cromatografia di affinità
    1. Coltivano le cellule T. brucei fino alla fase intermedia del log e monitorano la vitalità e la densità delle cellule. Un totale di 5,0 x 107 celle è sufficiente per un saggio vincolante.
      1. Per le forme del flusso sanguigno, far crescere le cellule nei media HMI-9 integrati con 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 e 5% di CO2. Mantenere la densità delle celle tra 8,0 x 10da 5 a 1,6 x 106 celle/mL.
        NOTA: la densità superiore a 1,8 x 106 celle/mL può influire sulla vitalità delle cellule. Il tempo di raddoppio del ceppo T. brucei 427 cresciuto in vitro è compreso tra 5,5 e 6,5 h.
      2. Per le forme procicliche, far crescere le cellule nel mezzo SDM-79 integrato con 10% FBS a 27 gradi centigradi e mantenere la densità delle cellule tra 1,0 x 107 e 3,0 x 107 celle/mL.
      3. Per le proteine purificate (ad es. proteine ricombinanti), prendere da 0,5 a 1 g di proteine e diluire in 450 -L di binding buffer (25 m HEPES, 150 mM NaCl, 0.2% 4-nonyl-polyyl-polyethylene glycol, pH 7.4). Mantenere il 5% della proteina diluita (input) per l'analisi delle macchie occidentali. Procedere al passaggio 1.1.7.
    2. Centrifuga reimmagini a 1.600 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT). Scartare il super-attardato.
      NOTA: vedere il passaggio 2.1.2 per ulteriori informazioni sulla centrifugazione di grandi volumi di coltura.
    3. Risospendere delicatamente il pellet in 10 mL di fosfato tamponato pH 7.4 integrato con 6 mM di glucosio (PBS-G) e preriscaldato a 37 o Più per lavare le cellule. Quindi, centrifugare le cellule a 1.600 x g per 5 min a RT. Ripetere la procedura due volte.
    4. Risospendere il pellet in 1 mL di PBS-G. Quindi, trasferire il volume su un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 1.600 x g per 5 min. Scartare il supernatante.
      NOTA: I pellet cellulari possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi centigradi o azoto liquido.
    5. Risospendere il pellet in 0,5 mL di cuscinetto di lisi (25 m HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-octilphenoxypolyethoxyethanol, pH 7.4) integrato con 1,5x cocktail inibitore proteasi e 1x cocktail inibitore del fosfofono (Tabella dei materiali) pre-raffreddato nel ghiaccio a liscivia le cellule. Incubare il lisa per 10 min ruotando a 50 giri a 4 gradi centigradi.
      NOTA: Questo è un passo fondamentale perché le proteine possono degradarsi se non gestite come indicato. Controllare l'integrità della proteina lisata da sodio dodecyl solfato-poliacrite gel elettroforesi (SDS/PAGE) se necessario.
      AVVISO: T-octylphenoxypolyethoxyethanol è tossico e può causare irritazione della pelle e degli occhi. Utilizzare guanti, paraocchi e protezione del paravisore.
    6. Centrifugare il lisato a 14.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 mL per leganti i saggi. Mantenere il 5% del lisato totale (input) per l'analisi di gonfiazione occidentale. Il supernatante contiene proteine parassiastiche estratte con tampone di lisi.
    7. Raccogliere 50 -L di IP o PI coniugati a perline di agarose (cioè 50 luna di liquami) o 50 L di perline di agarose, e centrifugare per 1 min a 1.000 x g. Scartare il supernatante e risospendere di nuovo 50 gradi l di rilegatura tamponare per equilibrate le perline. Utilizzare perline non coniugate come controllo. Utilizzare IP/PI-perle con diverse configurazioni fosfati che includono forme non fosforati per controllare le interazioni non specifiche.
    8. Aggiungere 50 l di IP o PI-perline alle proteine lisate o purificate delle cellule (ogni 1 mL di perline contiene 10 nmol di IP coniugati o PI). Mantenere il volume di IP- o PI-perline entro 10% del lisato totale e, se necessario, regolare il volume di reazione di rilegatura con buffer di legame.
      1. Per i saggi di concorrenza, aggiungere alla reazione vincolante varie concentrazioni di IP non coniugati o PI (ad esempio, 1-, 10-, 100 volte eccesso molare rispetto a IP- o PI-perle).
    9. Incubare la reazione per 1 h, o durante la notte, a 4 gradi centigradi e ruotando a 50 giri/min.
      NOTA: Le reazioni vincolanti con le proteine purificate possono essere fatte a RT a seconda della stabilità della proteina. Se si utilizzano IP o PI coniugati alla biotina procedere solo al passaggio 1.1.9.1, in caso contrario procedere al passaggio 1.1.10.
      1. Aggiungere 50 l di streptavidino-coniugato a perline magnetiche alla reazione di legame e incubare per 1 h a 4 gradi centigradi ruotando a 50 giri/min.
    10. Centrifugare il mix per 1 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi. Rimuovere il supernatante (flow-through) e mantenere il pellet. Mantenere il 5% del supernatante per l'analisi delle macchie occidentali.
      NOTA: Se si utilizzano perline magnetiche, rimuovere i supernatanti ed eseguire i successivi fusti con un supporto magnetico (le centrifughe non sono necessarie).
    11. Aggiungere 1 mL di buffer di lavaggio (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl fenil-polyethylene glicole, pH 7.4) e risospendere la resina toccando o vorticoso il tubo (non utilizzare una pipetta perché le perline possono attaccarsi alle punte della pipetta). Centrifugare la reazione per 1 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante. Ripetere la procedura per un totale di cinque lavamenti.
      AVVISO: il glicole fenile-polyetilene 4-nonyl è tossico e può causare irritazione della pelle e degli occhi. Utilizzare guanti, paraocchi e protezione del paravisore.
    12. Aggiungere alle perline 50 -L di 2x tampone Laemmli integrato con 710 mM 2-mercaptoetanolo e mescolare toccando o vortice per eluire le proteine. Riscaldare a 95 gradi centigradi per 5 minuti, quindi centrifugare per 10.000 x g per 1 min e raccogliere il supernatante (contengono proteine eluite). In alternativa, le proteine in elute con 8 M urea/100 mM glicina pH 2.9 per evitare l'uso di SDS. Congelare l'eluato a -80 gradi centigradi, altrimenti procedere all'analisi della macchia occidentale.
      AVVISO: 2-mercaptoetanolo è tossico e può causare irritazioni cutanee, oculari e respiratorie. Utilizzare guanti e lavorare nella cappa chimica.
  2. Analisi del gonfiore occidentale
    1. Mescolare 15 campioni di input (dal punto 1.1.6) o di flusso (dal punto 1.1.10) con 5 di 4x Buffer Laemmli. Ingressi di calore e campioni di flusso per 5 minuti a 95 gradi centigradi. Per i campioni eluiti in 8 M urea/100 mM pH 2,9, mescolare 15 l di eluato con 5 - L di 4x laemmli tampone, e riscaldare per 5 min a 95 gradi centigradi.
      NOTA: questo passaggio non è necessario per i campioni eluiti nel buffer 2x Laemmli.
    2. Carichi pozzi di gel 4-20% SDS/PAGE con 2,5 litri di ingresso, 2,5 litri di flusso e 20 l di campioni eluiti, e carica la scala proteica secondo le raccomandazioni del produttore.
      NOTA: Scegliere gel% in base al peso molecolare della proteina di interesse.
    3. Eseguire SDS/PAGE a 150 V per 30-45 min nel buffer di corsa o fino a quando il colorante blu del buffer Laemmli è alla fine del gel.
      NOTA: il tempo di percorrezione può variare a seconda delle attrezzature di laboratorio.
    4. Rimuovere il gel dai piatti di vetro (o plastica) e immergere nel buffer di trasferimento per 15 min.
    5. Trasferire le proteine nella membrana di delfluoride polivichinidene (PVDF) o nella membrana di nitrocellulosa. Smussare le membrane e la carta filtranti da 3 mm nel buffer di trasferimento. Assemblare un panino con tre fogli di carta da filtro, nitrocellulosa o membrana PVDF, gel e altri tre fogli di carta da filtro. Assicurati che non ci siano bolle d'aria intrappolate nel panino. Utilizzare un rullo per rimuovere le bolle, se necessario. Impostare la membrana sul catodo e il gel sul lato anodo della cassetta.
      NOTA: Controllare le istruzioni del produttore della membrana per informazioni sull'attivazione della membrana o sulla preparazione delle macchie.
    6. Posizionare la cassetta contenente il panino nel serbatoio di trasferimento con tampone di trasferimento. Collocare il serbatoio in un secchio di ghiaccio o a 4 gradi centigradi (ad esempio, nella cella frigorifera). Trasferire le proteine a 100 V per 1 h (la corrente varia tra 200-400 mA). In alternativa, trasferire durante la notte a una corrente costante di 15 mA a 4 gradi centigradi.
    7. Rimuovere la membrana dalla cassetta. Incubare la membrana in latte secco non grasso del 6% diluito in PBS con lo 0,05% di polispoli 20 (PBS-T), o soluzione di blocco compatibile, per 1 h a RT per bloccare la membrana.
      NOTA: Prima di bloccare la membrana, la qualità del trasferimento può essere controllata utilizzando la macchia Ponceau S. Incubare la membrana per 1 min in 15 mL di Ponceau S, risciacquare in acqua e visualizzare bande.
    8. Rimuovere la soluzione di blocco e incubare la membrana per 1 h a RT con rotazione di 50 rpm negli anticorpi primari diluiti nel 6% di latte secco non grasso diluito in PBS-T. In alternativa, la membrana dell'incubatura durante la notte a 4 gradi centigradi con rotazione di 50 giri/min.
      NOTA: Il tempo di incubazione può variare a seconda della qualità degli anticorpi; tuttavia, la maggior parte degli anticorpi funziona con incubazioni di 1-3 h a RT. Seguire la raccomandazione del produttore per la concentrazione o la diluizione di anticorpi.
    9. Lavare la macchia incubando la membrana in PBS-T per 5 min con rotazione di 50 giri a RT. Ripetere la procedura 3-5 volte. A seconda della qualità degli anticorpi possono essere necessari più fusi.
    10. Incubare la membrana in rafano perossidasi (HRP) - anticorpi secondari coniugati per 1 h a RT in 6% latte secco non grasso diluito in PBS-T con rotazione di 50 rpm.
      NOTA: Seguire la raccomandazione del produttore per la concentrazione o la diluizione di anticorpi.
    11. Lavare la macchia come indicato al punto 1.2.9.
    12. Aggiungere il substrato chemiluminescente per coprire la membrana. Rimuovere l'eccesso di substrato e incubare per 5 min a RT al buio.
      NOTA: Consultare le istruzioni del produttore per le raccomandazioni sui reagenti chemiluminescenza.
    13. Acquisire il segnale chemiluminescente utilizzando un imager basato su fotocamera. In alternativa, utilizzare una pellicola a raggi X per catturare il segnale chemiluminescente.

2. Analisi delle proteine leganti IP/PI mediante cromatografia di affinità e spettrometria di massa

  1. Crescita cellulare, lisi e cromatografia di affinità
    1. Coltivano le cellule T. brucei fino alla fase intermedia del log e monitorano la vitalità e la densità delle cellule.
      NOTA: un totale di 1,0 x 1010 celle è sufficiente per due saggi vincolanti. L'uso di un numero inferiore di cellule di quanto indicato qui può influenzare il rilevamento di proteine a bassa abbondanza da parte della spettrometria di massa.
      1. Per le forme del flusso sanguigno T. brucei, far crescere le cellule a metà del log (8,0 x 105-1,6 x 106 cellule/mL) in supporti HMI-9 integrati con 10% FBS a 37 gradi centigradi e con 5% di CO2. Per 427 ceppo, 5 L di coltura produrrà 0,5-1,0 x 10100 cellule. Monitorare la crescita cellulare per evitare densità superiore a 1,8 x 106 cellule/mL che possono influenzare la vitalità delle cellule. Mantenere il volume di coltura cellulare a 1/10 del volume del pallone; in caso contrario, il tasso di crescita delle cellule sarà influenzato dalla scarsa aerazione.
        NOTA: Il ceppo 427 ha un tempo di raddoppio di 5,5-6,5 h.
      2. Per le forme procicliche, far crescere le cellule nel mezzo SDM-79 integrato con 10% FBS a 27 gradi centigradi e mantenere la densità delle cellule tra 1,0 x 107 e 3,0 x 107 celle/mL. 500 mL di coltura produrrà 0,5-1,5 x 1010 celle.
    2. Centrifugare le cellule a 1.600 x g per 15 min a RT. Scartare il supernatante e sospendere nuovamente il pellet in 200 mL di PBS-G preriscaldato a 37 gradi centigradi. Utilizzare tubi di centrifugazione a fondo rotondo (Tabella dei materiali) perché i pellet di forma sanguigna T. brucei sono facilmente disturbati quando si utilizzano rotori di centrifuga ad angolo fisso. Centrifugare nuovamente le cellule a 1.600 x g per 5 min a RT.
    3. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di PBS-G. Centrifugare le cellule a 1.600 x g per 5 min a RT. Ripetere la procedura e dopo il lavaggio finale, scartare il supernatante.
      NOTA: I pellet possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 o azoto liquido.
    4. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi pre-raffreddato nel ghiaccio e integrato con 1.5x cocktail inibitore proteasi e 1x cocktail inibitore di fosfofosi (Tabella dei materiali). Incubare il lisato per 10 min a 4 gradi centigradi ruotando a 50 giri/m.
    5. Centrifugare il lisato a 10.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere il supernatante (proteine solubilizzate) e diluirlo in 20 mL di tampone di legame.
    6. Raccogliere 400 PP di IP o PI coniugati a perline di agarose (cioè 400 l di liquami) o 400 l di perline di controllo, e centrifugare per 1 min a 1.000 x g a RT. Scartare il supernatante e ripartire in 400 : L di legatura equilibrata per legarsi le perline. Utilizzare perline di agarose come controllo negativo per determinare l'arricchimento specifico delle interazioni proteina-metabolita rispetto alle interazioni non specifiche (ad esempio, proteine che si legano in modo non specifico alle perline). Utilizzare IP o PI con diverse configurazioni fosfatiche, tra cui forme non fosforerate per controllare le interazioni non specifiche dovute a cariche di fosfato o legame alla biotina.
    7. Aggiungere 400 l di IP/PI-perline o controllare perline a 10 mL di lisa e incubate per 1 h, o durante la notte, a 4 gradi centigradi ruotando a 50 giri/. Se si utilizzano IP o PI coniugati solo con biotina (senza perline) procedere al passaggio 2.1.7.1, altrimenti procedere al passaggio 2.1.8.
      1. Aggiungete 100 l di streptavidina a perline magnetiche e incubate per 1 h a 4 gradi rotanti a 50 giri/min.
    8. Centrifugare la reazione di legame per 1 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi. Rimuovere il supernatante (flow-through) e mantenere il pellet. Mantenere il 5% del supernatante per l'analisi delle macchie occidentali.
    9. Aggiungere 5 mL di tampone di lavaggio al pellet, mescolare delicatamente ruotando il tubo, quindi centrificare per 1 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Ripetere il lavaggio cinque volte. Se si utilizzano perline magnetiche, raccogliere i supernatanti ed eseguire fusti con un supporto magnetico (le centrifughe non sono necessarie).
    10. Aggiungere 50 l di 2x laemmli buffer (o 8 M urea/100 mM pH 2.9, per evitare di utilizzare SDS) alle perline e mescolare toccando o vortice (evitare la pipetta perché le perline possono attaccarsi alle punte della pipetta), quindi riscaldare a 95 mC per 5 min. Centrifuge per 10.000 x g per 1min min e raccogliere il supernatante (proteine eluite). Ripetere la procedura due volte per raccogliere un totale di tre frazioni.
    11. Congelare l'eluate a -80 gradi centigradi, altrimenti separare le proteine in SDS/PAGE o tenere in soluzione per la prova di tentativizzazione e l'analisi della spettrometria di massa.
  2. Digestione di proteine della metapessia per la spettrometria di massa
    NOTA: per la sezione 2.2.1 (in gel) o la sezione 2.2.2 (nella soluzione) sono mostrate due varianti di questa procedura per la digestione delle proteine da parte della sezione 2.2.1 (in soluzione). Si raccomandano tubi a basso legame proteico per evitare perdite di campioni. Consultare un chimico analitico presso la struttura proteomica l'idoneità del protocollo per campioni e strumenti spettrometri di massa disponibili.
    1. In gel come prova delle proteine
      1. Dopo la separazione delle proteine in SDS/PAGE, sciacquare brevemente il gel in acqua ad alta purezza. Trasferire il gel su una lastra di vetro pulita. Accisa fasce proteiche con una lama pulita ed evita di tagliare bande extra di gel all'esterno. Tagliare i pezzi di gel a pezzetti (cioè circa 1 mm quadrati) e trasferirli in un tubo da 1 mL. Se necessario, utilizzare una punta di pipetta, ma assicurarsi che la punta della pipetta sia sciacquata in etanolo prima dell'uso.
        NOTA: Utilizzare i guanti per evitare la contaminazione da gel. I pezzi di gel possono essere conservati a -20 gradi centigradi.
      2. Aggiungere 100 l l di acqua di qualità cromatografica liquida ad alta purezza o ad alte prestazioni ai tubi per risciacquare i pezzi di gel. Scartare l'acqua.
        1. Per i pezzi di gel macchiato fluorescente a base di Coomassie o rutenio, incubare i pezzi di gel in soluzione di destaining (25 mM NH4HCO3 nel 50% acetonitrile) per 1 h, quindi scartare la soluzione. Ripetere la procedura fino a quando la colorazione non è visibile.
          NOTA: Preparare soluzioni contenenti NH4HCO3 mediante diluizione da una soluzione stock a 100 mMM NH4HCO3, pH 7.8.
          AVVISO: L'acetonitrile è un solvente volatile, infiammabile e tossico. NH4HCO3 può causare irritazione della pelle o degli occhi. Utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa chimica.
        2. Per i pezzi di gel macchiato d'argento, incubare i pezzi di gel in 50 gradi di soluzione di destaining per la macchia d'argento (15 mM K3[Fe(CN)6], 50 mM Na2S2O3) in acqua per 30 m. Scartare la soluzione e lavare i pezzi di gel con 200 di acqua. Ripetere lavare cinque volte o fino a quando il colore giallo gel non è visibile.
          AVVISO: K3[Fe(CN)6] può causare irritazione cutanea o oculare. Usa i guanti.
      3. Disidratare i pezzi di gel utilizzando 200 o L di acetonitrile per 10 min a RT. Quindi, eliminare la soluzione.
        NOTA: I pezzi di gel disidratati sono più piccoli in volume, opachi e di cattivo gusto. Se diversi pezzi di gel sono combinati in un tubo, ripetere la procedura per una disidratazione efficiente dei pezzi di gel.
      4. Aggiungere 50 l (o abbastanza volume per coprire i pezzi di gel) di soluzione di riduzione (10 mm dithiothreitol [DTT] in 100 mM NH4HCO3) e incubare a 56 gradi C per 1 h. Successivamente, raffreddare i tubi in RT e scartare l'eccesso di soluzione di riduzione.
      5. Aggiungere 50 l (o abbastanza volume per coprire i pezzi di gel) della soluzione di alchilazione (50 mM iodoacetamide in 100 mM NH4HCO3) e incubare per 30 min a RT al buio. Successivamente, scartare l'eccesso di soluzione di alchilazione.
      6. Disidratare i pezzi di gel con 200 o L di acetonitrile per 10 min a RT. Rimuovere l'acetonitrile e idratare i pezzi di gel con 100 mM NH4HCO3 per 10 min a RT.
      7. Disidratare nuovamente i pezzi di gel con 200 l di acetonitrile per 10 min a RT e scartare l'eccesso di soluzione.
      8. Aggiungere 15 -L di prova di grado di spettrometria di massa diluita in 50 mM NH4HCO3 tampone, o volume sufficiente per coprire i pezzi di gel idratati e incubare per 4 h, o durante la notte, a 37 . Mantenere quantità totali di metapsino tra 100 a 500 ng (o 20 ng trypsin/ g di proteine).
      9. Raffreddare il campione a RT e centrifugare per 1 min a 2.000 x g in una microcentrifuga. Aggiungere 10-20 L del 5% di acido formica diluito in acqua e incubare per 10 min a RT.
        AVVISO: L'acido formico è infiammabile, corrosivo e tossico. Utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa chimica.
      10. Centrifuga come indicato al punto 2.2.1.9, quindi raccogliere il super-natore (contengono peptidi estratti) in un tubo diverso. Aggiungere al tubo 20 - L del 5% di acido formica diluito nel 50-60% di acetonitrile e incubare per 10 min a RT. Raccogliere le frazioni di peptidi estratte nello stesso tubo.
      11. Asciugare il campione in un concentratore di vuoto e ricostituire in 10 :L dello 0,5% di acido acetico e 2% acetonitrile per l'analisi della spettrometria di massa. Centrifugare e raccogliere la soluzione nella parte inferiore del tubo; soluzione di memorizzazione a -20 o -80 gradi centigradi.
    2. In soluzione di propsinizzazione delle proteine
      1. Proteine precipitanti per ridurre il volume del campione, la dissalazione e lo scambio di tamponamento. Aggiungere al campione sei volumi di acetone refrigerato (-20 gradi centigradi), ad esempio da 600 a 100 gradi l di campione. Vortice e incubare a -20 gradi centigradi per 15 min a 1 h. La soluzione diventerà nuvolosa o formerà un precipitato.
        ACETone: L'acetone è tossico e infiammabile. Utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa chimica.
      2. Centrifuga a 4 gradi centigradi per 30 min. Decant l'acetone e asciuga il pellet ad aria per 15 min.
      3. Aggiungere 10 -L di 7-8 M di urea o 1% SDS in 50 mM NH4HCO3 per sciogliere il pellet e vortice da mescolare. Per grandi quantità di proteine (> 10 g), utilizzare fino a 20 gradi di tampone di dissoluzione.
      4. Aggiungere 5 l di soluzione di riduzione e vortice. Abbassare il volume utilizzando una microcentrifuga. Se i campioni vengono diluiti in urea, incubare per 1 h a RT. Se i campioni vengono diluiti in SDS, incubati per 1 h a 56 gradi centigradi.
      5. Abbassare il volume utilizzando una microcentrifuga. Aggiungere 3 -L di soluzione di alchilazione e vortice. Quindi, ruotare il volume verso il basso e incubare al buio per 30 min a RT.
      6. Aggiungere 3 -L di soluzione di riduzione per neutralizzare la reazione. Diluire lentamente il campione a 1 M di urea o 0,05% SDS utilizzando 50 mM NH4HCO3.
        NOTA: il tampone di digestione della trypsin deve avere detersivo o denaturante. I limiti di concentrazione per i denaturanti sono: 0,05% SDS; 0,1% ottuoso B-D-glucopyranoside; 0,1% 4-nonylphenyl-polyethylene glicole; 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol; 0,1% di polisoro20; 0,1% 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonato; < 1 M urea o thiourea.
      7. Aggiungere 5 -L di prova di grado di spettrometria di massa diluita in 50 mM NH4HCO3 tampone e incubare per 4 h, o durante la notte, a 37 . Mantenere quantità totali di cipina tra 100 e 500 ng (o 20 ng trypsin/ g di proteine).
      8. Raffreddare il campione in RT e ruotare il volume verso il basso utilizzando una microcentrifuga. Aggiungere il 5% di acido acetico (o il 5% di acido formico nel 50% di acetonitrile) per placare la reazione.
      9. Asciugare i campioni in un concentratore di vuoto come indicato al punto 2.2.1.11. Conservare i campioni a -80 gradi centigradi. Disalare e concentrare i peptidi utilizzando una colonna di fase invertita come C18 punta zip e quindi analizzare per spettrometria di massa.

Risultati

Analisi dell'interazione RAP1 e PI(3,4,5)P3 mediante cromatografia di affinità e gonfiore occidentale
In questo esempio viene illustrata l'applicazione di questo metodo per analizzare l'associazione di PI da RAP1 da T. brucei lysate o dalla proteina ricombinante T. brucei RAP1. Lysates di T. brucei forme di flusso sanguigno che esprimono emagglutinina (HA) taggato RAP1 sono stati utilizzati nei saggi vincolanti. RAP1 è una proteina coinvolta nel controllo trascrizionale de...

Discussione

L'identificazione di proteine che si legano a IP o PI è fondamentale per comprendere la funzione cellulare di questi metaboliti. La cromatografia di affinità abbinata alla spettrometria di massa o macchia occidentale offre l'opportunità di identificare le proteine interagenti IP o PI e quindi di ottenere informazioni sulla loro funzione regolatoria. IP o PI etichettati chimicamente [ad esempio, Ins(1,4,5)P3 chimicamente collegati alla biotina] e incrociati alle perline di agarose tramite streptavidina o catturati da p...

Divulgazioni

L'autore non ha nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch Supplemento per i ricercatori all'inizio della carriera (DGECR-2019-00081) e dalla McGill University.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneSigma-Aldrich650501Ketone
AcetonitrileSigma-Aldrich271004Solvent 
Ammonium bicarbonateSigma-AldrichA6141Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MIBeckman CoulterAvanti J6-MICentrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botlesSigma-AldrichB1408Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control BeadsEchelonP-B000-1mlAffinity chromatography reagent - control
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad1610610Reducing agent
Dynabeads M-270 StreptavidinThermoFisher Scientific65305Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001Protease inhibitors
Electrophoresis running bufferBio-Rad161073225 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesCorning Life Sciences430052To centrifuge 10 mL cultures
Formic acidSigma-Aldrich106526Acid
GlycineSigma-AldrichG7126Amino acid
HMI-9 cell culture mediumThermoFisher ScientificME110145P1Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein StainThermoFisher Scientific24615Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 BeadsEchelonQ-B0145-1mlAffinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry MilkThomas ScientificC837M64Blocking reagent for Western blotting
IodoacetamideSigma-AldrichI6125Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab RotatorThomas Scientific1159Z92For binding assays
LoBind Microcentrifuge TubesThermoFisher Scientific13-698-793Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630)Sigma-Aldrich21-3277Detergent
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010031Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescenceThermoFisher Scientific32106Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail TabletsRoche4906845001Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP BeadsEchelonP-B003a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP BeadsEchelonP-B034a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8EchelonP-3908-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP BeadsEchelonP-B345a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B035a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP BeadsEchelonP-B004a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8EchelonP-4508-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B045a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP BeadsEchelonP-B005a-1mlAffinity chromatography reagent 
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III)Sigma-Aldrich702587Potassium salt 
PtdIns PIP BeadsEchelonP-B001-1mlAffinity chromatography reagent 
PVDF MembraneBio-Rad1620177For Western blotting 
Refrigerated centrifugeEppendorf5910 RMicrocentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich862010Detergent
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich72049Chemical 
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermoFisher ScientificSPD120-115Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture ThermoFisher Scientific159910To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry GradePromegaV5280Trypsin for protein digestion
UreaSigma-AldrichU5128Denaturing reagent
VortexFisher Scientific02-215-418For mixing reactions
Western blotting transfer bufferBio-Rad161073425 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paperSigma-AldrichWHA3030861Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M)Bio-Rad1610710Reducing agent
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561094Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0747Protein loading buffer

Riferimenti

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