JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Özet

İnositol Fosfatlar ve fosfoinositidler, gen ifadesi, vezikül kaçakçılığı, sinyal iletimi, metabolizma ve gelişim dahil olmak üzere Ökaryotlar içinde çeşitli hücresel süreçleri düzenler. Bu metabolitler proteinlere bağlayarak, böylece protein konformasyonu, katalitik aktivite ve/veya etkileşimleri değiştirerek bu düzenleyici aktivite gerçekleştirin. Burada açıklanan yöntem, Inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile etkileşimde bulunan proteinleri belirlemek için kütle spektrometresi veya Batı blomlamaya bağlı benzeşme Kromatografi kullanır. İnositol fosfatlar veya fosfoinositidler kimyasal olarak biotin ile etiketlenmiştir, bu da agaroz veya manyetik boncuklar için conjuated streptavidin aracılığıyla yakalanan. Proteinlerin metabolite bağlanması onların yakınlık tarafından izole edilir, sonra elüe ve kütle spektrometresi ya da Batı lekeleme tarafından tanımlanır. Yöntem hassasiyet ile protein ve metabolit etkileşimi analizini destekleyen, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome-ücretsiz ve özelleştirilebilir basit bir iş akışı vardır. Bu yaklaşım, kompleks biyolojik örneklerde veya arıtılmış proteinleri kullanarak protein-metabolit etkileşimlerini belirlemek için etiketsiz veya amino asit etiketli nicel kütle spektrometresi yöntemlerinde kullanılabilir. Bu protokol tripanosoma bruceiproteinleri analizi için optimize edilmiştir, ancak ilgili protozoon parazitleri, Maya veya memeliyen hücrelere adapte edilebilir.

Giriş

İnositol fosfat (IPS) ve phosphoinositides (PIS) gen ifadesi1,2,3, vezikül kaçakçılığı kontrolü gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesi yoluyla ökaryote biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır 4, sinyal dönüştürücü5,6, metabolizma7,8,9, ve geliştirme8,10. Bu metabolitlerin düzenleyici fonksiyonu proteinlerle etkileşim ve böylece protein fonksiyonunu düzenleyen yeteneğinden sonuçlanır. Proteinler tarafından bağlayıcı üzerine, IPS ve protein konformasyonu11değiştirebilir, katalitik aktivite12, veya etkileşimler13 ve dolayısıyla hücresel fonksiyonunu etkiler. IPS ve, Nucleus2,3,14,15, endoplazmik retikulum16,17, Plasma gibi birden fazla alt hücreli bölmeler halinde dağıtılır membran1 ve sitsol18, proteinlerle ilişkili3,19 veya Rnas20.

Membran ile ilişkili PI (4, 5) P2 fosfolipase C tarafından pedi (1, 4, 5) P3, hangi fosforilize edilebilir veya IP kinazları ve fosfatlar tarafından dephosphorylated, sırasıyla. IPS, proteinlere bağlanan ve düzenleyici fonksiyonları destekleyen çözünebilir moleküllerdir. Örneğin, INS (1, 4, 5) Metazoan P3 IP1 reseptörleri bağlayıcı tarafından ikinci bir haberci olarak hareket edebilir, hangi reseptör Konformasyonel değişiklikleri ve böylece CA serbest bırakmak2 + hücre içi mağazalardan11. INS (1, 3, 4, 5) P4 histon deasetilaz kompleksine bağlanır ve protein kompleksi montajı ve aktivite13düzenler. IPS düzenleyici fonksiyon diğer örnekler kromatin organizasyon21, RNA taşıma22,23, RNA düzenleme24ve transkripsiyon1,2,3 kontrolü içerir . Buna karşılık, genellikle plazma membranı veya organel membranlara protein alımı ile ilişkilidir25. Ancak, 'in gelişmekte olan bir özelliği, membran olmayan bir ortamda proteinleri ile ilişkilendirmek için yeteneğidir3,15,19,26. Bu nükleer reseptör steroidojenik faktör olduğunu, hangi transkripsiyonel kontrol fonksiyonu Pi tarafından düzenlenir (3, 4, 5) P319, ve poli-A polimeraz hangi enzimatik aktivite nükleer PI tarafından düzenlenir (4, 5) P226. IP 'ler ve için bir düzenleyici rol Maya22,27, mammalin hücreleri19,23, Drosophila10 ve Worms28dahil olmak üzere birçok organizmalarda gösterildi. Önemli olan bu metabolitlerin Tripanozomlar içinde rolüdür, bu da erken ökaryotik soydan uzaklaşır. Bu metabolitler tripanosoma brucei transkripsiyonel kontrol1,3, geliştirme8, organel Biyogenez ve protein trafiği önemli bir rol oynar29,30 , 31 , 32ve aynı zamanda patojenler T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 ve Plasmodium geliştirme ve enfeksiyon kontrol dahil edilir 5 , 37. bu nedenle, tripanosomlar içinde IPS ve rolünü anlamak bu moleküller için yeni biyolojik fonksiyon aydınlatmak ve Roman uyuşturucu hedeflerini belirlemek için yardımcı olabilir.

Protein ve IP veya PI bağlamanın özgüllüğü, protein etkileşimindeki etki alanlarına ve Inositol13'ün fosforilasyon durumuna bağlıdır,38, Ayrıca, lipid parçası ile etkileşimler de19oluşur. Çeşitli IPS ve ve onların değiştirme kinazlar ve fosfatları metabolit kullanılabilirliği ve bolluk, inositol fosforilasyon durumu ve protein etkilenir protein fonksiyonunu kontrol etmek için esnek bir hücresel mekanizma sağlar etkileşimin benzeşimi1,3,13,38. Bazı protein alanları iyi karakterize olmasına rağmen39,40,41, örn., pleckstrin Homoloji Domain42 ve SPX (SYG1/Pho81/XPR1) Domains43 ,44,45, bazı proteinler IPS veya ile bilinmeyen mekanizmalar tarafından etkileşimde. Örneğin, T. brucei 'nin baskıcı aktivatör proteini 1 (RAP1) standart Pi-bağlayıcı etki alanlarına sahip değildir, ancak Pi (3, 4, 5) P3 ile etkileşime girer ve antijenik varyasyona katılan genlerin kontrol transkripsiyonu3. Trypanosome, Maya veya memelilerin hücrelerinden IP veya Pi etkileşen proteinlerin benzeşme Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi, bilinen IP veya PI bağlama etki alanları olmadan çeşitli proteinleri tespit etti8,46, 47. Data, bu metabolitleri bağlayan ek karakterize olmayan protein alanları önerir. Bu nedenle, IPS veya ile etkileşim proteinlerin tanımlanması, bu küçük moleküller için protein-metabolit etkileşimi ve yeni hücresel düzenleyici fonksiyonların roman mekanizmaları ortaya çıkarabilir.

Burada açıklanan yöntem, IPS veya 'e bağlanan proteinleri belirlemek için Batı blo, veya kütle spektrometresi ile birleşen benzeşme Kromatografi kullanır. Bu ya da çapraz bağlı streptavidin agaroz boncuk ya da alternatif olarak, streptavidin-konjuik manyetik boncuklar üzerinden yakalanan konjuik olan biyotinlenmiş IPS veya kullanır (Şekil 1). Bu yöntem, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome içermeyen basit bir iş akışını sağlar ve proteinlerin hücre endoglikozidazları veya arıtılmış proteinleri3 'ü (Şekil 2) bağlamasını tespit etmek için uygundur. Yöntem, etiket içermeyen8,46 veya karmaşık biyolojik örneklerden IP veya PI bağlama proteinlerini tanımlamak için amino asit etiketli nicel Kütle Spektrometrisi47 ile birleştiğinde kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem birkaç Yöntemler hücresel proteinleri ile IPS veya etkileşimi incelemek için kullanılabilir bir alternatiftir ve bu metabolitlerin tripanosomlar ve belki de diğer Ökaryotlar düzenleyici işlevini anlamada yardımcı olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. yakınlık Kromatografi ve Batı lekeleme tarafından IP-veya PI-bağlayıcı proteinlerin Analizi

  1. Hücre büyümesi, lizis ve yakınlık Kromatografi
    1. Orta günlük faz ve monitör hücre canlılığı ve yoğunluk T. brucei hücreleri büyümek. Toplam 5,0 x 107 hücre bir bağlayıcı tahlil için yeterlidir.
      1. Kan akışı formları için, 37 °C ve% 5 CO2' de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilen HMI-9 medyadaki hücreleri büyütün. 8,0 arasında hücre yoğunluğu tutun x 105 için 1,6 x 106 hücreler/ml.
        Not: 1,8 x 106 hücre/ml 'Den yüksek yoğunluk, hücre viability etkileyebilir. İki katına- T. brucei 427 gerinim in vitro yetiştirilen zaman 5,5 ve 6,5 h arasındadır.
      2. Procyclic formlar için, hücreleri Grow SDM-79 Orta 27 °C% 10 FBS ile tamamlayıcı ve 1,0 x 107 ve 3,0 x 107 hücreler/ml arasında hücre yoğunluğu tutmak.
      3. Arıtılmış proteinler için (örn. rekombinant proteinler), 450 μL bağlayıcı tampon (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl fenil-Polietilen glikol, pH 7,4) içinde 1 μg protein ve seyreltme 0,5 almak. Batı leke analizi için seyreltilmiş proteinin (girişin)% 5 'ini saklayın. 1.1.7 adıma geçin.
    2. 1.600 x g , Oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 10 dakika santrifüj hücreleri. Süpernatant atın.
      Not: büyük kültür birimlerin santrifüjleme hakkında ek bilgi için adım 2.1.2 bakın.
    3. 10 ml fosfat tampon tuz içinde Pelet yavaşça pelletini pH 7,4 6 mm glikoz (PBS-G) ile tamamlayıcı ve 37 °c ' de önceden ısıtılan hücreleri yıkamak için. Sonra, hücre santrifüjler 1.600 x g 5 dk için RT. prosedürü Iki kez tekrarlayın.
    4. PBS-G 1 ml içinde Pelet resuspend. Ardından, hacmi 1,5 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve 1.600 x g 'de Santrifüjü 5 dakika boyunca atın.
      Not: hücre pelalları sıvı nitrojen içinde dondurulur ve-80 °C veya sıvı nitrojen olarak saklanır.
    5. 0,5 ml lizis tampon (25 mm HEPES, 150 mm NaCl, 1% t-oktylphenoxypolithoxyethanol, pH 7,4) içinde Pelet resuspend 1,5 x proteaz inhibitörü kokteyl ve 1x fosfataz inhibitörü kokteyl (malzeme tablosu) ön-buz içinde soğutulmuş hücrelerde Lyse. 50 RPM 'de 4 °C ' de 10 dakika dönen lysate inküye yapın.
      Not: Bu kritik bir adımdır çünkü proteinler belirtildiği gibi işlenmezse düşebilir. Sodyum Dodesil sülfat-Poliakrilamid jel elektroforezi (SDS/sayfa) ile protein lysate bütünlüğünü kontrol edin.
      DIKKAT: T-oktylphenoxypolithoxyethanol toksik ve cilt ve göz tahrişi neden olabilir. Kullanım eldiven, Eyeshield ve faceshield koruma.
    6. 4 °C ' de 10 dakika için 14.000 x g 'de lysate Santrifüjü. Bağlayıcı assays için yeni bir 1,5 ml tüp içine süpernatant toplayın. Western blot analizi için toplam lysate (giriş)% 5 ' i tutun. Süpernatant lizis tampon ile çıkarılan parazit proteinleri içerir.
    7. Agaroz boncuklarla (örn. 50 μL Bulamaç) ya da 50 μL agaroz boncuklar için konjuge edilen 50 μL IP veya 'i toplayın ve 1.000 x g'de 1 dakika santrifüje gidin. 50 μL 'de süpernatant ve pelletini 'i atın ve boncuklar için bağlayıcı tampon tamponu yapın. Kontrol olarak konjugated olmayan boncuklar kullanın. Spesifik olmayan etkileşimleri kontrol etmek için fosforsuz formlar dahil olmak üzere farklı fosfat konfigürasyonu ile IP/PI-boncuk kullanın.
    8. 50 μL IP veya PI-boncuk hücre lysate veya arıtılmış proteinler ekleyin (her 1 mL boncuk 10 nmol konjuate IPS veya içerir). IP veya PI-boncuk hacmini toplam lysate% 10 içinde tutun ve gerekirse, bağlayıcı reaksiyonu hacmi bağlayıcı tampon ile ayarlayın.
      1. Rekabet assays için, bağlayıcı reaksiyon non-konjugated IPS veya çeşitli konsantrasyonları ekleyin (örneğin, 1-, 10-, 100-Fold molar fazla IP veya PI-boncuk karşılaştırıldığında).
    9. Reaksiyonu 4 °C ' de 1 saat veya gecede, 50 RPM 'de döner.
      Not: proteinin kararlılığına bağlı olarak, arıtılmış proteinler ile bağlayıcı reaksiyonlar RT 'de yapılabilir. IPS veya kullanarak biotin sadece adım 1.1.9.1 devam konjugated, aksi takdirde adım 1.1.10 devam ederseniz.
      1. Ekleme 50 μL streptavidin-manyetik boncuklar bağlayıcı reaksiyon için konjuate ve 1 h için 4 °C ' de 50 RPM 'de dönen Inkük.
    10. 4 °C ' de 1.000 x g 'de 1 dak için karışımı Santrifüjü. Süpernatant çıkarın (akış-through) ve Pelet tutun. Western leke analizi için süpernatant% 5 tutun.
      Not: manyetik boncuk kullanıyorsanız, süper natantları çıkarın ve bir manyetik standı kullanarak sonraki yıkanmaları gerçekleştirin (santrifüjler gerekli değildir).
    11. 1 ml yıkama tamponu (25 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,2% 4-nonyl fenil-Polietilen glikol, pH 7,4) ekleyin ve tüpü dokunarak veya tıkayarak reçineyi pelletini (boncuk pipet uçları takabilir çünkü pipet kullanmayın). 4 °C ' de 1.000 x g 'de 1 dakika için reaksiyonu santrifüjün ve supernatant atın. Toplam beş yıkanıyor için yordamı tekrarlayın.
      DIKKAT: 4-nonyl fenil-Polietilen glikol toksik ve cilt ve göz tahrişi neden olabilir. Kullanım eldiven, Eyeshield ve faceshield koruma.
    12. Ekleme 50 μL 2x Laemmli tampon ile Takviyeler 710 mM 2-mercaptoethanol boncuklar ve mix dokunarak veya girdap proteinleri elute. Isı 95 °c 5 dakika için, daha sonra 1 dakika için 10.000 x g için Santrifüjü ve süpernatant toplamak (içerilmiş proteinler içerir). Alternatif olarak, SDS kullanmaktan kaçınmak için 8 M Urea/100 mm glisin pH 2,9 ile elute proteinleri. -80 °c ' de yıkantıdaki 'i dondurur, aksi takdirde Batı leke analizine devam edin.
      DIKKAT: 2-mercaptoetanol toksik ve cilt, göz ve solunum tahrikine neden olabilir. Eldiven kullanın ve kimyasal kaput içinde çalışın.
  2. Western blot Analizi
    1. 5 μL 4X Laemmli tampon ile 15 μL giriş (adım 1.1.6) veya akış yoluyla (adım 1.1.10) örneklerle karıştırın. 95 °C ' de 5 dakikalık ısı girişi ve akış örnekleri. 8 M Urea/100 mm glisin pH 2,9 olarak oluşturulan örneklere göre, 5 μL 4X laemmli tampon ile 15 μL ' lik bir karıştırma ve 95 °c ' de 5 dakika ısıtın.
      Not: Bu adım, 2x laemmli arabelleğinde elüe örnekleri için gerekli değildir.
    2. 4-20% sds/page jel, 2,5 μL giriş, 2,5 μL debi-through ve 20 μl elüe numune ile yük kuyuları ve üreticinin tavsiyesine göre yük proteini merdiven.
      Not: faiz proteininin moleküler ağırlığına göre% jel seçin.
    3. Çalışan tampon içinde 30-45 dk için 150 V 'de SDS/PAGE çalıştırın veya Laemmli tampon mavi boya jel sonunda kadar.
      Not: çalışma süresi laboratuar ekipmanına göre değişebilir.
    4. Jeli cam (veya plastik) plakalardan çıkarın ve 15 dakika boyunca transfer tamponunun içine çekin.
    5. Proteinleri Poliviniliden diflorür (PVDF) membran veya nitroselüloz membrandan aktarın. Transfer tamponunun içinde membran ve 3 mm filtre kağıdı çekin. Üç yaprak filtre kağıdı, nitroselüloz veya PVDF membran, jel ve ek bir üç yaprak filtre kağıdı ile bir sandviç birleştirin. Hiçbir hava kabarcıkları sandviç sıkışmış olduğundan emin olun. Gerekirse kabarcıkları kaldırmak için bir silindir kullanın. Kasetin anot tarafındaki katot ve jel üzerindeki membranı ayarlayın.
      Not: membran aktivasyonu veya leke hazırlama hakkında bilgi için membran üreticisinin talimatlarını kontrol edin.
    6. Transfer tamponu ile sandviç içeren kaseti transfer tankına yerleştirin. Tankı bir buz kovasına veya 4 °C ' ye (örn. soğuk odada) yerleştirin. 100 V 'de 1 h için transfer proteinleri (akım 200-400 mA arasında değişmektedir). Alternatif olarak, gece 4 °C ' de 15 mA sabit akımı ile transfer edilir.
    7. Zarı kasetten çıkarın. Membranı bloke etmek için RT 'de 1 saat boyunca% 0,05 polisorbat 20 (PBS-T) veya uyumlu engelleme çözeltisi ile PBS 'de seyreltilmiş% 6 yağ içermeyen kuru sütte membran kuluçta yapın.
      Not: membranı engellemeden önce, transferin kalitesi Ponceau S lekesi kullanılarak kontrol edilebilir. Membranı 15 mL Ponceau S 'de 1 dakika boyunca inküye, suda durulayın ve bantları görselleştirin.
    8. Engelleme çözümünü çıkarın ve PBS-T ' d e seyreltilmiş% 6 yağ içermeyen kuru sütte seyreltilmiş primer antikorların 50 RPM dönüşü ile RT 'de 1 h için membranı inkük. Alternatif olarak, membran gece 4 °C ' de 50 RPM dönüşü ile Inküye.
      Not: inkübasyon süresi antikorların kalitesine göre farklılık gösterebilir; Ancak, çoğu antikorlar RT 1-3 h inkümleri ile çalışacaktır. antikor konsantrasyonu veya seyreltme için üreticinin tavsiyesini takip edin.
    9. RT 'de 50 RPM dönüşü ile 5 dakika boyunca PBS-T ' d e membran inküte ederek leke yıkayın. işlemi 3-5 kez tekrarlayın. Antikorların kalitesine bağlı olarak daha fazla yıkama gerekebilir.
    10. 50 RPM rotasyonlu PBS-T ' d e seyreltilmiş% 6 ' lık yağ olmayan kuru süt içinde RT 'de 1 h için konjutik peroksidaz (HRP)-Conjugated Secondary antikorlar içinde membranı kulbe etme.
      Not: antikor konsantrasyonu veya seyreltme için üreticinin tavsiyesini takip edin.
    11. 1.2.9 adımda belirtildiği gibi yıkama leke.
    12. Membranı kapsayacak şekilde kemiluminesans substrat ekleyin. Substrat fazlalığını çıkarın ve karanlıkta RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın.
      Not: kemiluminans reaktifleri hakkında öneriler için üreticinin talimatlarını kontrol edin.
    13. Kamera tabanlı bir görüntüleştirici kullanarak kemiluminesans sinyali yakalayın. Alternatif olarak, chemiluminesans sinyali yakalamak için bir X-ışını filmi kullanın.

2. ilgi Kromatografi ve kütle spektrometresi ile IP/PI-bağlayıcı proteinlerin Analizi

  1. Hücre büyümesi, lizis ve yakınlık Kromatografi
    1. Orta günlük faz ve monitör hücre canlılığı ve yoğunluk T. brucei hücreleri büyümek.
      Not: toplam 1,0 x 1010 hücre, iki bağlama açıklaması için yeterlidir. Burada belirtilenden daha az hücre kullanmak, kütle spektrometresi tarafından düşük bolluk proteinlerinin algılanmasını etkileyebilir.
      1. T. brucei kan akışı formları için, 37 °c ' de% 10 FBS ve% 5 Co2ile desteklenen HMI-9 medyasında (8,0 x 105-1,6 x 106 hücre/ml) günlük orta faz hücrelerini büyütün. 427 gerilme için 5 L kültür 0.5-1.0 x 1010 hücre verecektir. 1,8 x 106 hücre/ml hücre viability etkileyebilir daha yüksek yoğunluk önlemek için hücre büyümesini izleyin. Hücre kültürü hacmi 1/10 için Flask hacmi tutun; Aksi takdirde, hücrelerin büyüme oranı kötü havalandırma nedeniyle etkilenecektir.
        Not: 427 gerilme 5.5-6.5 h ikiye katlama süresi vardır.
      2. Procyclic formlar için, hücreleri Grow SDM-79 Orta 27 °C% 10 FBS ile tamamlayıcı ve 1,0 x 107 ve 3,0 x 107 hücreler/ml arasında hücre yoğunluğu tutmak. 500 mL kültür 0.5-1,5 x 1010 hücre verecektir.
    2. 1.600 x g 'deki hücreleri RT 'de 15 dakika boyunca santrifüjün. süpernatant 'ı atın ve 200 ml 'lik PBS-g ' d a k i, 37 °c ' de önceden ısıtılan Pelet ile pelletini. Yuvarlak alt santrifüjleme tüpleri (malzeme tablosu) kullanın, çünkü T. brucei kan akışı formu Pelet sabit açılı santrifüj rotorlar kullanıldığında kolayca rahatsız edilir. Hücreleri 1.600 x g 'de yeniden SANTRIFÜJLER, RT 'de 5 dk.
    3. Süpernatant kaldırmak ve PBS-G 10 ml Pelet pelletini. Hücre santrifüjler 1.600 x g 'de 5 dakıka için RT. prosedürü tekrarlayın ve son yıkamadan sonra supernatant atın.
      Not: Peleler sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve-80 °C veya sıvı nitrojen olarak saklanan flaş olabilir.
    4. 30 mL Liz tamponu içinde hücre peleti, buzda önceden soğutulmuş ve 1,5 x proteaz inhibitörü kokteyli ve 1x fosfataz inhibitörü kokteyli (malzeme tablosu) ile tamamlayıcı olarak yeniden resuspend. 50 RPM 'de 4 °C ' de dönen lysate 10 dak.
    5. 4 °C ' de 10 dakika için 10.000 x g 'de lysate Santrifüjü. Süpernatant (çözünen proteinleri) toplayın ve 20 ml bağlayıcı tampon içinde seyreltilir.
    6. Agaroz boncuklarla (örn. 400 μL Bulamaç) ya da 400 μL kontrol boncukları için konjuge edilen IPS veya 400 μL 'yi toplayın ve 400 RT 'de 1.000 x g 'de 1 dakika santrifüj yapın Spesifik olmayan etkileşimlere göre protein-metabolit etkileşimlerinin spesifik zenginleştirmesini belirlemek için agaroz boncukları negatif bir kontrol olarak kullanın (örn., özellikle boncuklara bağlayan proteinler). Fosfat ücretleri veya biotin bağlayıcı nedeniyle spesifik olmayan etkileşimler için kontrol etmek için non-phosphorylated formları da dahil olmak üzere farklı fosfat yapılandırmaları ile IPS veya kullanın.
    7. 400 μL IP/PI-boncuk veya kontrol boncukları 10 mL lysate ekleyin ve 1 saat veya bir gecede 4 °C ' de 50 devirde döner. Sadece biotin ile konjugated IPS veya kullanıyorsanız (boncuk olmadan) adım 2.1.7.1 devam, aksi takdirde adım 2.1.8 devam.
      1. 100 μL streptavidin ekleyin-manyetik boncuklar için konjuate ve 50 RPM 'de dönen 4 °C ' de 1 h için inkük.
    8. 1.000 x g 'de 4 °c ' de 1 dakika için bağlayıcı reaksiyonu Santrifüjü. Süpernatant çıkarın (akış-through) ve Pelet tutun. Western leke analizi için süpernatant% 5 tutun.
    9. Pelet için 5 ml yıkama tamponu ekleyin, tüpü dönen ile hafifçe karıştırın ve sonra 4 °c ' de 1.000 x g 'de 1 dakika Santrifüjüne gidin. Süpernatant atın. Yıkama beş kez tekrarlayın. Manyetik boncuk kullanıyorsanız, süpernatanlarında toplayın ve bir manyetik stand kullanarak yıkıyor gerçekleştirin (santrifüjler gerekli değildir).
    10. Ekle 50 μL 2x laemmli tampon (veya 8 M Urea/100 mm glisin pH 2,9, SDS kullanmaktan kaçınmak için) boncuklar ve mix dokunarak veya Vortex (boncuk pipet uçları ekleyebilirsiniz çünkü pipetleme kaçının), ve sonra ısı 95 ° c 5 dakika için. 1 dk için 10.000 x g Santrifüjü ve süpernatant (eluted proteinleri) toplamak. Üç kesirler toplam toplamak için iki kez yordamı yineleyin.
    11. -80 °C ' de devam edin, aksi takdirde SDS/PAGE 'de proteinleri ayırın veya tripsinizasyon ve kütle spektrometresi analizi için çözelti tutun.
  2. Kütle spektrometresi için proteinlerin tripsin sindirimi
    Not: Bu prosedürün Iki varyasyonları Bölüm 2.2.1 (jel) veya bölüm 2.2.2 (çözelti) proteinlerin sindirimi için gösterilir. Protein düşük bağlayıcı tüpler örnek kayıpları önlemek için tavsiye edilir. Proteomikler tesisinde bir analitik kimyager ile ilgili örnekler ve kitle spektrometresi enstrümanları için protokolün uyguniyetini inceleyin.
    1. Protein içinde-jel tripsinizasyon
      1. SDS/PAGE 'de protein ayrılması sonrasında, jeli yüksek saflıkta suda kısaca durulayın. Jel temiz bir cam plaka üzerine aktarın. Temiz bir bıçak ile tüketim proteini bantları ve dış bantları ekstra jel kesme kaçının. Küçük parçalara (örneğin, yaklaşık 1 mm kare) jel parçaları kesmek ve 1 mL tüp içine aktarmak. Gerekirse bir pipet ucu kullanın, ancak pipet ucunun kullanmadan önce etanol içinde Durulanmadan emin olun.
        Not: jel kontaminasyonunu önlemek için eldivenler kullanın. Jel parçaları-20 °C ' de saklanabilir.
      2. Jel parçalarını durulamak için tüplere yüksek saflıkta veya yüksek performanslı sıvı kromatografi sınıfı su 100 μL ekleyin. Suyu atın.
        1. Coomassie veya Ruthenium tabanlı floresan lekeli jel parçaları için, 1 h için (25 mM NH4HCO3 in 50% acetonitrile), ek çözelti içinde jel parçaları inkük çözüm atın. Boyama görünmez olana kadar prosedürü tekrarlayın.
          Not: NH4HCO3 Içeren ÇÖZÜMLERI, 100 mm NH4HCO3, pH 7,8 ' de bir stok çözümden seyreltme ile hazırlayın.
          DIKKAT: Asetonitril, yanıcı ve toksik uçucu bir çözücüdür. NH4HCO3 cilt veya göz tahrişine neden olabilir. Eldiven kullanın ve kimyasal bir kaput altında çalışın.
        2. Gümüş lekeli jel parçaları için, 30 dakika boyunca su içinde gümüş leke (15 mM K3[Fe (CN)6], 50 mm na2S2O3) için kabarınma çözeltisi 50 μL içinde jel parçaları inkük. solüsyonu atın ve jel parçalarını 200 μL ile yıkayın su. Tekrar yıkayın beş kez veya jel sarı renk görünmüyor kadar.
          DIKKAT: K3[Fe (CN)6] cilt veya göz tahrişine neden olabilir. Eldiven kullan.
      3. 200 μL Asetonitril kullanarak jel parçalarını 10 dk 'da RT 'de kurutur. Ardından, çözümü atın.
        Not: susuz jel parçaları, cilt, opak ve yapışkan küçük. Birkaç adet jel tek bir tüpte birleştirildiğinde, jel parçalarının verimli dehidratasyonu için prosedürü tekrarlayın.
      4. 50 μL (veya jel parçalarını kapsayacak kadar hacim) ekleme (100 mm NH4HCO3' te 10 mm ditiyotreitol [DTT]) ve 1 saat için 56 °c ' de inküye yapın. daha sonra, tüpler RT için serin ve azaltma çözeltisi aşan atın.
      5. 50 μL (ya da jel parçalarını kapsayacak kadar hacim) ekleyin (100 mM NH4HCO3' te 50 mm iodoacetamid) ve karanlıkta RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın. Daha sonra, alkilasyon çözeltisi aşan atın.
      6. 200 μL Asetonitril ile jelleri, RT 'de 10 dakika boyunca kurutur. asetonitrile çıkarın ve 100 mM NH4HCO3 ile jel parçalarını RT 'de 10 dakika nemlendirin.
      7. 200 μL Asetonitril ile tekrar 10 dk için RT ve çözelti aşan atın jel parçaları kurutmak.
      8. 50 mM NH4HCO3 tamponunun içinde seyreltilmiş 15 μL kütle spektrometresi dereceli tripsin ekleyin veya hidrat jel parçalarını kapsayacak ve 37 °c ' de 4 saat ya da bir gecede inkük etmek için yeterli hacim. 100 arasında toplam tripsin tutarlar tutun 500 ng (veya 20 ng tripsin/μg protein).
      9. Numuneyi RT 'ye serin ve 2.000 x g 'de 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjün. Su içinde seyreltilmiş% 5 formik asit 10-20 μL ekleyin ve RT 'de 10 dakika boyunca inküye yapın.
        DIKKAT: formik asit, yanıcı, korozif ve toksik. Eldiven kullanın ve kimyasal bir kaput altında çalışın.
      10. Santrifüj adım 2.2.1.9 belirtildiği gibi, daha sonra farklı bir tüp için (ayıklanan peptitler içerir) süpernatant toplamak. 20 μL% 5 formülik asit% 50-60 Asetonitril tüp seyreltilmiş ve RT 10 dk için inküye ekleyin. aynı tüpte çıkarılan peptid fraksiyonları toplayın.
      11. Numuneyi bir vakum konsantratörünü kurutun ve 10 μL 0,5% asetik asit ve kütle spektrometresi analizi için% 2 Asetonitril olarak yeniden oluşturur. Santrifüj ve tüp altında çözüm toplamak; -20 °C veya-80 °C ' de depolama çözümü.
    2. Protein çözeltisi tripsinizasyon içinde
      1. Numune hacmini, tuzlama ve tampon değişimi azaltmak için proteinleri çökeltir. Numunenin altı adet soğutulmuş (-20 °C) aseton ekleyin, örn., 600 μL 'den 100 μL 'ye kadar örnek. Vortex ve-20 °C ' de 15 dk ile 1 saat arasında inkük. Çözüm bulutlu veya bir çökelme formu dönecek.
        DIKKAT: aseton toksik ve yanıcı. Eldiven kullanın ve kimyasal bir kaput altında çalışın.
      2. Santrifüj numuneleri 4 °C ' de 30 dk. aseton ve hava-kuru Pelet 15 dakika için.
      3. 50 mm 'de 10 μL 6-8 M üre veya% 1 SDS ekleyin NH4HCO3 , pelet ve girdap için karıştırmak için çözülür. Daha büyük miktarlarda proteinler için (> 10 μg), 20 μL 'ye kadar çözünme tamponu kullanın.
      4. 5 μL azaltma solüsyonu ve Vortex ekleyin. Bir mikrosantrifüjü kullanarak ses seviyesini aşağı döndürün. Numuneler Urea 'da seyreltiliyorsanız, RT 'de 1 h için inküye yapın. Numuneler SDS 'de seyreltiliyorsanız, 56 °C ' de 1 saat boyunca inkübe edilir.
      5. Bir mikrosantrifüjü kullanarak ses seviyesini aşağı döndürün. 3 μL alkillenme solüsyonu ve Vortex ekleyin. Sonra, ses seviyesini aşağı döndürün ve RT 'de 30 dakika boyunca karanlıkta inküye yapın.
      6. Reaksiyonu nötralize etmek için 3 μL azaltma çözümü ekleyin. 50 mm NH4HCO3kullanarak numuneyi 1 M üre veya% 0,05 SDS 'ye yavaşça seyreltin.
        Not: tripsin sindirim tamponu deterjan veya denaturant olmalıdır. Denatüranlar için konsantrasyon limitleri: 0,05% sds; 0,1% Oktil B-D-glukopyranoside; 0,1% 4-nonilfenil-Polietilen glikol; 0,1% t-oktylphenoxypolithoxyethanol; 0,1% polisorbat 20; 0,1% 3-[(3-kolaminoprokül) dimethylammonio] -1-propanesulfonate; < 1 M üre veya Thiourea.
      7. 50 mM NH4HCO3 tamponunun içinde seyreltilmiş 5 μL Kütle Spektrometrisi dereceli tripsin ekleyin ve 37 °c ' de 4 saat veya gece boyunca inküye yapın. Toplam tripsin tutarları 100 ve 500 ng (veya 20 ng tripsin/μg protein) arasında tutun.
      8. RT örnek serin ve bir mikrosantrifüjü kullanarak ses aşağı spin. Reaksiyonu gidermek için% 5 asetik asit (veya% 50 Asetonitril içinde% 5 formik asit) ekleyin.
      9. 2.2.1.11 adımda belirtildiği gibi bir vakum konsantratördeki numuneleri kurutun. Örnekleri-80 °C ' de saklayın. Desalt ve konsantre peptidler C18 zip-ucu gibi ters faz sütunu kullanarak ve sonra kütle spektrometresi tarafından analiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

RAP1 ve PI Analizi (3, 4, 5) yakınlık Kromatografi ve Batı lekesi ile P3 etkileşimi
Bu örnek, RAP1 tarafından t. brucei lysate veya rekombinant t. brucei RAP1 proteini tarafından bağlama çözümlemek için bu yöntemin uygulama gösterilmektedir. Hemagglutinin (HA) ifade eden T. brucei kan akışı formları Lysates-RAP1 etiketli bağlayıcı olarak kullanıldı. RAP1 varyant yüzey glikoprotein transkripsiyonel kontrol dahil olan bir protein (VSG) genler

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

IPS veya 'e bağlanan proteinlerin tanımlanması, bu metabolitlerin hücresel fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Batı leke veya kütle spektrometresi ile bağlantılı benzeşme kromatografi, IP veya PI etkileşimi olan proteinlerin belirlenmesi ve dolayısıyla düzenleyici fonksiyonları hakkında öngörüler elde etmek için bir fırsat sunar. IPS veya kimyasal olarak etiketlenmiş [örn., INS (1, 4, 5) P3 kimyasal olarak biotin bağlı] ve streptavidin yoluyla agaroz boncuklar için çapraz bağlı veya strept...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarın ifşa etmesi gereken bir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Doğal Bilimler ve Kanada Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC, RGPIN-2019-04658) tarafından destekleniyordu; Erken kariyer araştırmacılar için NSERC Discovery fırlatma eki (DGECR-2019-00081) ve McGill Üniversitesi tarafından.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneSigma-Aldrich650501Ketone
AcetonitrileSigma-Aldrich271004Solvent 
Ammonium bicarbonateSigma-AldrichA6141Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MIBeckman CoulterAvanti J6-MICentrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botlesSigma-AldrichB1408Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control BeadsEchelonP-B000-1mlAffinity chromatography reagent - control
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad1610610Reducing agent
Dynabeads M-270 StreptavidinThermoFisher Scientific65305Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001Protease inhibitors
Electrophoresis running bufferBio-Rad161073225 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesCorning Life Sciences430052To centrifuge 10 mL cultures
Formic acidSigma-Aldrich106526Acid
GlycineSigma-AldrichG7126Amino acid
HMI-9 cell culture mediumThermoFisher ScientificME110145P1Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein StainThermoFisher Scientific24615Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 BeadsEchelonQ-B0145-1mlAffinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry MilkThomas ScientificC837M64Blocking reagent for Western blotting
IodoacetamideSigma-AldrichI6125Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab RotatorThomas Scientific1159Z92For binding assays
LoBind Microcentrifuge TubesThermoFisher Scientific13-698-793Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630)Sigma-Aldrich21-3277Detergent
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010031Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescenceThermoFisher Scientific32106Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail TabletsRoche4906845001Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP BeadsEchelonP-B003a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP BeadsEchelonP-B034a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8EchelonP-3908-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP BeadsEchelonP-B345a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B035a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP BeadsEchelonP-B004a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8EchelonP-4508-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B045a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP BeadsEchelonP-B005a-1mlAffinity chromatography reagent 
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III)Sigma-Aldrich702587Potassium salt 
PtdIns PIP BeadsEchelonP-B001-1mlAffinity chromatography reagent 
PVDF MembraneBio-Rad1620177For Western blotting 
Refrigerated centrifugeEppendorf5910 RMicrocentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich862010Detergent
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich72049Chemical 
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermoFisher ScientificSPD120-115Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture ThermoFisher Scientific159910To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry GradePromegaV5280Trypsin for protein digestion
UreaSigma-AldrichU5128Denaturing reagent
VortexFisher Scientific02-215-418For mixing reactions
Western blotting transfer bufferBio-Rad161073425 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paperSigma-AldrichWHA3030861Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M)Bio-Rad1610710Reducing agent
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561094Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0747Protein loading buffer

Referanslar

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806(2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262(2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285(2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6(2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Bu ay JoVEsay 149inositol Fosfatlarfosfatidilositolfosfoinositideprotein etkile imiTripanosomametabolitlerk tle spektrometresiBat lekesiyak nl k Kromatografi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır