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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Identifizierung von Proteinen, die an Inositolphosphate oder Phosphoinositide binden. Es verwendet Affinitätschromatographie mit biotinylierten Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden, die über Streptavidin zu Agarose oder magnetischen Perlen immobilisiert werden. Inositolphosphat oder Phosphoinositid-bindende Proteine werden durch western blotting oder Massenspektrometrie identifiziert.

Zusammenfassung

Inositolphosphate und Phosphoinositide regulieren mehrere zelluläre Prozesse in Eukaryoten, einschließlich Genexpression, Vesikelhandel, Signaltransduktion, Stoffwechsel und Entwicklung. Diese Metaboliten führen diese regulatorische Aktivität durch Bindung an Proteine durch und verändern dadurch die Proteinkonformation, die katalytische Aktivität und/oder die Wechselwirkungen. Die hier beschriebene Methode verwendet Affinitätschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie oder Western Blotting, um Proteine zu identifizieren, die mit Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden interagieren. Inositolphosphate oder Phosphoinositide werden chemisch mit Biotin markiert, das dann über Streptavidin konjugiert zu Agarose oder magnetischen Perlen gefangen wird. Proteine werden durch ihre Affinität zur Bindung an den Metaboliten isoliert, dann eluiert und durch Massenspektrometrie oder Western Blotting identifiziert. Die Methode verfügt über einen einfachen Workflow, der empfindlich, nicht radioaktiv, liposomenfrei und anpassbar ist und die Analyse der Protein- und Metaboliteninteraktion präzise unterstützt. Dieser Ansatz kann in etikettenfreien oder in aminosäuremarkierten quantitativen Massenspektrometriemethoden verwendet werden, um Protein-Metabolit-Wechselwirkungen in komplexen biologischen Proben oder mit gereinigten Proteinen zu identifizieren. Dieses Protokoll ist für die Analyse von Proteinen aus Trypanosoma bruceioptimiert, kann aber an verwandte protozoische Parasiten, Hefe- oder Säugetierzellen angepasst werden.

Einleitung

Inositolphosphate (IPs) und Phosphoinositide (PIs) spielen eine zentrale Rolle in der Eukaryotenbiologie durch die Regulierung zellulärer Prozesse wie die Kontrolle der Genexpression1,2,3, Vesikelhandel 4, Signaltransduktion5,6, Stoffwechsel7,8,9, und Entwicklung8,10. Die regulatorische Funktion dieser Metaboliten ergibt sich aus ihrer Fähigkeit, mit Proteinen zu interagieren und damit die Proteinfunktion zu regulieren. Bei Bindung durch Proteine können IPs und PIs die Proteinkonformation11, die katalytische Aktivität12oder Wechselwirkungen13 verändern und somit die zelluläre Funktion beeinflussen. IPs und PIs sind in mehreren subzellulären Kompartimenten verteilt, wie z. B. Kern2,3,14,15, endoplasmatisches Retikulum16,17, Plasma Membran1 und Cytosol18, entweder verbunden mit Proteinen3,19 oder mit RNAs20.

Die Spaltung des membranassoziierten PI(4,5)P2 durch Phospholipase C führt zur Freisetzung von Ins(1,4,5)P3, das durch IP-Kinäsen bzw. Phosphatasen phosphoryliert oder dephosphoryliert werden kann. IPs sind lösliche Moleküle, die an Proteine binden und regulatorische Funktionen ausüben können. Zum Beispiel kann Ins(1,4,5)P3 in Metazoan als zweiter Botenstoff durch Bindung an IP3-Rezeptoren fungieren, was Rezeptor-Konformationsänderungen induziert und somit Ca2+ aus intrazellulären Speichern freigibt11. Ins(1,3,4,5)P4 bindet an den Histon-Deacetylase-Komplex und reguliert die Proteinkomplex-Montage und -Aktivität13. Weitere Beispiele für iPs Regulatorische Funktion sind die Kontrolle der Chromatin-Organisation21, RNA-Transport22,23, RNA-Editing24und Transkription1,2,3 . Im Gegensatz dazu werden PIs oft mit der Rekrutierung von Proteinen an die Plasmamembran oder Organelle Membranen25assoziiert. Eine neu entstehende Eigenschaft von PIs ist jedoch die Fähigkeit, mit Proteinen in einer nicht-membranösen Umgebungzuassoziieren 3,15,19,26. Dies ist der Fall des steroidogenen Kernrezeptors, dessen Transkriptionskontrollfunktion durch PI(3,4,5)P319reguliert wird, und Poly-A-Polymerase, deren enzymatische Aktivität durch kerntechnische PI(4,5)P226reguliert wird. Eine regulierende Rolle für IPs und PIs wurde in vielen Organismen gezeigt, einschließlich Hefe22,27, Säugetierzellen19,23, Drosophila10 und Würmer28. Von Bedeutung ist die Rolle dieser Metaboliten bei Trypanosomen, die früh von der eukaryotischen Abstammung abwichen. Diese Metaboliten spielen eine wesentliche Rolle bei Trypanosoma brucei Transkriptionskontrolle1,3, Entwicklung8, Organelle Biogenese und Proteinverkehr29,30 , 31 , 32, und sind auch an der Kontrolle der Entwicklung und Infektion in den Erregern T. cruzi33,34,35,Toxoplasma36 und Plasmodium beteiligt 5 , 37. Daher kann das Verständnis der Rolle von IPs und PIs bei Trypanosomen dazu beitragen, neue biologische Funktionen für diese Moleküle aufzuklären und neue Wirkstoffziele zu identifizieren.

Die Spezifität von Protein- und IP- oder PI-Bindung hängt von Protein-Interagierenden Domänen und dem Phosphorylierungszustand des Inositols13,38ab, obwohl Wechselwirkungen mit dem Lipidteil von PIs ebenfalls 19 auftreten. Die Vielfalt der IPs und PIs und ihre modifizierenden Kinoseen und Phosphatasen bieten einen flexiblen zellulären Mechanismus zur Kontrolle der Proteinfunktion, der durch die Verfügbarkeit und Häufigkeit von Metaboliten, den Phosphorylierungszustand des Inositols und das Protein beeinflusst wird. Affinität der Interaktion1,3,13,38. Obwohl einige Proteindomänen gut charakterisiert sind39,40,41, z.B. Pleckstrin-Homologie-Domäne42 und SPX (SYG1/Pho81/XPR1) Domains43 ,44,45, einige Proteine interagieren mit IPs oder PIs durch Mechanismen, die unbekannt bleiben. Zum Beispiel fehlt dem Repressor-Aktivator-Protein 1 (RAP1) von T. brucei kanonische PI-bindende Domänen, sondern interagiert mit PI(3,4,5)P3 und kontrolliert die Transkription von Genen, die an antigener Variation beteiligt sind3. Affinitätschromatographie und Massenspektrometrieanalyse von IP- oder PI-interagierenden Proteinen aus Trypanosom-, Hefe- oder Säugetierzellen identifizierten mehrere Proteine ohne bekannte IP- oder PI-bindende Domänen8,46, 47. Die Daten deuten auf zusätzliche nicht charakterisierte Proteindomänen hin, die an diese Metaboliten binden. Daher kann die Identifizierung von Proteinen, die mit IPs oder PIs interagieren, neue Mechanismen der Protein-Metabolit-Interaktion und neue zelluläre Regulierungsfunktionen für diese kleinen Moleküle offenbaren.

Die hier beschriebene Methode verwendet Affinitätschromatographie gekoppelt mit western blotting oder Massenspektrometrie, um Proteine zu identifizieren, die an IPs oder PIs binden. Es verwendet biotinylierte IPs oder PIs, die entweder mit Streptavidin verbunden sind, konjugiert mit Agaroseperlen oder alternativ über streptavidin-konjugierte Magnetperlen gefangen werden (Abbildung 1). Die Methode bietet einen einfachen Workflow, der empfindlich, nicht radioaktiv, liposomenfrei ist und sich zum Nachweis der Bindung von Proteinen aus Zelllysaten oder gereinigten Proteinen eignet3 (Abbildung 2). Das Verfahren kann in etikettenfreien8,46 oder gekoppelt an Aminosäure-markierte quantitative Massenspektrometrie47 verwendet werden, um IP- oder PI-bindende Proteine aus komplexen biologischen Proben zu identifizieren. Daher ist diese Methode eine Alternative zu den wenigen verfügbaren Methoden, um die Wechselwirkung von IPs oder PIs mit zellulären Proteinen zu untersuchen und wird dazu beitragen, die regulatorische Funktion dieser Metaboliten bei Trypanosomen und vielleicht anderen Eukaryoten zu verstehen.

Protokoll

1. Analyse von IP- oder PI-bindenden Proteinen durch Affinitätschromatographie und Western Blotting

  1. Zellwachstum, Lyse und Affinitätschromatographie
    1. Wachsen Sie T. brucei-Zellen bis zur Mid-Log-Phase und überwachen Sie die Zelllebensfähigkeit und -dichte. Insgesamt reichen 5,0 x 107 Zellen für einen Bindungstest aus.
      1. Bei Blutkreislaufformen wachsen Zellen in HMI-9-Medien, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C und 5%CO2. Halten Sie die Zelldichte zwischen 8,0 x 105 bis 1,6 x 106 Zellen/ml.
        HINWEIS: Eine Dichte von mehr als 1,8 x 106 Zellen/ml kann die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen. Die Verdoppelungszeit des in vitro angebauten T. brucei 427-Stamms liegt zwischen 5,5 und 6,5 h.
      2. Bei prozyklischen Formen wachsen Zellen in SDM-79 Medium, ergänzt mit 10% FBS bei 27 °C, und halten die Zelldichte zwischen 1,0 x 107 und 3,0 x 107 Zellen/ml.
      3. Bei gereinigten Proteinen (z. B. rekombinanten Proteinen) 0,5 bis 1 g Protein einnehmen und in 450 l Bindungspuffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2% 4-Nonylphenyl-Polyethylenglycol, pH 7,4) verdünnen. Halten Sie 5% des verdünnten Proteins (Input) für die Western Blot Analyse. Fahren Sie mit Schritt 1.1.7 fort.
    2. Zentrifugenzellen bei 1.600 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand.
      HINWEIS: Weitere Informationen zur Zentrifugierung großer Kulturvolumina finden Sie in Schritt 2.1.2.
    3. Das Pellet in 10 ml Phosphat gepufferter saline pH 7,4, ergänzt mit 6 mM Glukose (PBS-G) und vorgewärmt bei 37 °C, um die Zellen zu waschen, wird vorsichtig wieder aufgeheizt. Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 1.600 x g für 5 min bei RT. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
    4. Das Pellet in 1 ml PBS-G wieder aufsetzen. Dann übertragen Sie das Volumen auf ein 1,5 ml Rohr und Zentrifuge bei 1.600 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
      HINWEIS: Zellpellets können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C oder flüssigem Stickstoff gelagert werden.
    5. Das Pellet in 0,5 ml Lysepuffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, pH 7,4) mit 1,5-fachem Protease-Inhibitor-Cocktail und 1x Phosphatase-Inhibitor-Cocktail(Materialtabelle) vorgekühlt in Eis lyse die Zellen. 10 min rotieren bei 50 Umdrehungen bei 4 °C.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, da Proteine abgebaut werden können, wenn sie nicht wie angegeben behandelt werden. Überprüfen Sie bei Bedarf die Integrität von Proteinlysat durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS/PAGE).
      VORSICHT: T-Octylphenoxypolyethoxyethanol ist giftig und kann Haut- und Augenreizungen verursachen. Verwenden Sie Handschuhe, Augenschutz und Gesichtsschutz.
    6. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen 1,5 ml Rohr für die Bindung von Assays. Halten Sie 5 % des gesamten Lysats (Input) für die Western Blotting-Analyse. Der Überstand enthält Parasitenproteine, die mit Lysepuffer extrahiert wurden.
    7. Sammeln Sie 50 L IPs oder PIs, die zu Agaroseperlen konjugiert sind (d. h. 50 l Gülle) oder 50 l Agaroseperlen und Zentrifuge für 1 min bei 1.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 50 l Bindungspuffer aus, um die Perlen auszulagern. Verwenden Sie nicht konjugierte Perlen als Kontrolle. Verwenden Sie IP/PI-Perlen mit unterschiedlicher Phosphatkonfiguration, einschließlich nicht phosphorylierter Formen, um unspezifische Wechselwirkungen zu kontrollieren.
    8. Fügen Sie dem Zelllysat oder gereinigten Proteinen 50 l IP- oder PI-Perlen hinzu (jeweils 1 ml Perlen enthalten 10 Nmol konjugierter IPs oder PIs). Halten Sie das Volumen der IP- oder PI-Perlen innerhalb von 10% des Gesamtlysats und passen Sie bei Bedarf das Bindungsreaktionsvolumen mit Bindungspuffer an.
      1. Für Wettbewerbstests verschiedene Konzentrationen von nicht konjugierten IPs oder PIs (z. B. 1-, 10-, 100-facher Molüberschuss im Vergleich zu IP- oder PI-Perlen) zur Bindungsreaktion hinzufügen.
    9. Inkubieren Sie die Reaktion für 1 h oder über Nacht bei 4 °C und rotieren bei 50 Umdrehungen von 1. Minute.
      HINWEIS: Bindungsreaktionen mit gereinigten Proteinen können bei RT je nach Stabilität des Proteins durchgeführt werden. Wenn Sie IPs oder PIs, die mit Biotin konjugiert sind, nur mit Schritt 1.1.9.1 fortfahren, fahren Sie andernfalls mit Schritt 1.1.10 fort.
      1. Fügen Sie der Bindungsreaktion 50 l Streptavidin-konjugiert zu magnetischen Perlen hinzu und brüten sie 1 h bei 4 °C bei 50 Umdrehungen pro Minute.
    10. Zentrifugieren Sie die Mischung für 1 min bei 1.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand (Durchfluss) und halten Sie das Pellet. Halten Sie 5% des Überstandes für Western Blot Analyse.
      HINWEIS: Wenn Sie magnetische Perlen verwenden, entfernen Sie Überstand und führen Sie nachfolgende Wälwass mit einem magnetischen Ständer durch (Zentrifugationen sind nicht erforderlich).
    11. Fügen Sie 1 ml Waschpuffer (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,2% 4-Nonylphenyl-Polyethylenglycol, pH 7,4) hinzu und setzen Sie das Harz durch Antippen oder Wirbeln des Rohres wieder auf (verwenden Sie keine Pipette, da Perlen an Pipettenspitzen befestigt werden können). Zentrifugieren Sie die Reaktion für 1 min bei 1.000 x g bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt fünf Wähbe.
      VORSICHT: 4-Nonylphenyl-Polyethylenglycol ist giftig und kann Haut- und Augenreizungen verursachen. Verwenden Sie Handschuhe, Augenschutz und Gesichtsschutz.
    12. Fügen Sie den Perlen 50 L 2x Laemmli-Puffer, ergänzt mit 710 mM 2-Mercaptoethanol, zu und mischen Sie sie durch Tippen oder Wirbel, um die Proteine zu vereiteln. Bei 95 °C 5 min erhitzen, dann 10.000 x g für 1 min zentrifugieren und den Überstand sammeln (eluierte Proteine enthalten). Alternativ können Elute-Proteine mit 8 M Harnstoff/100 mM Glycin-pH 2,9 verwendet werden, um die Verwendung von SDS zu vermeiden. Einfrieren Sie das Eluat bei -80 °C, andernfalls fahren Sie mit der Western Blot-Analyse fort.
      VORSICHT: 2-Mercaptoethanol ist giftig und kann Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen. Verwenden Sie Handschuhe und arbeiten Sie in der chemischen Kapuze.
  2. Western Blotting-Analyse
    1. Mischen Sie 15 L-Eingangsproben (ab Schritt 1.1.6) oder Durchflussproben (ab Schritt 1.1.10) mit 5 l 4x Laemmli-Puffer. Wärmeeingangs- und Durchflussproben für 5 min bei 95 °C. Bei Proben, die in 8 M Harnstoff/100 mM Glycin-pH 2,9 eluiert werden, 15 l Eluat mit 5 l 4x Laemmli-Puffer mischen und 5 min bei 95 °C erhitzen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht für Proben erforderlich, die im 2x Laemmli Puffer eluiert werden.
    2. Laden Sie Brunnen von 4-20% SDS/PAGE-Gel mit 2,5 l Input, 2,5 l Durchfluss und 20 l eluierten Proben und laden Sie proteinleiter gemäß der Empfehlung des Herstellers.
      HINWEIS: Wählen Sie Gel% nach dem Molekulargewicht des proteins von Interesse.
    3. Führen Sie SDS/PAGE bei 150 V für 30-45 min im Laufpuffer aus, oder bis sich der blaue Farbstoff des Laemmli-Puffers am Ende des Gels befindet.
      HINWEIS: Die Laufzeit kann je nach Laborausstattung variieren.
    4. Entfernen Sie das Gel von den Glasplatten (oder Kunststoffplatten) und tränken Sie 15 min im Transferpuffer.
    5. Übertragen Sie die Proteine auf polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran oder Nitrocellulosemembran. Einweichen Membranen und 3 mm Filterpapier im Transferpuffer. Montieren Sie ein Sandwich mit drei Blatt Filterpapier, Nitrocellulose oder PVDF-Membran, Gel und weiteren drei Blatt Filterpapier. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Sandwich gefangen sind. Verwenden Sie eine Rolle, um Blasen zu entfernen, wenn nötig. Stellen Sie die Membran auf die Kathode und das Gel auf die Anodenseite der Kassette.
      HINWEIS: In den Anweisungen des Membranherstellers finden Sie Informationen zur Membranaktivierung oder zur Blot-Vorbereitung.
    6. Legen Sie die Kassette mit dem Sandwich in den Transfertank mit Transferpuffer. Legen Sie den Tank in einen Eiskübel oder bei 4 °C (z.B. im Kühlraum). Transferproteine bei 100 V für 1 h (Strom variiert zwischen 200-400 mA). Alternativ können Sie über Nacht bei einem konstanten Strom von 15 mA bei 4 °C übertragen.
    7. Entfernen Sie die Membran aus der Kassette. Inkubieren Sie die Membran in 6% fettfreie Trockenmilch, die in PBS mit 0,05% Polysorbat 20 (PBS-T) oder einer kompatiblen Blockierlösung verdünnt wird, für 1 h bei RT, um die Membran zu blockieren.
      HINWEIS: Vor dem Blockieren der Membran kann die Qualität des Transfers mit Demonstchen Ponceau S überprüft werden. Inkubieren Sie die Membran für 1 min in 15 ml Ponceau S, spülen Sie sie in Wasser und visualisieren Sie Bänder.
    8. Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die Membran für 1 h bei RT mit 50 Umdrehung in primären Antikörpern, die in 6% fettfreier Trockenmilch verdünnt in PBS-T verdünnt sind. Alternativ kann die Membran über Nacht bei 4 °C mit 50 Umdrehung entumt werden.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt der Inkubation kann je nach Qualität der Antikörper variieren; Die meisten Antikörper wirken jedoch mit Inkubationen von 1-3 h bei RT. Folgen Sie der Empfehlung des Herstellers für die Konzentration oder Verdünnung von Antikörpern.
    9. Waschen Sie den Blot, indem Sie die Membran in PBS-T für 5 min mit 50 Umdrehung bei RT inkubieren. Wiederholen Sie den Vorgang 3-5 Mal. Je nach Qualität der Antikörper können weitere Wassen erforderlich sein.
    10. Inkubieren Sie die Membran in Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern für 1 h bei RT in 6% fettfreier Trockenmilch, die in PBS-T mit 50 Umdrehungen pro Minute verdünnt wird.
      HINWEIS: Befolgen Sie die Empfehlung des Herstellers für Antikörperkonzentration oder Verdünnung.
    11. Waschen Sie den Blot wie in Schritt 1.2.9 angegeben.
    12. Fügen Sie das chemilumineszierende Substrat hinzu, um die Membran zu bedecken. Entfernen Sie den Überschuss an Substrat und brüten für 5 min bei RT im Dunkeln.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Anweisungen des Herstellers für Empfehlungen zu den Chemilumineszenzreagenzien.
    13. Erfassen Sie das chemilumineszierende Signal mit einem kamerabasierten Imager. Alternativ können Sie einen Röntgenfilm verwenden, um das chemilumineszierende Signal zu erfassen.

2. Analyse von IP/PI-bindenden Proteinen durch Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie

  1. Zellwachstum, Lyse und Affinitätschromatographie
    1. Wachsen Sie T. brucei-Zellen bis zur Mid-Log-Phase und überwachen Sie die Zelllebensfähigkeit und -dichte.
      HINWEIS: Insgesamt 1,0 x 1010 Zellen reichen für zwei Bindungstests. Die Verwendung von weniger Zellen als hier angegeben kann den Nachweis von Proteinen mit geringer Häufigkeit durch Massenspektrometrie beeinflussen.
      1. Bei T. brucei Blutkreislaufformen wachsen Zellen in der Mid-Log-Phase (8,0 x 105-1,6 x 106 Zellen/ml) in HMI-9-Medien, ergänzt mit 10% FBS bei 37 °C und mit 5% CO2 . Für 427 Stamm, 5 L Kultur ergibt 0,5-1,0 x 1010 Zellen. Überwachen Sie das Zellwachstum, um eine Dichte von mehr als 1,8 x 106 Zellen/ml zu vermeiden, die die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen kann. Halten Sie das Volumen der Zellkultur auf 1/10 des Kolbenvolumens; Andernfalls wird die Wachstumsrate der Zellen aufgrund der schlechten Belüftung beeinflusst.
        HINWEIS: Die 427-Sorte hat eine Verdoppelungszeit von 5,5-6,5 h.
      2. Bei prozyklischen Formen wachsen Zellen in SDM-79 Medium, ergänzt mit 10% FBS bei 27 °C, und halten die Zelldichte zwischen 1,0 x 107 und 3,0 x 107 Zellen/ml. 500 ml Kultur ergeben 0,5-1,5 x 1010 Zellen.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.600 x g für 15 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 200 ml PBS-G vorgeheizt bei 37 °C wieder auf. Verwenden Sie runde Bodenzentrifugationsrohre (Materialtabelle), da T. brucei Blutstrom-Formpellets leicht gestört werden, wenn sie zentrifugierte Rotoren mit festem Winkel verwenden. Zentrifugieren Sie die Zellen bei RT wieder bei 1.600 x g für 5 min.
    3. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 10 ml PBS-G wieder auf. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.600 x g für 5 min bei RT. Wiederholen Sie den Vorgang und nach der letzten Wäsche, entsorgen Sie den Überstand.
      HINWEIS: Pellets können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C oder flüssigem Stickstoff gelagert werden.
    4. Das Zellpellet in 5 ml Lysepuffer vorgekühlt in Eis wieder aufhängen und mit 1,5-fachem Proteasehemmer-Cocktail und 1x Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (TabellederMaterialien) ergänzen. Das Lysat 10 min bei 4 °C bei 50 Umdrehungen bei 50 Umdrehungen bei 50 Umdrehungen inkubieren.
    5. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand (solubilisierte Proteine) und verdünnen Sie es in 20 ml Bindungspuffer.
    6. Sammeln Sie 400 L IPs oder PIs, die zu Agaroseperlen konjugiert sind (d. h. 400 l Gülle) oder 400 l Kontrollperlen und Zentrifugen für 1 min bei 1.000 x g bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 400 l Bindungspuffer wieder auf, um die Perlen zu auslagern. Verwenden Sie Agaroseperlen als Negativkontrolle, um eine spezifische Anreicherung von Protein-Metabolit-Wechselwirkungen im Vergleich zu unspezifischen Wechselwirkungen (z. B. Proteine, die nicht spezifisch an die Perlen binden) zu bestimmen. Verwenden Sie IPs oder PIs mit unterschiedlichen Phosphatkonfigurationen, einschließlich nicht phosphorylierter Formen, um unspezifische Wechselwirkungen aufgrund von Phosphatladungen oder Bindung an Biotin zu kontrollieren.
    7. Fügen Sie 400 l IP/PI-Perlen hinzu oder steuern Sie Perlen zu 10 ml Lysat und inkubiert für 1 h oder über Nacht bei 4 °C rotierend bei 50 Umdrehungen pro Minute. Wenn Sie IPs oder PIs verwenden, die nur mit Biotin (ohne Perlen) konjugiert sind, fahren Sie mit Schritt 2.1.7.1 fort, andernfalls fahren Sie mit Schritt 2.1.8 fort.
      1. 100 L Streptavidin-konjugiert zu magnetischen Perlen hinzufügen und 1 h bei 4 °C bei 50 Umdrehungen pro Minute inkubieren.
    8. Zentrifugieren Sie die Bindungsreaktion für 1 min bei 1.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand (Durchfluss) und halten Sie das Pellet. Halten Sie 5% des Überstandes für Western Blot Analyse.
    9. 5 ml Waschpuffer in das Pellet geben, vorsichtig mischen, indem man das Rohr wirbelt, und dann zentrifugieren für 1 min bei 1.000 x g bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Wäsche fünfmal. Bei Verwendung von Magnetperlen, sammeln Überstand und führen Sie Wärmittel mit einem magnetischen Ständer (Zentrifugationen sind nicht notwendig).
    10. Fügen Sie 50 L 2x Laemmli Puffer (oder 8 M Harnstoff/100 mM Glycin pH 2.9, um die Verwendung von SDS zu vermeiden) zu den Perlen und mischen durch Tippen oder Wirbel (vermeiden Pipettierung, weil Perlen an Pipettenspitzen befestigen können), und dann bei 95 °C für 5 min erhitzen. Zentrifuge für 10.000 x g für 1 min und sammeln Sie das Überstand (eluierte Proteine). Wiederholen Sie den Vorgang zweimal, um insgesamt drei Brüche zu sammeln.
    11. Eluat bei -80 °C einfrieren, ansonsten Proteine in SDS/PAGE trennen oder in Lösung für Diepinisierung und Massenspektrometrie-Analyse halten.
  2. Trypsin-Verdauung von Proteinen für die Massenspektrometrie
    HINWEIS: Zwei Varianten dieses Verfahrens sind für Abschnitt 2.2.1 (in Gel) oder Abschnitt 2.2.2 (in Lösung) Die Verdauung von Proteinen dargestellt. Proteinarme Bindungsröhrchen werden empfohlen, um Probenverluste zu verhindern. Konsultieren Sie mit einem analytischen Chemiker in der Proteomik-Anlage die Eignung des Protokolls für Proben und Massenspektrometer-Instrumente zur Verfügung.
    1. In-Gel-Trypsinisierung von Proteinen
      1. Nach der Proteintrennung in SDS/PAGE das Gel kurz in hochreinem Wasser abspülen. Übertragen Sie das Gel auf eine saubere Glasplatte. Verbrauche Proteinbänder mit einer sauberen Klinge und vermeiden das Schneiden zusätzlicher Gel-Außenbänder. Die Gelstücke in kleine Stücke (d.h. ca. 1 mm Quadrat) schneiden und in ein 1 ml-Rohr geben. Verwenden Sie bei Bedarf eine Pipettenspitze, aber stellen Sie sicher, dass die Pipettespitze vor dem Gebrauch in Ethanol vorgespült wird.
        HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe, um eine Gelkontamination zu vermeiden. Gelstücke können bei -20 °C gelagert werden.
      2. Fügen Sie 100 l hochreines oder leistungsstarkes Flüssigchromatographiewasser zu Denröhrchen hinzu, um Gelstücke zu spülen. Entsorgen Sie das Wasser.
        1. Für Coomassie- oder Ruthenium-basierte fluoreszierende gebeizte Gelstücke die Gelstücke in Entsalzungslösung (25 mM NH4HCO3 in 50% Acetonitril) für 1 h inkubieren und dann entsorgen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Färbung nicht sichtbar ist.
          HINWEIS: Bereiten Sie Lösungen mit NH4HCO3 durch Verdünnung aus einer Lagerlösung bei 100 mM NH4HCO3, pH 7.8 vor.
          VORSICHT: Acetonitril ist ein flüchtiges Lösungsmittel, entzündlich und giftig. NH4HCO3 kann Haut- oder Augenreizungen verursachen. Verwenden Sie Handschuhe und arbeiten Sie unter einer chemischen Haube.
        2. Für silbergebeizte Gelstücke, Inkubationsgelstücke in 50 l Entsalzungslösung für Silberfleck (15 mM K3[Fe(CN)6], 50 mM Na2S2O3) in Wasser für 30 min. Entsorgen Sie die Lösung und waschen Gelstücke mit 200 l wasser. Waschen Sie fünfmal oder bis die gelbe Farbe des Gels nicht sichtbar ist.
          VORSICHT: K3[Fe(CN)6] kann Haut- oder Augenreizungen verursachen. Verwenden Sie Handschuhe.
      3. Dehydrieren Sie die Gelstücke mit 200 l Acetonitril für 10 min bei RT. Entsorgen Sie dann die Lösung.
        HINWEIS: Dehydrierte Gelstücke sind in Volumen kleiner, undurchsichtig und klebrig. Wenn mehrere Gelstücke in einem Rohr kombiniert werden, wiederholen Sie das Verfahren zur effizienten Austrocknung von Gelstücken.
      4. Fügen Sie 50 l (oder genug Volumen, um die Gelstücke zu decken) der Reduktionslösung (10 mM Dithiothreitol [DTT] in 100 mM NH4HCO3) und inkubieren bei 56 °C für 1 h. Danach kühlen Sie die Rohre auf RT und entsorgen Sie den Überschuss der Reduktionslösung.
      5. Fügen Sie 50 l (oder genug Volumen, um die Gelstücke zu decken) der Alkylierungslösung (50 mM Iodoacetamid in 100 mM NH4HCO3) und inkubieren Sie für 30 min bei RT im Dunkeln. Danach entsorgen Sie den Überschuss der Alkylierungslösung.
      6. Die Gelstücke mit 200 l Acetonitril 10 min bei RT dehydrieren. Acetonitril entfernen und die Gelstücke mit 100 mM NH4HCO3 10 min bei RT hydratisieren.
      7. Die Gelstücke erneut mit 200 l Acetonitril für 10 min bei RT dehydrieren und den Überschuss der Lösung entsorgen.
      8. Fügen Sie 15 l Massespektrometrie Grade Trypsin in 50 mM NH4HCO3 Puffer verdünnt, oder genug Volumen, um hydratisierte Gelstücke zu decken und für 4 h oder über Nacht bei 37 °C zu brüten. Halten Sie die Gesamten der Trypsinmengen zwischen 100 und 500 ng (oder 20 ng Trypsin/g Protein).
      9. Kühlen Sie die Probe auf RT und Zentrifugen für 1 min bei 2.000 x g in einer Mikrozentrifuge. Fügen Sie 10-20 l 5% Ameisensäure in Wasser verdünnt und inkubieren für 10 min bei RT.
        VORSICHT: Ameisensäure ist entzündlich, ätzend und giftig. Verwenden Sie Handschuhe und arbeiten Sie unter einer chemischen Haube.
      10. Zentrifuge, wie in Schritt 2.2.1.9 angegeben, dann den Überstand (enthalten extrahierte Peptide) in einem anderen Rohr sammeln. Fügen Sie 20 l 5% Ameisensäure in 50-60% Acetonitril verdünnt in die Röhre und inkubieren für 10 min bei RT. Sammeln Sie extrahierte Peptidfraktionen in der gleichen Röhre.
      11. Trocknen Sie die Probe in einem Vakuumkonzentrator und rekonstituieren Sie sich in 10 l 0,5% Essigsäure und 2% Acetonitril für die Massenspektrometrieanalyse. Zentrifuge und sammeln die Lösung an der Unterseite des Rohres; Lösung bei -20 °C oder -80 °C lagern.
    2. In Lösung Trypsinisierung von Proteinen
      1. Niederschlagen Sie Proteine, um das Probenvolumen, die Entsalzung und den Pufferaustausch zu reduzieren. Fügen Sie der Probe sechs Volumina von gekühltem (-20 °C) Aceton hinzu, z. B. 600 l Aceton bis 100 l Probe. Vortex und inkubieren bei -20 °C für 15 min bis 1 h. Die Lösung wird trüb oder bildet einen Niederschlag.
        VORSICHT: Aceton ist giftig und entzündlich. Verwenden Sie Handschuhe und arbeiten Sie unter einer chemischen Haube.
      2. Zentrifugenproben bei 4 °C für 30 min. Aceton dekantieren und das Pellet 15 min lang lufttrocknen.
      3. Fügen Sie 10 l 6-8 M Harnstoff oder 1% SDS in 50 mM NH4HCO3 hinzu, um das Pellet und den Wirbel zu mischen. Für größere Mengen an Proteinen (> 10 g) verwenden Sie bis zu 20 l Auflösungspuffer.
      4. Fügen Sie 5 L der reduzierenden Lösung und Wirbel. Drehen Sie das Volumen mit einer Mikrozentrifuge nach unten. Wenn Proben in Harnstoff verdünnt werden, dann für 1 h bei RT inkubieren. Wenn Proben in SDS verdünnt werden, dann für 1 h bei 56 °C inkubiert.
      5. Drehen Sie das Volumen mit einer Mikrozentrifuge nach unten. Fügen Sie 3 L Alkylierungslösung und Wirbel hinzu. Dann drehen Sie das Volumen nach unten und inkubieren sie im Dunkeln für 30 min bei RT.
      6. Fügen Sie 3 L der reduzierenden Lösung hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Die Probe langsam auf 1 M Harnstoff oder 0,05% SDS mit 50 mM NH4HCO3verdünnen.
        HINWEIS: Der Trypsin-Verdauungspuffer muss über Waschmittel oder Denaturierungsmittel verfügen. Konzentrationsgrenzwerte für Denaturierungsmittel sind: 0,05% SDS; 0,1% Octyl B-D-Glucopyranosid; 0,1% 4-Nonylphenyl-Polyethylenglycol; 0,1% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol; 0,1% Polysorbat 20; 0,1% 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat; < 1 M Harnstoff oder Thiourea.
      7. Fügen Sie 5 l Massespektrometrie Grade Trypsin in 50 mM NH4HCO3 Puffer verdünnt und inkubieren für 4 h, oder über Nacht, bei 37 °C. Halten Sie die gesamten Trypsin-Mengen zwischen 100 und 500 ng (oder 20 ng Trypsin/g Protein).
      8. Kühlen Sie die Probe auf RT, und drehen Sie das Volumen mit einer Mikrozentrifuge nach unten. Fügen Sie 5% Essigsäure (oder 5% Ameisensäure in 50% Acetonitril) hinzu, um die Reaktion zu löschen.
      9. Trocknen Sie die Proben in einem Vakuumkonzentrator, wie in Schritt 2.2.1.11 angegeben. Proben bei -80 °C lagern. Desalt und Konzentrat Peptide mit einer umgekehrten Phasensäule wie C18 Zip-Tip und dann durch Massenspektrometrie analysieren.

Ergebnisse

Analyse der RAP1- und PI(3,4,5)P3-Wechselwirkung durch Affinitätschromatographie und Western Blotting
Dieses Beispiel veranschaulicht die Anwendung dieser Methode zur Analyse der Bindung von PIs durch RAP1 aus T. brucei lysate oder durch rekombinantes T. brucei RAP1-Protein. Lysate von T. brucei Blutbahnformen, die Hemagglutinin (HA)-getaggt RAP1 ausdrücken, wurden in Bindungstests verwendet. RAP1 ist ein Protein, das an der transkriptionellen Kontrolle der Varianten-Oberf...

Diskussion

Die Identifizierung von Proteinen, die an IPs oder PIs binden, ist entscheidend, um die zelluläre Funktion dieser Metaboliten zu verstehen. Die Affinitätschromatographie, gekoppelt mit der Westlichen Fleck- oder Massenspektrometrie, bietet die Möglichkeit, IP- oder PI-interagierende Proteine zu identifizieren und so Einblicke in ihre regulatorische Funktion zu gewinnen. IPs oder PIs, die chemisch getaggt sind [z.B., Ins(1,4,5)P3, die chemisch mit Biotin verbunden sind] und über Streptavidin mit Agaroseperlen verbunde...

Offenlegungen

Der Autor hat nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658) unterstützt. NSERC Discovery Launch Supplement for Early Career Researchers (DGECR-2019-00081) und von der McGill University.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneSigma-Aldrich650501Ketone
AcetonitrileSigma-Aldrich271004Solvent 
Ammonium bicarbonateSigma-AldrichA6141Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MIBeckman CoulterAvanti J6-MICentrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botlesSigma-AldrichB1408Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control BeadsEchelonP-B000-1mlAffinity chromatography reagent - control
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad1610610Reducing agent
Dynabeads M-270 StreptavidinThermoFisher Scientific65305Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001Protease inhibitors
Electrophoresis running bufferBio-Rad161073225 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesCorning Life Sciences430052To centrifuge 10 mL cultures
Formic acidSigma-Aldrich106526Acid
GlycineSigma-AldrichG7126Amino acid
HMI-9 cell culture mediumThermoFisher ScientificME110145P1Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein StainThermoFisher Scientific24615Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 BeadsEchelonQ-B0145-1mlAffinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry MilkThomas ScientificC837M64Blocking reagent for Western blotting
IodoacetamideSigma-AldrichI6125Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab RotatorThomas Scientific1159Z92For binding assays
LoBind Microcentrifuge TubesThermoFisher Scientific13-698-793Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630)Sigma-Aldrich21-3277Detergent
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010031Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescenceThermoFisher Scientific32106Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail TabletsRoche4906845001Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP BeadsEchelonP-B003a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP BeadsEchelonP-B034a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8EchelonP-3908-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP BeadsEchelonP-B345a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B035a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP BeadsEchelonP-B004a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8EchelonP-4508-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B045a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP BeadsEchelonP-B005a-1mlAffinity chromatography reagent 
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III)Sigma-Aldrich702587Potassium salt 
PtdIns PIP BeadsEchelonP-B001-1mlAffinity chromatography reagent 
PVDF MembraneBio-Rad1620177For Western blotting 
Refrigerated centrifugeEppendorf5910 RMicrocentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich862010Detergent
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich72049Chemical 
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermoFisher ScientificSPD120-115Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture ThermoFisher Scientific159910To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry GradePromegaV5280Trypsin for protein digestion
UreaSigma-AldrichU5128Denaturing reagent
VortexFisher Scientific02-215-418For mixing reactions
Western blotting transfer bufferBio-Rad161073425 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paperSigma-AldrichWHA3030861Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M)Bio-Rad1610710Reducing agent
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561094Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0747Protein loading buffer

Referenzen

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