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Resumo

Este protocolo centra-se na identificação de proteínas que se ligam a fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Ele usa a cromatografia de afinidade com fosfatos de inositol biotinylated ou fosfoinositídeos que são imobilizados via estreptavidina para agarose ou grânulos magnéticos. Fosfato de inositol ou proteínas de ligação Fosfoinositídeo são identificados por western blotting ou espectrometria de massa.

Resumo

Fosfatos de inositol e fosfoinositídeos regulam vários processos celulares em eucariontes, incluindo expressão gênica, tráfico de vesículas, transdução de sinal, metabolismo e desenvolvimento. Estes metabolitos realizam esta atividade regulamentar ligando-se a proteínas, alterando assim a conformação proteica, a atividade catalítica e/ou as interações. O método descrito aqui utiliza cromatografia de afinidade acoplada à espectrometria de massas ou western blotting para identificar proteínas que interagem com fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos são quimicamente marcados com biotina, que é então capturado via estreptavidina conjugados para agarose ou grânulos magnéticos. As proteínas são isoladas por sua afinidade de ligação ao metabolito, então eluída e identificada por espectrometria de massas ou western blotting. O método tem um fluxo de trabalho simples que é sensível, não-radioativo, Liposome-livre, e customizável, suportando a análise da interação da proteína e do metabolito com precisão. Esta abordagem pode ser usada em métodos de espectrometria de massas quantitativas rotuladas com rótulo livre ou em aminoácidos para identificar interações proteína-metabólito em amostras biológicas complexas ou usando proteínas purificadas. Este protocolo é otimizado para a análise de proteínas do Trypanosoma brucei, mas pode ser adaptado a parasitas relacionados com protozoários, leveduras ou células de mamíferos.

Introdução

Fosfatos de inositol (IPS) e fosfoinositídeos (PIS) desempenham um papel central na biologia eucariote através da regulação de processos celulares como o controle da expressão gênica1,2,3, tráfico de vesículas 4, transdução de sinal5,6, metabolismo7,8,9e desenvolvimento8,10. A função reguladora destes metabolitos resulta da sua capacidade de interagir com proteínas e, assim, regular a função proteica. Após a ligação por proteínas, IPs e PIs podem alterar a conformação de proteínas11, atividade catalítica12, ou interações13 e, portanto, afetam a função celular. IPS e PIS são distribuídos em múltiplos compartimentos subcelulares, como o núcleo2,3,14,15, retículo endoplasmático16,17, plasma membrana1 e citosol18, ambas associadas com proteínas3,19 ou com RNAs20.

A clivagem do PI associado à membrana (4, 5) P2 pela fosfolipase C resulta na liberação de ins (1, 4, 5) P3, que podem ser fosforilados ou deposforilados por IP quinases e fosfatases, respectivamente. IPs são moléculas solúveis que podem se vincular a proteínas e exercer funções regulatórias. Por exemplo, ins (1, 4, 5) P3 no metazoano podem atuar como um segundo mensageiro ligando-se aos receptores IP3, o que induz alterações conformacionais do receptor e, assim, liberação de CA2 + de lojas intracelulares11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 liga-se ao complexo histona deacetilase e regula o conjunto complexo proteico e a atividade13. Outros exemplos de função regulatória de IPS incluem o controle da organização decromatina21, transporte de RNA22,23, edição de RNA24e transcrição1,2,3 . Em contrapartida, os pis estão frequentemente associados ao recrutamento de proteínas para a membrana plasmática ou membranas Organela25. No entanto, uma propriedade emergente do PIS é a capacidade de associar-se a proteínas em um ambiente não membranoso3,15,19,26. Este é o caso do fator esteroidogênicas do receptor nuclear, que a função de controle transcricional é regulada pelo PI (3, 4, 5) P319, e pela polimerase poli-A que a atividade enzimática é regulada pelo PI nuclear (4, 5) P226. Um papel regulatório para IPS e PIS foi demonstrado em muitos organismos, incluindolevedura 22,27, células demamíferos 19,23, Drosophila10 e worms28. De significância é o papel desses metabólitos em tripanossomas, que divergiram precocemente da linhagem eucariótica. Estes metabolitos desempenham um papel essencial no controlo transcripcional de Trypanosoma brucei 1,3, desenvolvimento8, biogênese organela e tráfego proteico29,30 , 31 de dezembro , 32, e também estão envolvidos no controle do desenvolvimento e infecção nos patógenos T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 e Plasmodium 5. º , 37. portanto, compreender o papel dos IPS e PIS em tripanossomas pode ajudar a elucidar a nova função biológica para essas moléculas e identificar novos alvos de drogas.

A especificidade da ligação proteína e IP ou PI depende dos domínios de interação protéica e do estado de fosforilação do inositol13,38, embora as interações com a parte lipídica do PIS também ocorra19. A variedade de IPs e PIs e suas cinases modificadoras e fosfatases fornece um mecanismo celular flexível para controlar a função protéica que é influenciada pela disponibilidade e abundância do metabolito, o estado de fosforilação do inositol e proteínas afinidade da interação1,3,13,38. Embora alguns domínios proteicos sejam bem caracterizados39,40,41, por exemplo, domínio de homologia de homologia42 e SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domínios43 ,44,45, algumas proteínas interagem com IPS ou PIS por mecanismos que permanecem desconhecidos. Por exemplo, a proteína 1 (RAP1) do repressor-ativador de T. brucei carece de domínios de vinculação de PI canônicos, mas interage com pi (3, 4, 5) P3 e controle de transcrição de genes envolvidos na variação antigênica3. A cromatografia de afinidade e a análise de espectrometria de massas de proteínas IP ou PI que interagem de trypanosome, levedura ou células de mamíferos identificaram várias proteínas sem domínios de ligação IP ou PI conhecidos8,46, 47. os dados sugerem domínios proteicos não caracterizados adicionais que se ligam a estes metabolitos. Assim, a identificação de proteínas que interagem com IPs ou PIs pode revelar novos mecanismos de interação proteína-metabólito e novas funções reguladoras celulares para essas pequenas moléculas.

O método descrito aqui emprega a cromatografia de afinidade acoplada à mancha ocidental ou à espectrometria maciça para identificar as proteínas que ligam ao IPs ou ao PIs. Utiliza IPs biotinilados ou PIs que estão ligados a streptavidina conjugados a grânulos de agarose ou, alternativamente, capturados através de grânulos magnéticos conjugados com streptavidina (Figura 1). O método fornece um fluxo de trabalho simples que é sensível, não radioativo, Liposome-livre e é adequado para detectar a ligação de proteínas de lisados celulares ou proteínas purificadas3 (Figura 2). O método pode ser usado em Label-Free8,46 ou acoplado a espectrometria de massas quantitativa com rótulo de aminoácido47 para identificar proteínas de ligação IP ou PI de amostras biológicas complexas. Assim, este método é uma alternativa aos poucos métodos disponíveis para estudar a interação de IPs ou PIs com proteínas celulares e ajudará na compreensão da função regulatória desses metabólitos em tripanossomas e talvez outros eucariontes.

Protocolo

1. análise de proteínas de ligação IP ou PI por cromatografia de afinidade e western blotting

  1. Crescimento celular, Lise e cromatografia de afinidade
    1. Cresça as células T. brucei para a fase do mid-log e monitore a viabilidade e a densidade das células. Um total de 5,0 x 107 células é suficiente para um ensaio de ligação.
      1. Para as formas de corrente sanguínea, cultivar células em meios HMI-9 suplementados com soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° c e 5% CO2. Manter a densidade celular entre 8,0 x 105 a 1,6 x 106 células/ml.
        Nota: a densidade superior a 1,8 x 106 células/ml pode afetar a viabilidade celular. O tempo de duplicação da cepa T. brucei 427 cultivada in vitro é entre 5,5 e 6,5 h.
      2. Para formulários procíclica, cresça pilhas no meio SDM-79 suplementado com 10% FBS em 27 ° c e mantenha a densidade da pilha entre 1,0 x 107 e 3,0 x 107 Cells/ml.
      3. Para proteínas purificadas (por exemplo, proteínas recombinantes), tomar 0,5 a 1 μg de proteína e diluir em 450 μL de tampão de ligação (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2% 4-Nonyl fenil-polietileno glicol, pH 7,4). Mantenha 5% da proteína diluída (entrada) para a análise de Western Blot. Prossiga para o passo 1.1.7.
    2. Células centrífugas a 1.600 x g por 10 min à temperatura ambiente (RT). Descarte o sobrenadante.
      Observação: consulte a etapa 2.1.2 para obter informações adicionais sobre a centrifugação de grandes volumes de cultura.
    3. Ressuspender delicadamente o pellet em 10 mL do pH salino tamponado fosfato 7,4 suplementado com glicose de 6 milímetros (PBS-G) e pré-aquecido em 37 ° c para lavar as pilhas. Em seguida, Centrifugue as células a 1.600 x g durante 5 min em RT. Repita o procedimento duas vezes.
    4. Ressuscitem o pellet em 1 mL de PBS-G. Em seguida, transfira o volume para um tubo de 1,5 mL e centrifugue a 1.600 x g durante 5 min. descarte o sobrenadante.
      Nota: as pelotas da pilha podem ser flash congeladas no nitrogênio líquido e ser armazenadas em-80 ° c ou nitrogênio líquido.
    5. Ressuscitar o pellet em 0,5 mL de tampão de lise (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol, pH 7,4) suplementado com 1.5 x cocktail inibidor de protease e 1x inibidor da fosfatase cocktail (tabela de materiais) pré-refrigerados em gelo para Lise as células. Incubar lisado durante 10 min girando a 50 rpm a 4 ° c.
      Nota: esta é uma etapa crítica porque as proteínas podem degradar se não segurado como indicado. Verificar a integridade da proteína lisado por sódio Dodecil sulfato-poliacrilamida gel electroforese (SDS/PAGE), se necessário.
      Cuidado: T-octylphenoxypolyethoxyethanol é tóxico e pode causar irritação da pele e dos olhos. Use luvas, Eyeshield e proteção do acasalados.
    6. Centrifugue o lisado a 14.000 x g durante 10 min a 4 ° c. Colete o sobrenadante em um novo tubo de 1,5 mL para ensaios de ligação. Mantenha 5% do lisado total (entrada) para a análise de mancha ocidental. O sobrenadante contém proteínas parasitas extraídas com tampão de Lise.
    7. Colete 50 μL de IPs ou PIs conjugados a grânulos de agarose (i.e., 50 μL de chorume) ou 50 μL de grânulos de agarose e centrifugue por 1 min a 1.000 x g. Descarte o sobrenadante e ressuscitem em 50 μL de tampão de ligação para equilibrar os grânulos. Use grânulos não conjugados como um controle. Use IP/PI-Beads com diferentes configurações de fosfato, incluindo formas não fosforiladas para controlar as interações inespecíficas.
    8. Adicionar 50 μL de IP-ou PI-Beads para o lisado de células ou proteínas purificadas (cada 1 mL de grânulos contém 10 nmol de IPs conjugados ou PIs). Mantenha o volume de IP-ou PI-Beads dentro de 10% do lisado total e, se necessário, ajuste o volume de reação de ligação com o tampão de ligação.
      1. Para ensaios de competição, adicione à reação de ligação várias concentrações de IPs não conjugados ou PIs (por exemplo, excesso de molar de 1, 10, 100 vezes comparado a IP-ou PI-Beads).
    9. Incubar a reacção durante 1 h, ou durante a noite, a 4 ° c e girando a 50 rpm.
      Nota: as reações de ligação com proteínas purificadas podem ser feitas em RT, dependendo da estabilidade da proteína. Se usar IPs ou PIs conjugados à biotina, apenas prossiga para a etapa 1.1.9.1, caso contrário, prossiga para a etapa 1.1.10.
      1. Adicionar 50 μL de streptavidina-conjugados a grânulos magnéticos à reacção de ligação e incubar durante 1 h a 4 ° c girando a 50 rpm.
    10. Centrifugue a mistura durante 1 min a 1.000 x g a 4 ° c. Retire o sobrenadante (fluxo-através) e manter o pellet. Mantenha 5% do sobrenadante para análise de Western Blot.
      Nota: se usar grânulos magnéticos, remova sobrenadantes e realize lavagens subsequentes usando um suporte magnético (as centrifugações não são necessárias).
    11. Adicionar 1 mL de tampão de lavagem (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,2% 4-Nonyl fenil-polietileno glicol, pH 7,4) e ressuscita a resina tocando ou rodando o tubo (não use uma pipeta porque os grânulos podem anexar a pontas de pipeta). Centrifugue a reacção durante 1 min a 1.000 x g a 4 ° c e elimine o sobrenadante. Repita o procedimento para um total de cinco laves.
      Cuidado: o glicol de 4-Nonyl Phenyl-polietileno é tóxico e pode causar a irritação da pele e do olho. Use luvas, Eyeshield e proteção do acasalados.
    12. Adicionar 50 μL de 2x tampão de Laemmli suplementado com 710 mm 2-Mercaptoetanol aos grânulos e misturar tocando ou Vortex para eluir as proteínas. Aqueça em 95 ° c por 5 minutos, a seguir Centrifugue para 10.000 x g por 1 minuto e colete o sobrenadante (contenha proteínas eluída). Alternativamente, proteínas eluir com 8 M de ureia/100 mm de glicina pH 2,9 para evitar o uso de SDS. Congelar o eluato em-80 ° c, caso contrário, proceder à análise Western Blot.
      PRECAUÇÃO: 2-Mercaptoetanol é tóxico e pode causar irritações cutâneas, oculares e respiratórias. Use luvas e trabalhe na capa química.
  2. Western blotting análise
    1. Misture 15 μL de entrada (da etapa 1.1.6) ou fluxo-através de amostras (da etapa 1.1.10) com 5 μL do amortecedor de 4x Laemmli. A entrada de calor e fluxo-através de amostras para 5 min em 95 ° c. Para amostras eluidas em 8 M de ureia/100 mM de glicina pH 2,9, misture 15 μL de eluato com 5 μL de tampão de 4x Laemmli e aqueça por 5 min a 95 ° c.
      Nota: esta etapa não é necessária para amostras eluída no amortecedor de 2x Laemmli.
    2. Coloque os poços de 4-20% de gel SDS/PAGE com 2,5 μL de entrada, 2,5 μL de vazão e 20 μL de amostras eluidas e a escada de proteínas de carga de acordo com a recomendação do fabricante.
      Nota: escolha o gel% de acordo com o peso molecular da proteína de interesse.
    3. Execute SDS/PAGE em 150 V por 30-45 min no buffer de corrida, ou até que o corante azul do tampão Laemmli esteja no final do gel.
      Nota: o tempo de funcionamento pode variar consoante o equipamento de laboratório.
    4. Retire o gel das placas de vidro (ou plástico) e mergulhe no tampão de transferência durante 15 min.
    5. Transfira as proteínas para a membrana de difluoreto de polivinildeno (PVDF) ou membrana de nitrocelulose. Mergulhe as membranas e o papel de filtro de 3 mm no tampão de transferência. Montar um sanduíche com três folhas de papel de filtro, nitrocelulose ou membrana de PVDF, gel, e um adicional de três folhas de papel de filtro. Certifique-se de que nenhuma bolha de ar esteja presa no sanduíche. Use um rolo para remover bolhas, se necessário. Ajuste a membrana no cátodos e o gel no lado do ânodo da gaveta.
      Nota: Verifique as instruções do fabricante da membrana para obter informações sobre a activação da membrana ou a preparação do borrão.
    6. Coloque a gaveta que contém o sanduíche no tanque de transferência com tampão de transferência. Coloque o reservatório num balde de gelo ou a 4 ° c (por exemplo, na sala fria). Transferir proteínas a 100 V durante 1 h (a corrente varia entre 200-400 mA). Alternativamente, transfira durante a noite em uma corrente constante de 15 miliampères em 4 ° c.
    7. Retire a membrana da gaveta. Incubar a membrana em 6% de leite seco não gordo diluído em PBS com 0, 5% de polissorbato 20 (PBS-T), ou solução de bloqueio compatível, por 1 h em RT para bloquear a membrana.
      Nota: antes de bloquear a membrana, a qualidade da transferência pode ser verificada utilizando a mancha de PONCEAU S. Incubar a membrana durante 1 min em 15 mL de PONCEAU S, enxague em água e visualize bandas.
    8. Retire a solução de bloqueio e incubar a membrana por 1 h em RT com rotação de 50 rpm em anticorpos primários diluídos em 6% de leite seco não gordo diluído em PBS-T. Alternativamente, incubar a membrana durante a noite a 4 ° c com rotação de 50 rpm.
      Nota: o tempo de incubação pode variar de acordo com a qualidade dos anticorpos; no entanto, a maioria dos anticorpos funcionará com incubações de 1-3 h em RT. Siga a recomendação do fabricante para a concentração ou diluição de anticorpos.
    9. Lave a mancha incubando a membrana em PBS-T por 5 min com rotação de 50 rpm em RT. Repita o procedimento 3-5 vezes. Mais lava pode ser necessário dependendo da qualidade dos anticorpos.
    10. Incubar a membrana na peroxidase de rábano (HRP)-anticorpos secundários conjugados por 1 h em RT em 6% de leite seco não gordo diluído em PBS-T com rotação de 50 rpm.
      Nota: siga a recomendação do fabricante para a concentração ou diluição de anticorpos.
    11. Lave o Borrão como indicado no passo 1.2.9.
    12. Adicione o substrato quimioluminescente para cobrir a membrana. Retire o excesso de substrato e incubar por 5 min na RT no escuro.
      Nota: consulte as instruções do fabricante para obter recomendações sobre os reagentes de quimioluminescência.
    13. Capture o sinal quimioluminescente usando um Imager baseado em câmera. Alternativamente, use um filme de raios-X para capturar o sinal quimioluminescente.

2. análise de proteínas IP/PI-Binding por cromatografia de afinidade e espectrometria de massas

  1. Crescimento celular, Lise e cromatografia de afinidade
    1. Cresça as células T. brucei para a fase do mid-log e monitore a viabilidade e a densidade das células.
      Nota: um total de 1,0 x 1010 células é suficiente para dois ensaios de ligação. O uso de menos células do que o indicado aqui pode afetar a detecção de proteínas de baixa abundância por espectrometria de massas.
      1. Para os formulários da corrente sanguínea de T. brucei , cresça pilhas na fase do mid-log (8,0 x 105-1,6 x 106 Cells/ml) em meios HMI-9 suplementados com 10% FBS em 37 ° c e com 5% co2. Para 427 estirpe, 5 L de cultura renderá 0,5-1,0 x 1010 células. Monitore o crescimento celular para evitar a densidade superior a 1,8 x 106 células/ml que podem afetar a viabilidade celular. Manter o volume de cultura celular para 1/10 do volume do balão; caso contrário, a taxa de crescimento das células será afetada devido à má aeração.
        Nota: a estirpe 427 tem um tempo de duplicação de 5,5-6,5 h.
      2. Para formulários procíclica, cresça pilhas no meio SDM-79 suplementado com 10% FBS em 27 ° c e mantenha a densidade da pilha entre 1,0 x 107 e 3,0 x 107 Cells/ml. 500 mL de cultura renderá 0,5-1,5 x 1010 células.
    2. Centrifugue as células a 1.600 x g durante 15 min em RT. descarte o sobrenadante e resuma a pelota em 200 ml de PBS-g pré-aquecido a 37 ° c. Use tubos de centrifugação de fundo redondo (tabela de materiais) porque as pelotas do formulário da corrente sanguínea de T. brucei são perturbadas facilmente ao usar rotores do centrifugador do fixo-ângulo. Centrifugue as células novamente a 1.600 x g por 5 min em RT.
    3. Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet em 10 mL de PBS-G. Centrifugue as células a 1.600 x g durante 5 min em RT. Repita o procedimento e após a lavagem final, descarte o sobrenadante.
      Nota: as pelotas podem ser flash congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em-80 ° c ou nitrogênio líquido.
    4. Ressuscitem o pellet celular em 5 mL de tampão de Lise pré-resfriado no gelo e suplementado com coquetel de inibidor de protease de 1,5 x e coquetel de inibidor de fosfatase 1x (tabela de materiais). Incubar o lisado por 10 min a 4 ° c girando a 50 rpm.
    5. Centrifugue o lisado a 10.000 x g durante 10 min a 4 ° c. Recolher o sobrenadante (proteínas solubilizadas) e diluir-lo em 20 mL de tampão de ligação.
    6. Colete 400 μL de IPs ou PIs conjugados a grânulos de agarose (i.e., 400 μL de chorume) ou 400 μL de grânulos de controle, e centrifugue por 1 min a 1.000 x g em RT. descarte o sobrenadante e ressuscitem em 400 μL de tampão de ligação para equilibrar os grânulos. Use grânulos de agarose como um controle negativo para determinar o enriquecimento específico de interações proteína-metabolito em comparação com interações inespecíficas (por exemplo, proteínas que ligam não especificamente para os grânulos). Use IPs ou PIs com diferentes configurações de fosfato, incluindo formas não fosforiladas para controle de interações inespecíficas devido a cargas de fosfato ou ligação à biotina.
    7. Adicionar 400 μL de IP/PI-Beads ou grânulos de controle a 10 mL de lisado e incubados por 1 h, ou durante a noite, a 4 ° c girando a 50 rpm. Se usar IPs ou PIs conjugados com biotina somente (sem grânulos) prossiga para a etapa 2.1.7.1, caso contrário, prossiga para a etapa 2.1.8.
      1. Adicionar 100 μL de streptavidina-conjugados a grânulos magnéticos e incubar durante 1 h a 4 ° c girando a 50 rpm.
    8. Centrifugue a reacção de ligação durante 1 min a 1.000 x g a 4 ° c. Retire o sobrenadante (fluxo-através) e manter o pellet. Mantenha 5% do sobrenadante para análise de Western Blot.
    9. Adicione 5 mL de tampão de lavagem à pelota, misture delicadamente girando o tubo, e centrifugue então por 1 minuto em 1.000 x g em 4 ° c. Descarte o sobrenadante. Repita a lavagem cinco vezes. Se estiver usando grânulos magnéticos, colete sobrenadantes e realize lavagens usando um suporte magnético (as centrifugações não são necessárias).
    10. Adicionar 50 μL de 2x tampão de Laemmli (ou 8 M de ureia/100 mM de pH glicina 2,9, para evitar o uso de SDS) para os grânulos e misturar tocando ou Vortex (Evite pipetagem porque os grânulos podem anexar a pontas de pipeta) e, em seguida, aqueça a 95 ° c por 5 min. centrífuga para 10.000 x g por 1 min e recolher o sobrenadante (proteínas eluted). Repita o procedimento duas vezes para coletar um total de três frações.
    11. Congelar o eluato em-80 ° c, de outra forma separar as proteínas em SDS/PAGE ou manter em solução para a análise de tripsinização e espectrometria de massas.
  2. Tripsina digestão de proteínas para espectrometria de massas
    Nota: duas variações deste procedimento são mostradas para a seção 2.2.1 (em gel) ou seção 2.2.2 (em solução) digestão de proteínas. Os tubos de ligação de baixa proteína são recomendados para evitar perdas de amostras. Consulte um químico analítico na instalação de proteômica a adequação do protocolo para amostras e instrumentos de espectrômetro de massas disponíveis.
    1. Tripsinização in-gel das proteínas
      1. Após a separação da proteína em SDS/PAGE, enxague brevemente o gel na água da elevado-pureza. Transfira o gel para uma placa de vidro limpa. As bandas de proteína de consumo com uma lâmina limpa e evitar o corte extra gel fora bandas. Cortar as peças de gel em pedaços pequenos (ou seja, aproximadamente 1 mm quadrados) e transferi-los para um tubo de 1 mL. Use uma ponta de pipeta, se necessário, mas certifique-se de que a ponta da pipeta é enxaguada em etanol antes de usar.
        Nota: use luvas para evitar a contaminação do gel. As peças de gel podem ser armazenadas a-20 ° c.
      2. Adicione 100 μL de água de grau de cromatografia líquida de alta pureza ou alto desempenho a tubos para enxaguar peças de gel. Descarte a água.
        1. Para peças de gel com coloração fluorescente à base de Coomassie ou rutênio, incubar as peças de gel na solução de destaining (25 mM NH4HCO3 em 50% acetonitrila) por 1 h e, em seguida, descarte a solução. Repita o procedimento até que a coloração não esteja visível.
          Nota: Prepare soluções contendo NH4HCO3 por diluição de uma solução de estoque em 100 mm NH4HCO3, pH 7,8.
          Cuidado: o acetonitrila é um solvente volátil, inflamável e tóxico. NH4HCO3 pode causar irritação cutânea ou ocular. Use luvas e trabalhe um capuz químico.
        2. Para peças de gel manchada de prata, incubar peças em gel em 50 μL de solução de destaining para mancha de prata (15 mM K3[Fe (CN)6], 50 mm na2S2o3) em água por 30 min. descarte a solução e lave peças de gel com 200 μl de água. Repita a lavagem cinco vezes ou até que a cor amarela do gel não esteja visível.
          PRECAUÇÃO: K3[Fe (CN)6] pode provocar irritação cutânea ou ocular. Use luvas.
      3. Desidratar as peças de gel utilizando 200 μL de acetonitrila durante 10 min em RT. Em seguida, descarte a solução.
        Nota: as peças de gel desidratadas são menores em volume, opaco e pegajoso. Se vários pedaços de gel são combinados em um tubo, repita o procedimento para a desidratação eficiente de peças de gel.
      4. Adicionar 50 μL (ou volume suficiente para cobrir as peças de gel) de solução de redução (10 mm ditiotreitol [DTT] em 100 mm NH4HCO3) e incubar a 56 ° c por 1 h. depois, resfriar os tubos para RT e descartar o excesso de solução de redução.
      5. Adicionar 50 μL (ou volume suficiente para cobrir as peças de gel) de solução de alquilação (50 mM iodoacetamida em 100 mM NH4HCO3) e incubar por 30 min na RT no escuro. Depois, descarte o excesso de solução de alquilação.
      6. Desidratar as peças de gel com 200 μL de acetonitrila durante 10 min em RT. Retire o acetonitrila e hidratar as peças de gel com 100 mM NH4HCO3 por 10 min em RT.
      7. Deshidratar as peças de gel novamente com 200 μL de acetonitrila durante 10 min em RT e descartar o excesso de solução.
      8. Adicionar 15 μL de tripsina de classe de espectrometria de massas diluída em 50 mM NH4HCO3 tampão, ou volume suficiente para cobrir peças de gel hidratado e incubar por 4 h, ou durante a noite, a 37 ° c. Mantenha quantidades totais de tripsina entre 100 a 500 ng (ou 20 ng tripsina/μg de proteína).
      9. Resfrie a amostra para RT, e centrifugue por 1 min a 2.000 x g em uma microcentrífuga. Adicionar 10-20 μL de ácido fórmico a 5% diluído em água e incubar durante 10 min na RT.
        Cuidado: o ácido fórmico é inflamável, corrosivo e tóxico. Use luvas e trabalhe um capuz químico.
      10. Centrifugador como indicado na etapa 2.2.1.9, a seguir colete o sobrenadante (contenha peptídeos extraídos) a um tubo diferente. Adicionar 20 μL de ácido fórmico a 5% diluído em 50-60% acetonitrila ao tubo e incubar por 10 min em RT. coletar frações peptídicas extraídas no mesmo tubo.
      11. Seque a amostra em um concentrador de vácuo e reconstitua em 10 μL de ácido acético a 0,5% e 2% de acetonitrila para análise de espectrometria de massas. Centrifugue e colete a solução na parte inferior do tubo; solução de armazenamento a-20 ° c ou-80 ° c.
    2. Em solução de tripsinização de proteínas
      1. Precipitate proteínas para reduzir o volume da amostra, dessalinagem, e troca de buffer. Adicione seis volumes de acetona refrigerada (-20 ° c) à amostra, por exemplo, 600 μL de acetona a 100 μL de amostra. Vortex e incubar a-20 ° c durante 15 min a 1 h. A solução vai ficar turva ou formar um precipitado.
        Cuidado: a acetona é tóxica e inflamável. Use luvas e trabalhe um capuz químico.
      2. Centrifugar amostras a 4 ° c durante 30 min. decantar a acetona e secar o pellet durante 15 min.
      3. Adicionar 10 μL de 6-8 M de ureia ou 1% de SDS em 50 mM NH4HCO3 para dissolver o pellet e o vórtice para misturar. Para quantidades maiores de proteínas (> 10 μg), utilize até 20 μL de tampão de dissolução.
      4. Adicionar 5 μL de solução de redução e Vortex. Gire o volume para baixo usando uma microcentrífuga. Se as amostras forem diluídas em ureia, então incubar por 1 h na RT. Se as amostras forem diluídas em SDS, então incubadas por 1 h a 56 ° c.
      5. Gire o volume para baixo usando uma microcentrífuga. Adicionar 3 μL de solução de alquilação e Vortex. Em seguida, gire o volume para baixo e incubar no escuro por 30 min em RT.
      6. Adicionar 3 μL de solução redutora para neutralizar a reacção. Diluir lentamente a amostra para 1 M de ureia ou 0, 5% SDS usando 50 mM NH4HCO3.
        Nota: o tampão de digestão de tripsina deve ter detergente ou desnaturante. Os limites de concentração para desnaturantes são: 0, 5% SDS; 0,1% octil B-D-glucopirranosídeo; 0,1% 4-nonylphenyl-polietileno glicol; 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol; 0,1% polissorbato 20; 0,1% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonato; < 1 M de ureia ou tiourea.
      7. Adicionar 5 μL de tripsina de classe de espectrometria de massas diluída em 50 mM NH4HCO3 tampão e incubar por 4 h, ou durante a noite, a 37 ° c. Mantenha quantidades totais de tripsina entre 100 e 500 ng (ou 20 ng tripsina/μg de proteína).
      8. Esfrie a amostra para RT, e gire o volume para baixo usando uma microcentrífuga. Adicionar 5% de ácido acético (ou 5% de ácido fórmico em 50% acetonitrila) para saciar a reação.
      9. Seque as amostras em um concentrador do vácuo como indicado na etapa 2.2.1.11. Armazene amostras em-80 ° c. Peptídeos de desalt e concentrado usando uma coluna de fase invertida, como o zip-Tip C18 e, em seguida, analisar por espectrometria de massa.

Resultados

Análise da interação RAP1 e PI (3, 4, 5) P3 por cromatografia de afinidade e western blotting
Este exemplo ilustra a aplicação deste método para analisar a ligação de PIS por RAP1 de t. brucei lisado ou por t. brucei recombinante proteína RAP1. Lisados de T. brucei formas de corrente sanguínea que expressam hemaglutinina (ha)-Tagged RAP1 foram utilizados em ensaios de ligação. RAP1 é uma proteína envolvida no controle transcricional de genes de glicoproteína d...

Discussão

A identificação de proteínas que se ligam a IPs ou PIs é fundamental para compreender a função celular desses metabólitos. A cromatografia de afinidade acoplada ao borrão ocidental ou à espectrometria maciça oferece uma oportunidade de identificar IP ou PI que interagem proteínas e daqui obtêm introspecções em sua função regulamentar. IPs ou PIs quimicamente marcados [por exemplo, ins (1, 4, 5) P3 quimicamente ligados à biotina] e reticulados a grânulos de agarose via estreptavidina ou capturados por gr...

Divulgações

O autor não tem nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia do Canadá (NSERC, RGPIN-2019-04658); Suplemento de lançamento de descoberta NSERC para pesquisadores de carreira precoce (DGECR-2019-00081) e pela Universidade McGill.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneSigma-Aldrich650501Ketone
AcetonitrileSigma-Aldrich271004Solvent 
Ammonium bicarbonateSigma-AldrichA6141Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MIBeckman CoulterAvanti J6-MICentrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botlesSigma-AldrichB1408Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control BeadsEchelonP-B000-1mlAffinity chromatography reagent - control
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad1610610Reducing agent
Dynabeads M-270 StreptavidinThermoFisher Scientific65305Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001Protease inhibitors
Electrophoresis running bufferBio-Rad161073225 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesCorning Life Sciences430052To centrifuge 10 mL cultures
Formic acidSigma-Aldrich106526Acid
GlycineSigma-AldrichG7126Amino acid
HMI-9 cell culture mediumThermoFisher ScientificME110145P1Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein StainThermoFisher Scientific24615Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 BeadsEchelonQ-B0145-1mlAffinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry MilkThomas ScientificC837M64Blocking reagent for Western blotting
IodoacetamideSigma-AldrichI6125Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab RotatorThomas Scientific1159Z92For binding assays
LoBind Microcentrifuge TubesThermoFisher Scientific13-698-793Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630)Sigma-Aldrich21-3277Detergent
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010031Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescenceThermoFisher Scientific32106Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail TabletsRoche4906845001Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP BeadsEchelonP-B003a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP BeadsEchelonP-B034a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8EchelonP-3908-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP BeadsEchelonP-B345a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B035a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP BeadsEchelonP-B004a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8EchelonP-4508-1mgAffinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B045a-1mlAffinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP BeadsEchelonP-B005a-1mlAffinity chromatography reagent 
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III)Sigma-Aldrich702587Potassium salt 
PtdIns PIP BeadsEchelonP-B001-1mlAffinity chromatography reagent 
PVDF MembraneBio-Rad1620177For Western blotting 
Refrigerated centrifugeEppendorf5910 RMicrocentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich862010Detergent
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich72049Chemical 
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermoFisher ScientificSPD120-115Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture ThermoFisher Scientific159910To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry GradePromegaV5280Trypsin for protein digestion
UreaSigma-AldrichU5128Denaturing reagent
VortexFisher Scientific02-215-418For mixing reactions
Western blotting transfer bufferBio-Rad161073425 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paperSigma-AldrichWHA3030861Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M)Bio-Rad1610710Reducing agent
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561094Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0747Protein loading buffer

Referências

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