מדידה כמותית של מתוך מסונתז חלבונים בעכברים

Summary

רמת החלבון של נוזל השדרה הגבוה יכול להיות תוצאה של דיפוזיה של חלבון פלזמה על פני מחסום דם-מוח שונה או סינתזה התוך. פרוטוקול בדיקה מיטבי מוצג במאמר זה, המסייע להפלות את שני המקרים ומספק מדידות כמותית של חלבונים מסונתז באופן פנימי.

Abstract

נוזל מוחי שדרתי, נוזל שנמצא במוח ואת חוט השדרה, הוא בעל חשיבות רבה למדע בסיסי וקליני. ניתוח הרכב חלבון שדרתי מספק מידע חיוני במחקר בסיסי במדעי המוח, כמו גם מחלות נוירולוגיות. אזהרה אחת היא כי חלבונים הנמדדים בתוך שדרתי עשוי לנבוע הן סינתזה הפנימי והטראנזפה מן הנסיוב, וניתוח חלבונים של שדרתי יכול רק לקבוע את הסכום של שני רכיבים אלה. על מנת להפלות בין החלבון המופק מהדם לבין החלבונים המיוצרים בדגמי בעלי חיים, כמו גם בבני אדם, מדידות חלבון שדרתי פרופיל באמצעות כלים קונבנציונליים ניתוח חלבון חייב לכלול את החישוב של המנה האלקטרוליציונלית/סרום (Q_{אלבומין}), סמן של השלמות של הממשק בדם-מוח (bbi), ואת מדד החלבון (Q_חלבון/q_{אלבומין}), הערכה של סינתזה החלבון הפנימי. פרוטוקול זה ממחיש את ההליך כולו, מ שדרתי ואיסוף דם לחישובי quotients ואינדקסים, עבור המדידה הכמותית של סינתזה החלבון הפנימי וליקוי BBI בדגמי העכבר של הפרעות נוירולוגיות.

Introduction

נוזל מוחי שדרתי, נוזל ברור וחסר צבע סביב המוח וחוט השדרה, מחזיק בחשיבות מדעית קלינית ובסיסית גדולה. המוח השדרתי משמר את הסביבה האלקטרוטית של מערכת העצבים המרכזית (CN), מאזנת את הסטטוס בסיס חומצה מערכתית, אספקת חומרים מזינים לתאי העצבי והגליאל, פונקציות כמו מערכת הלימפה עבור ה-CN, ו הובלות הורמונים, נוירוטרנסמיטורים, ציטוקינים ונוירופפטידים אחרים ברחבי ה-CN¹ לפיכך, כאשר הרכב הנוזל הנוזלי משקף את הפעילות של ה-CN, החומר הזה מציע מגוון בעל ערך, אם כי עקיף, גישה לאפיון המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של ה-CN.

שדרתי שימוש כדי לאבחן את התנאים המשפיעים על ה-CN למעלה ממאה שנים, ובמשך רוב הזמן הזה, הוא למד בעיקר על ידי מטפלים ככלי אבחון. עם זאת, בשנים האחרונות נוירוביולוגים הכירו את הפוטנציאל של שדרתי לחקר הפתופסולוגיה של ה-CN. בפרט, מספר כלי ניתוח חלבון בתפוקה גבוהה הוצגו בתחום מדעי המוח המאפשר מחקר מפורט של הרכב החלבון של שדרתי, עם הציפייה כי ניתוח זה עשוי לעזור לספק תובנה שינויים דינמיים תרחשות בתוך ה-CN.

התפתחויות טכנולוגיות בשיטות חיסוני מולטיפלקס כגון לומיקס וסימוע טכנולוגיות^2,3, לספק לחוקרים היום עם היכולת לזהות מאות חלבונים בריכוזים נמוכים מאוד. כמו-כן, אותן טכנולוגיות מאפשרות שימוש באמצעי אחסון קטנים לדוגמה, ובכך לקדם מחקרים בבעלי חיים קטנים, כולל עכברים, בהם כמויות מוגבלות של מדגם שדרתי מנעה באופן מוגבל תווים מפורטים של הנוזל עד לאחרונה.

אף על פי כן, אזהרה אחת היא כי חלבונים הנמדדים בתוך שדרתי עשוי לנבוע סינתזה הפנימי ו/או ההמרה מן הנסיוב בשל ממשק דם פגום מוח (BBI). למרבה הצער, ניתוח חלבונים של שדרתי בלבד יכול רק לקבוע את הסכום של שני רכיבים אלה. כדי להפלות בין transudate ובין הייצור חלבונים, מדידות חלבון שדרתי באמצעות כל הכלי הזמין ניתוח חלבון חייב להיות מותאם לשונות בודדות ריכוזי סרום, כמו גם שלמות המכשול. עם זאת, למרות התאמה זו משמשת בדרך כלל בפרקטיקה קלינית, למשל, המדד igg שדרתי, אשר יש רגישות גבוהה לזיהוי הפנימי סינתזה igg^4,5,6, עד תאריך מחקרים מעטים מאוד מתוקן ריכוזי חלבון שדרתי לריכוז סרום ושלמות המכשול^7,8.

כיום, הגישה הרייברגרמה היא הדרך הטובה ביותר לקבוע את תפקוד המכשול וסינתזה של חלבונים. זהו הערכה גרפית בדיאגרמות שדרתי/סרום מנה אשר מנתחת, באופן משולב, הן המכשול (dys) פונקציה סינתזה חלבון הפנימי, המתייחס חלבון בלעדי דם נגזר^9,10. אלבומין החלבון העשיר ביותר נבחר בדרך כלל חלבון התייחסות כי הוא מיוצר רק בכבד ובגלל גודלו, כ 70 kDa, הוא ביניים בין חלבונים קטנים וגדולים¹¹. דיאגרמת הניתוח הוגדרה לראשונה על ידי "רייבר ופלינהאואר" ב-1987 לכיתות הגדולות של האימונוגלובונים¹¹, המבוססות על התוצאות שהתקבלו מניתוח של אלפי דגימות אדם⁹. הגישה אושרה לאחר מכן על ידי יישום שני חוקי הדיפוזיה של Fick בתאוריה של דיפוזיה מולקולרית/שיעור זרימה¹². תיאוריה מעין זו ממחישה את הדיפוזיה של חלבון דרך המכשול יש התפלגות היפרבולי יכול להסביר את הדינמיקה של חלבונים ב-cn^9,13. בסך הכל, היתרון של שימוש ברייברגרמה לצורך הוכחת סינתזה החלבון הפנימי הוא שהוא במקביל מזהה את שבר החלבון הנכנס השדרתי מן הנסיוב, כמו גם את כמות החלבון שנמצא השדרתי בגלל הייצור המקומי.

המאמר הנוכחי והפרוטוקול הקשור מתארים את ההליך כולו, מתוך מתקן שדרתי ואיסוף דם לחישובים הסופיים לתיקון שדרתי את רמות החלבון, עבור המדידה הכמותית של סינתזת החלבון הפנימי במודלים של העכבר הנוירולוגי פרעות. הליך זה מספק תוכנית בסיסית שממנה יש להעריך (1) את המקור הפתופסולוגי של חלבון שדרתי כלשהו ו-(2) את היציבות והמשמעות הפונקציונלית של שלמות המכשול. הליך זה ופרוטוקול אינם שימושיים רק להערכת דגימות של העכבר, אבל הם גם שימושיים בניתוח שדרתי בהמון מודלים בעלי חיים של מחלות נוירולוגיות וחולים אנושיים.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים מנצל פרוטוקולים שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) בבית הספר של גייזל לרפואה בדרתמות.

1. איסוף נוזלים

הערה: הסרום והשדרתי הינם נדרשים. שני פרוטוקולים עבור כל אוסף נוזלים נחוצים להישרדות ונקרופסי.

1. אוסף של נסיוב ושדרתי שימוש בהליכי הישרדות
   הערה: לאיסוף נוזלי הישרדות, הסרום צריך להקדים את האוסף שדרתי כפי שהוא הליך פולשני פחות. יש להשיג בתוך שבוע. של משיכה בסרום
   1. רטרו-המסלול דימום הליך עבור אוסף הנסיוב.
      הערה: הליך זה מיועד לדימום הישרדות של עכברים¹⁴. ההליך המתואר חל על כל גיל, מין, והזן של עכברים. מאז הכללים IACUC להכתיב כי נפח דם מקסימלי של 1% ממשקל הגוף ניתן להסיר כמו לצייר דם יחיד, מומלץ ההליך מבוצע רק על עכברים במשקל יותר 15 g.
      1. הזז את הכלובים המכילים עכברים מארון התקשורת לאזור עבודה מתאים. הכינו את מכונת הגז ההרדמה על ידי הפעלת מד זרימת החמצן ל-1 L/min.
      2. הציבו את החיה בחדר האינדוקציה וסגרו את המכסה בחוזקה. הפעל את מכשיר האידוי ל3.5% ונטר את בעל החיים עד שכיבה.
      3. הסר את בעל החיים מן החדר ולהעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס, כלומר, המשרד לצבוט footpad. להבטיח עומק הולם של הרדמה לפני ביצוע ההליך: חוסר תגובה לצביטה איתנה מעיד על הרדמה נאותה.
      4. רסן את העכבר המורדם על ידי האוחז בעור רופף מאחורי האוזניים עם האגודל והאצבע המורה של היד הלא-דומיננטית. הבליטה את העיניים באמצעות האצבע המורה כדי לצייר בחזרה את העור מעל העין ואת האגודל כדי למשוך בחזרה את העור מתחת לעיניים.
      5. מניחים את קצהו של פיפטה פסטר לתוך שקע העין מתחת לעין (איור 1, הלוח השמאלי), ומכוון את הטיפ כ-45 ° לכיוון מרכז שקע העין (איור 1, הלוח הימני). סובב את הפיפטה בין האצבעות במהלך המעבר הקדמי. הפעילו לחץ עדין ושחררו עד שהדם נכנס לפיפטה.
         הערה: כמות מקסימלית של דם שניתן לפרק בבת אחת מן המיקום הזה הוא כ 1% ממשקל הגוף, למשל, 0.2 mL מ 20 גרם העכבר.
      6. בעדינות להסיר את הנימים כדי למנוע פגיעה בעין ומניחים את הדם שנאסף בשפופרת צנטריפוגה 1.5 mL. לסגור את העפעף ולהחיל לחץ קל עם גזה כדי למנוע דימום נוסף. לאחר התראה מלאה וניידים (בדרך כלל 3-5 דקות), להחזיר את העכבר לכלוב ההחזקה שלו.
      7. אפשר לקריש דם במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן הצנטריפוגה דם עבור 10 דקות ב 2,000 x g ב -4 ° c צנטריפוגה בקירור. באמצעות טכניקת צנרת נקייה, לאסוף סרום לתוך חדש, המסומן בקבוקון 0.5 mL. בקבוקון מיידי של סרום ב-80 ° c.
   2. אוסף שדרתי בתהליך הישרדות
      הערה: הליך זה מיועד לניתוח הישרדות, והוא מבוסס על הפרוטוקול שפורסם על ידי ליו ו דאף ב-2008¹⁵. העכברים מורדם על ידי קטמין (20 מ"ג/ml), xylazine (0.5 mg/ml), ו-איזופרומאזין (0.5 mg/ml) קוקטייל מנוהל intraperitoneally.
      1. הזז את הכלובים המכילים עכברים מהמדף לאזור עבודה מיועד לניתוח. הכן מרחב ניתוח בסביבה סטרילית. ודא כי כל המכשירים והחומרים המשמשים הם מעוקר לפני הניתוח.
      2. שוקלים את העכבר ולחשב את נפח ההרדמה הדרוש (0.1 mL של קוקטייל הרדמה עבור 20 גרם עכבר). . הכנס intraperitoneally הרדמה¹⁶ אחרי כמה דקות, לבדוק את העכבר על ידי צובט את footpad כדי להבטיח הרדמה נאותה. אם נדרש יותר הרדמה, הכנסה נוספת 0.01 ל0.03 mL של קוקטייל הרדמה.
      3. השתמש או מספריים או מכונת גילוח כדי לגלח אזור קטן של הראש, על קצה caudal, המדיאלי על הגולגולת, כדי לחשוף שטח עבודה גדול מספיק לאוסף שדרתי. הצב את העכבר בתנוחה הנוטה על המכשיר הסטריאוטקאלי, והגבר את הראש באמצעות פסיהאוזן (איור 2 א).
         הערה: העכבר מונח כך שהראש יוצר זווית כמעט 135 ° עם הגוף (איור 2A). לאחר שבעל החיים מוצב, משתמשים בעטוף כירורגי כדי לשמור על שדה סטרילי באתר הכירורגי. וילונות דבק ברור הם העדיפו עבור אוסף שדרתי בעכברים, כפי שהם מאפשרים ויזואליזציה ישירה וממוקדת יותר של החיה.
      4. לנגב את האתר כירורגי עם 30% כלורהקאיטין diacetate. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך משונן של העור נחות occiput לחשוף את השרירים על גבי cisterna מגנה.
      5. על ידי ניתוח קהה עם מלקחיים, להפריד את הרקמה התת עורית ואת השרירים כדי לחשוף את cisterna מגנה (איור 2B). השתמש בטרקטורים כדי להחזיק את השרירים בנפרד (איור 2B) ולחשוף את השכבה המנcisterna של דורא מאטר על פני הגנה.
      6. שטוף בעדינות עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט סטרילית (PBS) כדי להסיר זיהום דם אפשרי. כתם יבש מאטר דורא עם ספוגית כותנה סטרילית בעדינות לנקב את הקרום המכסה את cisterna מגנה עם המחט 30 G. במהירות ובעדינות להוסיף צינור זכוכית קטנה נימי לאסוף שדרתי (איור 2C).
         הערה: לחץ תוך-גולגולתי מאפשר לזרם באופן ספונטני לזרום בצורה ספונטנית לקפילר (איור 2C). בהתאם לגיל ולגודל של העכבר, כ 5 למעלה-12 μL של שדרתי מתקבל מכל עכבר.
      7. הסירו בזהירות את צינורית הקפילר מהקרום. לחבר את הצינור ל 3 מ ל מזרק דרך אבובים פוליאתילן (טבלה של חומרים) ולהזריק את המבחנה שנאספו לתוך מתויג 0.5 mL צינור (איור 2d). . שמור על הבקבוקונים בקרח
      8. סגירת חתך באמצעות תפר polydioxanone (PDS) עם מחט חד פעמי באמצעות תפרים קבורים¹⁷. לנקות את האזור של דם יבש או רקמות.
      9. הכנס עכברים, תת-עורי או intraperitoneally¹⁶, עם 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג של בופרינורפין הידרוכלוריד כטיפול כאבים. כמו כן, להזריק תת-עורי 1 מ ל של תמיסת מלח סטרילי כדי למנוע התייבשות.
      10. מניחים את העכבר חזרה בכלוב נקי וחמים להחלמה. ברגע שהעכבר נייד ומסוגל להגיע למזון ולמים, הנח את הכלוב בחזרה על המדף.
      11. צנטריפוגה שדרתי עבור 10 דקות ב 1,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס צנטריפוגה בקירור. בדוק את מידת זיהום הדם על ידי בדיקה חזותית לזיהוי של קסנטוכרומיה ונוכחות של גלולה אדומה בתחתית הצינור. . התעלם מדגימות מזוהמות דם
          הערה: הנוסחה המשמשת לתיקון כמויות חלבון מתוך שדרתי בדגימות דם מזוהמות מבוססת על פרמטרי המשוואה הכוללים תוכן חלבון ב שדרתי וסרום, המטוקריט (HCT), ותאי דם אדומים (RBC) לספור ב שדרתי דם¹⁸. עם זאת, אסטרטגיית תיקון כזו לא יכולה להיות מוחלת בקלות על דגימות שדרתי של העכבר בגלל הנפח הקטן, ולכן להגביל את אסטרטגיית התיקון לבדיקה חזותית.
      12. באמצעות טכניקת צנרת נקייה, לאסוף את שפופרת הזרע לתוך צינור חדש 0.2 mL, משאיר מאחורי הגלולה עם תאים. דלל את שדרתי 1:3 עם PBS כדי להפחית את אובדן נפח עקב תרסיס. להקפיא מיד את המבחנה של שדרתי ב-80 ° c.
2. אוסף של סרום ומלא שדרתי באמצעות הליכי אי-הישרדות
   הערה: עבור אוסף נוזלים שאינם להישרדות, אוסף שדרתי מקודם אוסף הנסיוב כמו העכבר צריך להיות דופק.
   1. איסוף שדרתי
      הערה: הליך זה מיועד לניתוח אי-הישרדות, ובערך 10-20 μL של שדרתי מתקבל מכל עכבר. שדה כירורגי סטרילי מומלץ, אך אינו נדרש ניתוח שאינו הישרדות.
      1. הזז את הכלובים המכילים עכברים מארון התקשורת למרחב עבודה נוח. בצע את השלבים 1.1.2.2-1.1.2.7 ו 1.1.2.11-1.1.2.12 עבור אוסף שדרתי. המשך למדור 1.2.2. עבור אוסף הנסיוב
   2. איסוף דם באמצעות ניקוב תאיים (גישה פתוחה)
      הערה: כמויות הדם הצפויות הוא כ 3% ממשקל הגוף, למשל, 0.6 mL מ 20 גרם עכבר.
      1. האוסף העוקב אחר השדרתי מבטיחים שהעכבר עדיין מורדם מספיק על ידי צביפת הרגליים. אם כל תגובה היא נצפתה, לתת מנה שנייה של הרדמה. . אם התגובה לא נצפתה, המשך
      2. מניחים את החיה על הגב לנקות את העור על הבטן עם 70% אלכוהול. עם מספריים כירורגיים, פתחו את חלל. החזה וחשפו את הלב הכנס מחט של 25 גרם (המצורפת ל 3 מזרק mL) לתוך החדר השמאלי ולהחיל בעדינות לחץ שלילי על המזרק מזרק. משיכת המחט לאחר דם נאסף.
      3. לבצע שיטה משנית של המתת חסד כגון עריפת ראש או פריקה צוואר הרחם כדי להבטיח כי החיה הוא נפטר.
      4. לדחוף את הבוכנה של המזרק למטה ולהזריק את הדם שנאסף לתוך בקבוקון 1.5 mL. אפשר דם כדי קריש 30-60 דקות ב RT ולאחר מכן צנטריפוגה אותו עבור 10 דקות ב 2,000 x g ב-4 מעלות של צנטריפוגה בקירור.
      5. באמצעות טכניקת הפיפטה נקי, לאסוף סרום לתוך בקבוקון חדש, המסומן 0.5 mL. בקבוקון הקפאה מיידי של סרום במקפיא של 80 ° c.

2. אנליזת חלבון

1. השתמש בשיטה מועדפת, לדוגמה, טכנולוגיית לומיקס, עבור כימות חלבון היעד (ים) ואלבומין בדגימות שדרתי.
   הערה: הנה, דוגמה ניתנת עם טכנולוגיה מגנטית של לומיקס, אך כמעט כל טכניקה המודד כמויות חלבונים, כולל חיסוני הקשורות לאנזימים (אליפי), ניתן להחיל על הפרוטוקול הנוכחי. באופן אידיאלי, דגימות שדרתי וסרום מופעל לשני אלבומין והיעד חלבונים על אותה פלטפורמה. תנאי שילובים חייב להיות ממוטב עבור צעדים מכריעים בפרוטוקול כגון, אנטיגן מצמד הריכוז, סרום ו שדרתי לדוגמה דילול, עקומות סטנדרטיות התאמה הטובה ביותר עבור כל אנליטה, והרכב המאגר כדי להפחית את הפעילות החוזרת לא ספציפית. אם משתמשים בערכה מסחרית למדידת חלבונים, לדוגמה, ערכת הקלדה החיסוני האיזובולין (רשימת חומרים) המשמש לקבלת נתונים המוצגים באיור 3, הוראות היצרנים יש לעקוב.
   1. עם הפשרה ולפני ניתוח, צנטריפוגה שדרתי ודגימות סרום (2,000 x g עבור 10 דקות) ולהשתמש supernatant כדי למנוע סתימת לוחיות הסינון ו/או לחקור. בצע את תהליך הטיפול שסופק עם הערכה עבור מדלל דגימה המתאימות. אחרת, לקבוע את הדילול המתאים עבור כל האנליטה ונוזל. . לדלל דגימות בערוץ הPBS בהתאם
      הערה: אם אין הנחיות מסוימות או הוראות, מדלל עבור כל אנליטה ונוזל צריך להיות מוקם לפני הבדיקה המחקר, על ידי קביעת טווחי דילול המתאים הדרושים כדי להשיג הערכות ריכוז הנופלים בתוך ה טווח אמין של עקומה סטנדרטית. הכרת המאפיינים של המדגם הביולוגי להיות מנותח, למשל, ריכוזים פיזיולוגיים ופתולוגיים בנוזל, מאפשר לנסות מדלל שונים עם דגימות של תוכן נמוך, בינוני, וגבוה. אם הטווח הצפוי של ריכוזים בדגימות ידוע פריורי, הדילול ניתן לבחור לאחר חישוב כמה פעמים המדגם צריך להיות מדולל כדי להיות בתוך טווח העיקול הרגיל הנבחר.
      התראה: על-ידי חישוב גורמי הדילול, זכור כי שדרתי כבר מדולל 1:3.
   2. הכן עקומה סטנדרטית עבור כל חלבון של עניין, למשל, אלבומין ו IgG כפי שנעשה שימוש כדי ליצור נתונים באיור 3, על ידי התייחסות מדלל סדרתי חלבונים סטנדרטיים. במהלך הכנת עקומות סטנדרטיות, לערבב ביסודיות כל ריכוז גבוה לפני ביצוע הדילול הבא.
      הערה: ללא קשר לשיטה שנבחרה לכמת, הכרחי לכלול עיקול סטנדרטי בכל פעם שההערכה מבוצעת להערכת החלבון (עם) ריכוז בדגימות. הבחירה הטובה ביותר עבור תקן התייחסות היא ריכוז מזוקק, ידוע של חלבון הריבית. ההחלטה על הדילול הספציפי, כמו גם על מספר נקודות הנתונים והמשכפלת המשמשות להגדרת העקומה הסטנדרטית, תלויה בדרגת היניאריות בעקומה הסטנדרטית.
   3. בחר את התאים המתאימים לנוגדנים מגנטיים מצמידים (טבלת חומרים). עבור מבחנות בודדות של חרוזים, sonicate כל בקבוקון עבור 30 s ומערבולת עבור 1 דקות. להכין "תערובת חרוזים עבודה" על ידי דילול מניות חרוז לריכוז הסופי של 50 חרוזים של כל סט/μL בתוך שיטת העבודה/שטיפת מאגר (PBS, 1% הסרום בימין). הוסף 50 μL של החרוזים מעורבים לכל באר בתחתית שטוח 96-באר (לוח חומרים).
      התראה: חרוזי הפלורסנט רגישים לאור. לכן, הם צריכים להיות מוגנים מפני חשיפה ממושכת לאור במהלך ההליך.
   4. דיאגרמת מיקום של רקעים, תקנים ודגימות בגליון עבודה של מפה טובה.
   5. הוסף 50 μL של מאגר התקן/לשטוף את כל הרקע היטב, ו 50 μL של כל תקן לבארות עבור העקומה הרגילה. טען 50 mL של כל מדגם מדולל לתוך הבארות המתאימות אחרון. לעטוף את הצלחת עם רדיד מנייר ו-דגירה עם עצבנות (~ 800 rpm) על שייקר צלחת עבור 30 דקות ב RT.
   6. מניחים את הצלחת על מגנט כף יד (טבלה של חומרים) ולהניח את הצלחת על המגנט של ~ 60 s כדי לאפשר הגדרה מלאה של חרוזים מגנטיים. הסירו את התוכן היטב בעזרת היין העדין של הצלחת ולוחית ההקשה על רפידות ספיגה כדי להסיר נוזל שיורית.
   7. לשטוף את הצלחת על ידי הסרת אותו מן המגנט, על ידי הוספת 200 μL של שיטת החישוב/לשטוף מאגר, על ידי טלטול עבור ~ 30 s, ולבסוף על ידי הצמדת אותו מחדש למגנט. חזור על כביסה 3x.
   8. לדלל את נוגדן זיהוי biotinylated, כלומר, ביוטין התווית נוגדן העלה נגד מינים מארחים חלבון, כדי 4 μg/mL בתוך מאגר בדיקות/לשטוף. הוסף 50 μL של נוגדן לזיהוי מדולל לכל טוב. לכסות את הצלחת ו דגירה עבור 30 דקות ב-RT על שייקר צלחת ב ~ 800 rpm. הנח את הצלחת על המגנט וחזור על הצעדים 2.1.6 ו 2.1.7.
   9. לדלל את הפיקוארירין (PE)-streptavidin מצומנת (SAPE) עד 4 μg/mL בתוך מאגר הערכה/שטיפת. הוסף 50 μL של SAPE מדולל לכל טוב. לכסות את הצלחת ו דגירה עבור 30 דקות ב-RT על שייקר צלחת ב ~ 800 rpm. הנח את הצלחת על המגנט וחזור על הצעדים 2.1.6 ו 2.1.7.
   10. הסר את הצלחת מהמגנט והשהה מחדש את החרוזים ב-100 μL של מאגר השוטף. לקרוא בארות עם מכשיר לייזר כפול תזרים מבוסס איתור המאפשר זיהוי של הגודל של עוצמת הזריחה PE (FI).
       הערה: האות, למשל, FI, שנוצר פרופורציונלי על כמות אנטיגן היעד המצורפת למשטח של החרוזים.
   11. לייצא נתונים גולמיים וליצור עקומות סטנדרטיות על-ידי אות זיהוי גרפים מסוג FI לעומת ריכוזי חלבון סטנדרטיים. השתמש בעקומות הסטנדרטיות כדי לחשב את ריכוז האנליט (ות) בדגימות.
       הערה: אלבומין מבוטא ב-g/dL, ואילו חלבונים של עניין מבוטאים לידי ביטוי ב-mg/dL.

3. חישובי המדד הפנימי

1. ארגן ערכי ריכוז חלבונים בגיליון אלקטרוני ונתח את התוצאות על-ידי החלת הנוסחאות הבאות.
2. חישוב_שאלה:
   
   כאשר_{אלבומין} השדרתי והסרום_{אלבומין} הם ריכוזים של אלבומין מתאים בסרום ובדגימות שדרתי, בהתאמה.
3. חישוב_חלבוןQ:
   
   בו_חלבון שדרתי_וחלבון סרום הם ריכוזים של חלבון מטרה (s) בתאים ודגימות שדרתי, בהתאמה.
4. חשב את אינדקס החלבון:
   

תוצאות

זה ניסוי מייצג שנועד להשוות את הסינתזה הפנימי של IgG בשני מודלים מכרסמים רלוונטיים קלינית של טרשת נפוצה (MS): המושרה PLP_139-151הנגרמת אוטואימוניות Encephalomyelitis (R-השני) ואת כרונית מתקדמת, מורלין encephalomyelitis הנגרמת וירוס המושרה המחלה deמחלות (TMEV-IDD). R-הם מודל שימושי להבנת הישנות-MS, ואילו מודל TMEV-IDD תכו...

Discussion

שיטות כמותיים להערכת ריכוזי חלבון שדרתי מוגברת הם כלים שימושיים באפיון המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של ה-CN. עם זאת, מעבר לקוונפיקציה אמין של רמות חלבון שדרתי, הזיהוי של חלבונים מתוך שדרתי מחייב ביטוי של תוצאות המפלה בין שברים דם ומערכת התחתית של שדרתי. עם זאת, עד כה, כימות החלבון הנפוץ בשימוש ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL insulin syringe	BD	329650
1 mL syringe	BD	329622
25 gauge needle	BD	305122
3 mL syringe	BD	309582
30 gauge insulin needle	BD	305106
Absorbent pads	Any suitable brand
Acepromazine	Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer	BioRad	171020100	Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad	171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates	BioRad	171025001
Biotinilated detection antibody	Any suitable source		The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A4503
Buprenorphine hydrochloride	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
Capillary Tubes	Sutter Instrument	B100-75-10	OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL	VWR	20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL	VWR	87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL	VWR	87003-294
Chlorhexidine diacetate	Nolvasan	E004272
Disposable pipettes tips	Any suitable brand
Ear bars	KOPF Instruments	1921 or 1922
Ethanol	Kopter	V1001
Freezer	VWR	VWR32086A
Gauze	Medline	NON25212
Heating pad	Sunbeam		XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber	VETEQUIP
Isoflurane	Patterson Vet Supply Inc	NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed)	Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled)	BioRad		Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker	Southwest Scientific	SBT1500
Microretractors	Carfill Quality	ACD-010	Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel)	Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel	EMD Millipore	MGAMMAG-300K	Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit	Novus Biological	NBP2-60484	Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000060
Non-Sterile swabs	MediChoice	WOD1002	Need to be autoclaved for sterility
Oxygen	AIRGAS	OX USPEA
Pasteur Pippettes	Fisher	13-678-20A	5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen	Patterson Vet	8695G	P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin	BD Biosciences	554061
Pipetters	Eppendorf	Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	ALLEGRA X-12R
Scale	Uline	H2716
Scalpel	Feather	EF7281
Shaver	Harvard Apparatus	52-5204
Standard proteins	Any suitable source		The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument	KOPF Instruments	Model 900LS	Standard Accessories
Sterile 1 x PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
Sterile saline	Baxter	0338-0048-02	0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2)	Fine Science Tools	11271-30	Dumont
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14094-11	Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter	Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex	Fisher	02-215-414
Warming pad	Kent Scientific Corporation	RT-JR-20
Water Sonicator	Cole Parmer	EW-08895-01
Xylazine	Patterson Vet Supply Inc